Intoducción

La roya del tallo, causada por el hongo Puccinia graminis f. sp. Tritici, es una enfermedad que reduce el rendimiento del cultivo de trigo hasta en 70 % ^{(Pardey et al., 2016)}. En los últimos años, esta enfermedad ha aumentado su importancia por la presencia de la raza TTKSK (Ug99), debido a su virulencia para la mayoría de los genes de resistencia a la roya del tallo, incluido el gene Sr31 ^{(Pretorius et al., 2000}., ^{Singh et al., 2006)}. El reciente brote de roya del tallo en trigo cristalino en 2016 en Italia, causado por la raza TTRTF, que no está relacionada con el grupo Ug99, representa una seria amenaza para la producción de trigo harinero y trigo duro en el área mediterránea y otras áreas de producción de trigo ^{(Institut for Agroøkologi, 2017)}. Su importancia llamó la atención de los científicos, debido al resurgimiento de la roya del tallo en algunos países europeos, incluidos el Reino Unido, Alemania e Italia ^{(Bhattacharya, 2017}; ^{Lewis et al., 2018}; ^{Saunders et al., 2019)}. El control químico de esta enfermedad es costoso y de alto riesgo ambiental para los humanos; es por ello, que el uso de variedades resistentes es la forma más económica y ecológica de controlar la enfermedad ^{(Singh et al., 2016)}. Por lo tanto, el mejoramiento para incorporar resistencia a la roya del tallo es una tarea continua en la mayoría de los programas de mejoramiento de trigo en todo el mundo, incluido el programa de mejoramiento del CIMMYT ^{(Singh et al., 2016)}.

La liberación de variedades con resistencia monogénica combinada con la ganancia en virulencia para este tipo de genes, por la coevolución del patógeno causante de la roya, reduce simultáneamente la vida de estas variedades en los campos de los agricultores ^{(Singh et al., 2006}; 2015). El método convencional de mejoramiento genético del trigo se basa en la incorporación de un solo gen de resistencia dentro de un genotipo; sin embargo, la combinación de varios genes de resistencia a razas diferentes de P. graminis, donde cada uno confiere una eficacia parcial o total, proporcionará una resistencia más duradera y estable ^{(Singh et al., 2016)}.

Los parientes silvestres del trigo poseen genes de resistencia útiles para combatir enfermedades como la roya. Existen más de ٨٠ genes de resistencia a la roya del tallo; de éstos, al menos 20 provienen de parientes silvestres, han sido transferidos al trigo cultivado ^{(Mclntosh et al., 1995}; ^{Mondal et al., 2016)}. En su mayor parte, los genes Sr se caracterizan por las reacciones de las plántulas a la raza TTKSK ^{(Pretorius et al., 2000}; ^{Singh et al., 2006}; ^{Wanyera et al., 2006)}. Los genes de resistencia a la roya del tallo Sr2, 13, 14, 15, 22, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57 y 58 siguen siendo efectivos contra Ug99 ^{(Singh et al., 2015)}; por lo tanto, la caracterización e introgresión de estos genes de resistencia en variedades de alto potencial de rendimiento es una alternativa para mejorar la resistencia a Ug99 y otras razas importantes de roya del tallo en las principales áreas productoras de trigo del mundo.

La adopción de herramientas moleculares como complemento al enfoque convencional de mejoramiento de cultivos puede facilitar la selección de genotipos resistentes, especialmente si se utiliza el enfoque de piramidar genes, lo cual no es posible detectar en invernadero o en campo. La selección asistida por marcadores permite una detección rápida y eficaz de un gen de resistencia a la roya del tallo utilizando loci de rasgos cualitativos (QTL).

Cirno C2008 es la variedad de trigo duro cultivado predominante en el noroeste de México desde 2011. Tiene un potencial de rendimiento muy alto, de 7.7 a 12.0 t ha^-1, desde 1950 ninguna otra variedad con atributos agronómicos sobresalientes se ha obtenido ^{(Muñoz, 2014)}. Cirno C2008 es resistente a las razas de roya del tallo RTR que existen en México y también a Ug99, pero se ha informado que es susceptible a la raza de Sicilia (TTTFT) en el sur de España ^{(Aoun et al., 2019)}.

El gen Sr47 de resistencia se derivó de la línea de adición PI 369590 del pariente silvestre Aegilops speltoides, y se transfirió al trigo cultivado mediante recombinación homóloga inducida por ph1b en la línea DAS15 de trigo duro. El segmento de introgresión se localiza en el cromosoma T2BL-2SL-2SS. El telómero de 2BL comprende por lo menos el 10 % del brazo largo ^{(Faris et al., 2008)}. Se sabe que el segmento de A. speltoides contiene los genes de resistencia Sr39 y Sr9. El gen Sr9 pasó a llamarse Sr47 ^{(Klindworth et al., 2012)} y es muy efectivo contra la raza TTKSK de roya del tallo ^{(Faris et al., 2008)} y RTR en México (ver los resultados de este estudio), de ahí la importancia de la introgresión de Sr47 en Cirno C2008. ^{Klindworth et al. (2012)} desarrollaron tres líneas recombinantes sintéticas: RWG35, RWG36 y RWG37. Como cada línea posee el gen Sr47 en diferentes puntos de translocación, es recomendable utilizar diferentes marcadores moleculares para detectar su presencia. En el presente estudio el objetivo fue llevar a cabo la introgresión del gen de resistencia Sr47 en la variedad Cirno C2008 utilizando selección asistida por marcadores.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

La concentración promedio de ADN fue de 430 ng mL^-1, y su pureza fue de 1.87 de acuerdo con la relación A260/A280, indicando que el ADN extraído tuvo buena calidad e integridad ^{(Tapia-Tussell et al., 2006}; ^{Valadez y Khal, 2005)}, considerándose un intervalo aceptable de 1.8 a 2.0.

Con los marcadores dominantes (Xwms501 y Xgwm47) fue posible distinguir familias sin la inserción del gen Sr47. Con el marcador dominante Xwms501 se realizó la amplificación de una banda de 109 pares de bases (pb) en aquellas plantas donde fue posible identificar la inserción del gen Sr47 (Figura 1); sin embargo, con el marcador dominante Xgwm47 (en repulsión) se muestran dos bandas de 165 pb en aquellas familias sin el gen Sr47 (Figura 1); Xgwm47 y Xwms501 son marcadores complementarios para verificar la presencia del gen Sr47. Estos resultados concuerdan con los presentados por ^{Faris et al. (2008)} y ^{Klindworth et al. (2012)}, quienes obtuvieron las mismas amplificaciones de los marcadores Xwms501 y Xgwm47, pero el comportamiento del gen Sr47 fue diferente entre genotipos, ya que el gen Sr47 puede translocarse en diferentes regiones, por lo que es indispensable considerar varios marcadores debido a que todos tienen algunas limitaciones ^{(Klindworth et al., 2017}; ^{Yu et al., 2015)}; sin embargo, ^{Klindworth et al. (2012)} propusieron los controles Sr47-1, Sr47-2 y Sr47-3 (RWG35, RWG36 y RWG37) para diferenciar plantas o familias portadoras del gen Sr47. En este estudio, se utilizó Sr47-1 como control resistente.

Figura 1 Patrón de bandeo de los marcadores Xwms501, Xgwm47, Xrwgs38 y Xgpw4165 en 22 familias de la población BC₁F₃. El marcador Xwms501 amplificó una banda de 109 pb en familias que portan el gen. Con el marcador de repulsión dominante (Xgwm47), las familias sin el gen tuvieron dos bandas de 165 pb. Usando Xrwgs38 y Xgpw4165 se logra la diferenciación y las plantas heterocigóticas y homocigóticas muestran la presencia de bandas ubicadas en 194 y 120 pb, respectivamente. 

La amplificación de polimorfismos en marcadores codominantes se reportó en Xgpw4165 y Xrwgs38 ^{(Klindworth et al., 2017}; ^{Yu et al., 2015)}, lo que permitió la discriminación de plantas heterocigóticas y homocigóticas. Tal como lo mencionan ^{Klindworth et al. (2012)}, es complicado diferenciar plantas heterocigóticas de las homocigóticas dominantes, en este caso se tomó como referencia a los controles Cirno C2008 y Sr47-1. La Figura 1 muestra que con el marcador Xrwgs38 las plantas presentaron dos bandas, una de 187 y otra de 175 pb para las plantas heterocigóticas, estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{Klindworth et al. (2017)}; por otra parte, coincide que el porcentaje de plantas homocigóticas es muy bajo o nulo; sin embargo, en este estudio se lograron obtener plantas homocigóticas dominantes. En estudios previos, utilizando como control a DAS15, se encontraron resultados similares ^{(Faris et al., 2008}; ^{Klindworth et al., 2012}; ²⁰¹⁷; ^{Yu et al.,2015)}; las plantas a las cuales se logró insertar el gen Sr47 presentaron una banda de 187 pb, tal como se puede observar en la Figura 2. El marcador polimórfico Xgpw4165 amplificó una banda de 120 pb ligada al gen Sr47, en este estudio se usó como referencia para la diferenciación de familias heterocigóticas y homocigóticas y se tomó como control Sr47-1 (Figura 1).

Figura 2 Amplificación del marcador molecular Xrwgs38 en familias de la población BC₁F₃. Se observa la amplificación en la familia 130 de la banda de 187 pb, tal como se reporta en DAS15. 

Con los cuatro marcadores fue posible separar familias homocigóticas con el gen Sr47, tal fue el caso de las familias 1, 3, 8, 12 y 14 que presentaban una banda de 109 pb para el marcador Xwms501 y para Xgwm47 la ausencia de bandas; no obstante, con el marcador Xgpw4165 no se presentó la banda de 120 pb, estos resultados se obtuvieron tomando como referencia los controles Cirno C2008 y Sr47-1.

Considerando los avances que se tienen y la perfección de los marcadores moleculares, en específico con el marcador Xrwgs38, las familias que poseen el gen presentan las dos bandas (Figura 1) y sólo la familia 131 es homocigótica dominante al presentar sólo la banda de 187 pb. Las familias homocigóticas sin el gen Sr47 (2, 5, 7, 9, 10, 13, 15, 17, 18, 19 y 21) sólo amplificaron para Xgwm47 las dos bandas situadas en los marcadores dominantes de 165 pb y la banda Xgpw4165 de 120 pb, pero no mostraron presencia de la banda del marcador Xrwgs38 de 194 pb (Figura 1). Las bandas heterocigóticas en las familias 4, 6, 11, 16, 20 y 22 se mostraron con los marcadores Xwms501 (banda de 109 pb) y Xgpw4165 (banda de 120 pb), pero no con Xgwm47 (ausencia de las bandas de 165 pb).

Los marcadores Xwmc627 y Xwmc332 no presentaron amplificaciones estables al utilizar los programas SSR, por lo que no ayudaron a diferenciar la variación genética entre las familias BC₁F₃. ^{Klindworth et al. (2017)} mencionaron que estos marcadores pueden ser afectados por múltiples factores, y que a mayor número de ciclos se amplifican otras bandas, por lo que no fueron considerados en el presente estudio.

Análisis de resistencia de plántulas

Este análisis mostró que las 141 familias inoculadas y los progenitores (Cirno C2008 y IIA.2342) fueron resistentes a la raza RTR, de acuerdo con la escala 0-4 ^{(Stakman et al., 1962)}. Las plantas resistentes mostraron infección tipo 0 (sin presencia de uredinias), Fleck ‘;’ (manchas cloróticas o necróticas sin presencia de uredinias) y 1 (uredinias pequeñas rodeadas de necrosis) (Figuras 3A, B y C), mientras que el testigo susceptible Noio presentó una infección tipo 4 (uredinias grandes sin clorosis) (Figura 3D). La ausencia de familias susceptibles en este estudio indica que la composición genética de los dos progenitores comparte factores similares de resistencia; en este sentido, ^{Singh (1991)} informó que la raza RTR es avirulenta para Sr9e, y lo más probable es que tanto DAS15 como Cirno C2008 puedan llevar Sr9e. Por otro lado, se sabe que, por ejemplo, Langdon porta Sr9e ^{)Luig, 1983)}, pero también podría portar Sr13 de uno de sus padres, Khapli (Langdon = Ld 194/Khapli//Ld 308/3/Stewart). La línea derivada de DAS15 utilizada en el estudio tiene como pedigrí: LDN5D(5B)/PI369590//LDN/3/LDN5D(5B)/4/3*47-1/5/CSph1b/2*LDN//2*47- 6/1/47-1. La línea de trigo duro 47-1 es altamente susceptible a la mayoría de las razas de roya del tallo. Langdon (LDN) y LDN 5D (5B) es una translocación monosómica de Langdon y Langdon del cromosoma 5B en el tetraploide para un 5D proveniente del fondo hexaploide. La presencia de Sr9e o Sr13 en ambos padres ayudará a explicar la falta de segregación o la ausencia de familias susceptibles en el retrocruzamiento. La presencia de Sr13 en las líneas derivadas de DAS15 RWG35, RWG36 y RWG37 ^{(Klindworth et al., 2017)} no se descartó por completo, ya que sólo en la cruza Joppa × 3/RWG36 los autores pudieron identificar una familia susceptible, pero ésta era heterocigótica para ambos genes de resistencia (Sr47sr47 y Sr13sr13) basado en los marcadores moleculares. Las cruzas Joppa × 3/RWG35 y Joppa × 3/RWG37 no segregaron familias susceptibles ^{(Klindworth et al., 2017)}. Joppa es positivo para el gen de resistencia Sr13 ^{(Klindworth et al., 2017)} y el marcador molecular asociado con Sr13 ^{(Klindworth et al., 2012}; ^{Simons et al., 2011}; ^{Zhang et al., 2017)}.

Figura 3 Signos de infección y reacción a la raza RTR de P. graminis f. sp. tritici en familias BC₁F₃ inoculadas. Las plantas resistentes mostraron tipos de infección (IT): 0 (A), Fleck (B) y 1 (C). Noio mostró la infección susceptible tipo 4 (D). 

Para los genes que confieren un alto nivel de resistencia como Sr26, Sr35, Sr36, Sr39 y Sr47 ^{(Jin et al., 2007)}, la selección se puede realizar basándose únicamente en el fenotipo si no hay múltiples genes Sr segregando en la población. Para cruzas en las que los genes únicos confieren resistencia parcial o de planta adulta, como Sr2, Sr55, Sr56, Sr57 y Sr58 ^{(Bansal et al., 2014}; ^{Herrera-Foessel et al., 2014}; ^{Singh et al., 2012}; ²⁰¹³; ^{Spielmeyer et al., 2003)} o Sr47, como en el presente estudio, es difícil hacer selecciones sin asistencia de marcadores moleculares y cuando ambos progenitores son resistentes a las razas de la roya del tallo utilizadas, independientemente del número de factores de resistencia. La selección sin marcadores también es difícil si múltiples genes se están segregando en la población. Por lo tanto, el desarrollo de marcadores de diagnóstico o estrechamente vinculados con los genes Sr efectivos a Ug99, RTR y la raza identificada en Sicilia (TTTFT) es esencial para desarrollar cultivares de trigo con resistencia a la roya del tallo utilizando una estrategia de piramidación de genes en los programas de mejoramiento; en otras palabras, todas las progenies resultantes del cruce parental derivado de DAS15 con Cirno C2008 fueron resistentes a la raza RTR y las que portaban el gen Sr47 no pudieron identificarse sin los marcadores moleculares; sin embargo, en las pruebas realizadas en el sur de España con la raza TTTFT, Cirno C2008 fue susceptible y los portadores Cirno C2008+Sr47, así como las líneas RWG35, RWG36 y RWG37, utilizadas como controles, fueron resistentes (Solis; Com. Pers.)¹.

Existe la posibilidad de que Sr13 no esté presente en algunas de las líneas derivadas de Sr47, pero no se llevó a cabo una prueba molecular para identificar estas líneas. El gen Sr47, ahora presente en Cirno C2008+Sr47, debe combinarse con otros genes efectivos de resistencia a la roya del tallo que tengan marcadores moleculares disponibles para asegurar una resistencia duradera a la roya del tallo en el trigo cristalino.

Conclusiones

Las 141 familias derivadas de la cruza DAS15/2 × Cirno C2008 fueron resistentes a la raza RTR en México. Con el análisis de las 141 familias BC₁F₃, basado en los marcadores Xwms501, Xgwm47, Xrwgs38 y Xgpw4165, se identificó la inserción del gen Sr47 en 63 familias en estado heterocigótico y una familia homocigótica de la cruza DAS15/2 × Cirno C2008. El gen Sr47 confiere un alto nivel y amplio espectro de resistencia a la roya del tallo y Cirno C2008 un alto potencial de rendimiento. La inclusión de Cirno+Sr47, sería de gran utilidad en los esfuerzos para el control de la roya del tallo en México, así como de otras razas de roya del tallo, nuevas y reemergentes a nivel mundial.