Microorganismos

La cepa de Metarhizium anisopliae M20-CIDSM01 fue proporcionada por el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Sinaloa (GenBank KR998522) y la cepa de Fusarium oxysporum aislada de plántulas de C. chinense Jacq. ambas cepas se reactivaron en agar papa dextrosa.

Material vegetal

Las semillas de chile habanero fueron colectadas de frutos de un cultivo ubicado en Conkal, Yucatán.

Preparación de encapsulados de Metarhizium anisopliae

La formación de encapsulados de esporas de M. anisopliae en alginato se realizó por gelificación iónica siguiendo la metodología propuesta por ^{Meirelles et al. (2023)} con algunas modificaciones. Se preparó una suspensión de esporas de M. anisopliae a partir de un cultivo en caldo Czapek y se ajustó a una concentración de 1×10⁷ esporas mL^-1, que se mezcló con una solución de alginato de sodio al 4% (p/v) estéril en proporción 1:10. La mezcla homogénea se adicionó por goteo, empleando jeringas con diámetro interno del pivote de 1.2 y 1.5 mm, en soluciones de cloruro de calcio 0.5 M y 1 M durante 30 min en agitación a 7 rpm. Se obtuvieron encapsulados de 3000 µm y 2000 µm (, las cuales se filtraron en papel filtro #1 (Whatman) y se lavaron con agua destilada estéril. Finalmente, fueron secados en un horno a 30 ºC durante 48 horas.

Humedad

El contenido de humedad de los encapsulados de M. anisopliae tras culminar el proceso de encapsulación se analizó por gravimetría (^{Tu, He, Yang, Wu y Yi, 2015}). En una cápsula previamente tarada se depositó 1 g de encapsulados y se midió la masa en conjunto (m1), se llevó a una estufa y se mantuvo a 40°C por 3 h; posteriormente, se dejó enfriar en un desecador y se midió la masa (m2). El porcentaje de humedad se calculó con la siguiente fórmula:

Hinchamiento

Después del proceso de secado en la preparación de encapsulados, se tomaron muestras de 50 unidades de cada uno de los encapsulados y se midió la masa (g) para cada tratamiento (Md). Se sumergieron en una solución buffer de fosfatos a pH 7.0 durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo, las muestras se filtraron y se secaron con papel filtro para retirar el agua superficial; posteriormente se determinó la masa final (Ms) (^{Raj-Singh, Woolfson y Donnelly, 2010}). El hinchamiento expresado en porcentaje se calculó con la siguiente fórmula (^{Malektaj, Drozdov y deClaville, 2023}):

Supervivencia y viabilidad

Los encapsulados de esporas de M. anisopliae se depositaron en recipientes de vidrio sellados que se mantuvieron a 37 °C por un periodo de tres meses, durante el cual se realizaron muestreos de los encapsulados a los 15, 30, 45, 60, 75 y 90 días para determinar el número de esporas viables. Para ello, se adicionó 1 g de cada encapsulado en 10 mL de una solución de citrato de sodio al 2% (p/v) con 0.01% de Tween, se depositaron 50 μL de la suspensión de esporas en cajas Petri de 6 mm Æ, y se les agregó 10 mL de agar papa dextrosa. Transcurridas 48 h de incubación a 28°C, se realizó la cuenta en placa adaptado de ^{Baldiviezo, Nieva, Pedrini y Marino (2023)}. El porcentaje de viabilidad se determinó con la fórmula:

Donde Nd, corresponde al número de unidades formadoras de colonias por gramo de encapsulado obtenido de cada muestra y N es el número de unidades formadoras de colonias obtenidas en el tiempo cero expresadas en UFC g^-1 que corresponde a la supervivencia de las esporas al proceso de encapsulación.

Prueba de antagonismo in vitro

Se analizó la actividad antagónica de los encapsulados de esporas de M. anisopliae contra F. oxysporum, mediante confrontación dual (^{Yadav, Adhikari, Kim, Kim y Lee, 2021}), para lo cual se depositó en un extremo de la caja Petri con medio agar Czapek 1 g de encapsulados y en el extremo equidistante se inoculó con un disco micelial de ( 5 mm de la cepa de F. oxysporum. Las cajas se incubaron 28 °C ± 2 °C, y cada 24 horas durante ocho días se midió el radio de crecimiento de Fusarium (R2). Como control negativo (R1), se inoculó a Fusarium únicamente en el extremo de la caja Petri. También se analizó la capacidad antagónica de esporas sin encapsular de M. anisopliae, utilizando un disco micelial de ( 5 mm del entomopatógeno y se depositó en un extremo de la caja siguiendo el mismo proceso de los encapsulados. El efecto antagónico se calculó mediante la inhibición del crecimiento radial (ICR) expresado en porcentaje con la siguiente fórmula:

El efecto de las esporas encapsuladas y esporas en disco de M. anisopliae sobre la esporulación de F. oxysporum se realizó mediante cuenta directa en cámara de Neubauer. Transcurridos 12 días de iniciada la confrontación, se obtuvieron de cada unidad experimental de los diferentes tratamientos evaluados 10 discos de micelio de Fusarium ( 6 mm que se depositaron en tubos de ensaye con 9 mL de agua destilada estéril adicionado con 0.05% de Tween 80, los tubos se agitaron por 60 s para desprender las esporas y se calculó el porcentaje de Inhibición de Esporulación (IE) usando la fórmula:

Donde E1= cantidad de esporas de F. oxysporum provenientes del tratamiento R1 y E2 = cantidad de esporas de F. oxysporum provenientes de los diferentes tratamientos de confrontación.

Experimento en invernadero

Se aplicó un diseño experimental en bloques completamente al azar y se evaluaron siete tratamientos con seis réplicas: T1 = control (agua destilada); T2 = control químico (fungicida Mancozeb); T3 = M. anisopliae libre; T4 = M. anisopliae libre + F. oxysporum; T5 = F. oxysporum; T6 = encapsulados; T7 = encapsulados + F. oxysporum, se germinaron plántulas de chile habanero criollo (C. chinense Jacq.) en semilleros que contenían una mezcla de tierra negra y Peat moss (3:1 p/p), 30 días después de la germinación se trasplantaron a bolsas de vivero con capacidad para 5 kg de sustrato, los tratamientos T3 y T4 se inocularon el día del trasplante con la suspensión de M. anisopliae (20 mL a 1×10⁷ esporas mL^-1), mientras que a los tratamientos T6 y T7 se les colocó 20 g de encapsulados en el suelo a una profundidad de 10 cm junto a la rizosfera de las plantas. Siete días después del trasplante se aplicó la suspensión de F. oxysporum en los tratamientos T4, T5 y T7 (20 mL a 1×10⁷ esporas mL^-1) en la base del tallo. Durante el desarrollo del experimento (54 días) se realizaron mediciones de altura de planta (cm), longitud de raíz (cm), diámetro de tallo (cm), número de frutos y contenido de clorofila (unidades SPAD).

Análisis estadístico

Se determinó el valor promedio de los datos obtenidos de cada uno de los experimentos realizados y se realizó un análisis de varianza simple, seguida de una prueba de rangos múltiples de Tukey con un nivel de confianza del 95%, empleando el programa estadístico Statgraphics Centurion XVI (^{Statgraphics Technologies, 2009}).

Caracterización de los encapsulados de esporas de M. anisopliae

La apariencia de los encapsulados fue de textura lisa sin poros visibles, color blanco, ligeramente húmedas y predominantemente esféricas (Figura 1), con diámetros de 3000 y 2000 µm, calculados por frecuencia relativa con N=100. Se agruparon en cuatro tipos que se denominaron CEM1 (3000 µm (, 0.5 M CaCl₂), CEM2 (3000 µm (, 1 M CaCl₂), CEM3 (2000 µm (, 0.5 M CaCl₂) y CEM4 (2000 µm (, 1 M CaCl₂).

Figura 1: Encapsulados de esporas de M. anisopliae en alginato por gelificación iónica. A = microcápsulas de 2000 µm; B = microcápsulas de 3000 µm.  

Figure 1: Encapsulated of M. anisopliae spores in alginate by ionic gelation. A = 2000 µm microcapsules; B = 3000 µm microcapsules. 

En el Cuadro 1, se observa que no hubo diferencia estadística significativa en el porcentaje de humedad de los encapsulados después de la etapa de secado incluida en la preparación, se obtuvieron valores entre 42 y 52% de humedad. Por otro lado, la capacidad de hinchamiento nos indica la afinidad de la matriz polimérica de interactuar con las moléculas de agua y al respecto el análisis de los datos indicó que si hay diferencia estadística significativa entre los encapsulados de M. anisopliae, CEM3 presentó el valor más alto con 55.1±1.7% de hinchamiento, ya que su concentración de cloruro de calcio es baja y generó una red menos estable con el alginato, mientras CEM2 y CEM4 que se reticularon con una solución de CaCl₂ 1M mostraron menor capacidad de retención de agua, lo que se explica conforme a lo expuesto por ^{Savić-Gajić, Savić, y Svirčev (2023)}, quienes indicaron que a mayor concentración de iones Ca²⁺ se presenta una mayor reticulación de las cadenas de alginato modificando la densidad de la red y por tanto la matriz es menos permeable, por lo tanto los encapsulados con menor hinchamiento permitieron una liberación lenta de las esporas prolongando su actividad biológica.

Eficiencia de la encapsulación de esporas de M. anisopliae

En la Figura 2A, se presenta la concentración de esporas que sobrevivieron a las condiciones de preparación del encapsulado y se observa que CEM2 mantuvo la mayor concentración con 9.6×10⁶ UFC g^-1 que corresponde al 96% del contenido de esporas en la mezcla inicial, seguido de CEM4 con 81%. Cabe destacar que tanto CEM2 como CEM4 mostraron menor hinchamiento y menor permeabilidad de la matriz debido a su alta concentración de cloruro de calcio.

Figura 2: Eficiencia del proceso de encapsulación de esporas de M. anisopliae. A = supervivencia de las esporas expresados en UFC g^-1; B = porcentaje de viabilidad de las esporas encapsuladas durante el almacenamiento. 

Figure 2: Efficiency of the M. anisopliae spore encapsulation process. A = spore survival expressed in UFC g^-1; B = percent viability of encapsulated spores during storage. 

^{Fu y Chen (2011)} reportaron que al almacenar conidios de M. anisopliae a 37 ºC se afecta negativamente su viabilidad, por lo que se analizó la capacidad de protección de la matriz polimérica alginato-calcio durante 90 días; los datos de viabilidad se presentan en la Figura 2B y se observa que los valores obtenidos a los 15 días de almacenamiento no mostraron diferencias estadísticas significativas (P ≤ 0.05), pero a partir del muestreo del día 30 hasta concluir el periodo de almacenamiento, se observó que los porcentajes de viabilidad de CEM2 tuvieron diferencias estadísticas significativas con los demás encapsulados, esto se atribuyó a la mayor concentración de iones Ca²⁺ en la matriz (1 M CaCl₂), lo que evitó que las esporas tuvieran exposición a los factores ambientales, manteniendo la viabilidad por arriba del 92%, mientras CEM1 y CEM3 con menor concentración de iones Ca²⁺ (0.5 M CaCl₂), presentaron una reducción significativa en la viabilidad de 58.5±7.3 y 63.9±5.6% respectivamente a los 90 días de almacenamiento. Debido a que durante la preparación de la encapsulación, las esporas no son expuestas a temperaturas elevadas, son mínimas las afectaciones que se provocan a la integridad y funcionamiento de las esporas. Aun en condiciones limitadas de nutrientes, los componentes de la matriz polimérica contribuyen significativamente a la retención de esporas (^{Rahman et al., 2024}), dado que la viscosidad del alginato genera mayor cohesión y el calcio regula el funcionamiento de proteínas fosfatasas como la calcineurina que modula la respuesta a estrés, la morfogénesis y homeostasis de iones (^{Fox y Heitman, 2002}), además de inducir la formación de conidios (^{Juvvadi, Lamoth y Steinbach, 2014}).

Actividad antagonista in vitro de los encapsulados sobre F. oxysporum

El análisis estadístico (P ≤ 0.05), de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial (ICR) de F. oxysporum en presencia de los diferentes encapsulados de M. anisopliae (CEM) que se muestran en el Cuadro 2, indica que sí hay diferencias significativas en los datos obtenidos de ICR, siendo los mayores porcentajes la muestra de encapsulado CEM2 con 62.98±3.43% y la aplicación del disco micelial del entomopatógeno (DME), con 63.57±3.27% de ICR. En esta prueba de antagonismo, la forma y el tamaño de los encapsulados influyen en la actividad antagonista, ya que a mayor diámetro de las microcápsulas de forma esférica es mayor el área superficial para la liberación de esporas. Así también la concentración de iones Ca²⁺ influye directamente en la reducción significativa del crecimiento micelial de los hongos (^{Boumaaza, Benkhelifa y Belkhoudja, 2015}). Debido a que la esporulación es importante para la propagación e infección de las especies de Fusarium, se analizó el efecto de los encapsulados sobre la inhibición de esporulación (IE) y no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre las muestras analizadas. Cabe destacar que los valores obtenidos de IE que se encuentran entre 50-65% son relevantes para el control de Fusarium debido a que, como han reportado ^{Ajmal, Hussain, Ali, Chen y Lin (2022)} al reducir el crecimiento micelial de este patógeno se induce su esporulación como mecanismo de supervivencia, por lo que es relevante que el antagonista tenga la capacidad de inhibir tanto el crecimiento como la esporulación del patógeno.

Potencial antifúngico in vivo de los encapsulados sobre F. oxysporum.

Debido a la viabilidad y capacidad de inhibición in vitro del encapsulado CEM2, se eligió aplicarlo en el experimento in vivo, como pretratamiento para el control de F. oxysporum en plantas de chile. En el Cuadro 3 se presentan los datos obtenidos del efecto de la aplicación de una suspensión de esporas libres de M. anisopliae (T4) y del encapsulado CEM2 (T7) sobre parámetros morfológicos y fisiológicos de plantas de chile infectadas con Fusarium. El análisis ANOVA reveló que los efectos provocados de la inoculación con F. oxysporum sobre la altura de planta, diámetro de tallo y número de frutos por planta, a los 54 días después de la inoculación, se redujeron significativamente con la aplicación de M. anisopliae (T4 y T7) en comparación con el tratamiento T5 inoculado únicamente con F. oxysporum. La altura fue de 44 cm con el tratamiento T5, mientras que las plantas con los tratamientos T4 y T7 alcanzaron 75.33 y 77.67 cm, respectivamente. Mientras que el valor del diámetro de tallo se duplicó con T4 y T7, alcanzando 0.64 y 0.58 cm respectivamente, cabe destacar que con ambos tratamientos se obtuvo mayor producción de frutos por planta. La aplicación de CEM2 en el tratamiento T6, plantas sin patógeno, elevó el contenido de clorofila a 11.08 SPAD, que refleja una mayor asimilación de nutrientes y, por consiguiente, un mejor crecimiento, superando hasta un 30% la altura del tratamiento T1, plantas sanas sin inocular.

Lo anterior comprueba que las esporas de M. anisopliae libres o encapsuladas son útiles para reducir el efecto de la presencia de F. oxysporum en el crecimiento de las plantas de chile, debido a que este entomopatógeno posee mecanismos enzimáticos que le permiten colonizar las raíces de las plantas, mejorando así el crecimiento de su huésped y actuando como antagonista de patógenos (^{Sarven et al., 2020}). Cabe resaltar que la matriz polimérica semipermeable utilizada para la encapsulación de M. anisopliae reduce la pérdida de agua y solutos, permitiendo el equilibrio de gases y controlando cambios bioquímicos, de tal manera que no reduzca su efectividad por la exposición a factores ambientales como temperatura y humedad, además de mantener su viabilidad en almacenamiento.