Material vegetal y mantenimiento

Vitro plantas de Coffea arabica obtenidas mediante la exposición de callo embriogénico a una dosis de 140 mM de metanosulfonato de etilo (MSE) y plantas no tratadas fueron proporcionadas por el banco de germoplasma del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez. Las vitro plantas fueron mantenidas mediante subcultivos en medio de cultivo MS (^{Murashige y Skoog, 1962}) al 100% adicionado con 30 g L^-1 de sacarosa, 100 mg L^-1 de L-Cisteína (Sigma Aldrich^®, Alemania), 0.3 mg L^-1 de 6-Bencilaminopurina (BAP) (Sigma Aldrich^®, Alemania), 2.5 g de Fitagel (Sigma Aldrich^®, Alemania) como agente gelificante, el pH del medio fue ajustado a 5.7±0.1 con una solución de NaOH al 1 N (^{Joya-Dávila et al., 2023}). El periodo de cultivo fue de dos meses, realizando subcultivos periódicos cada 15 días. El material vegetal se conservó en una cámara bioclimática a una temperatura de 25±2 °C, con un fotoperiodo de 16 h a una intensidad lumínica de 35 micromoles por metro cuadrado por segundo.

Propagación

Las yemas se cultivaron en frascos de vidrio que contenían 20 mL de medio MS descrito anteriormente, suplementado con las concentraciones de BAP correspondientes. El cultivo se mantuvo durante 45 días en las condiciones antes mencionadas. Transcurrido este periodo, se contabilizaron los brotes obtenidos por cada unidad experimental. Para evaluar el efecto de BAP en la formación de brotes a partir de yemas apicales, se utilizó un diseño multifactorial 2 × 3. El primer factor fue el tipo de planta, con dos niveles que fueron plantas mutagenizadas (140 mM de MSE) y plantas no mutagenizadas (0 mM de MSE). El segundo factor fue la concentración de BAP, con tres niveles que fueron 0, 3 y 6 mg L^-1. Cada unidad experimental incluyó una yema, y todos los tratamientos se realizaron con cuatro repeticiones cada uno.

Rizogénesis in vitro

Plántulas tratadas con 140 mM de MSE de 5 cm de altura fueron transferidas a medio MS al 50%, de sales suplementado con 15 g L^-1 de sacarosa, 100 mg L^-1 de L-Cisteína, los reguladores de crecimiento ANA (Sigma Aldrich^®, Alemania) y AIB (Sigma Aldrich^®, Alemania) en las concentraciones correspondientes (Cuadro 1), 2.5 g L^-1 de Fitagel y pH ajustado a 5.7±0.1 con una solución de NaOH al 1 N. Las plántulas fueron mantenidas en condiciones de oscuridad durante 15 días en cámara bioclimática a 25±2 °C y posteriormente se expusieron a un fotoperiodo de 16 h luz (35 µmol m² s^-1) durante 45 días. Adicionalmente, se evaluó el comportamiento en un control conformado por plantas sin tratamiento mutagénico en medio MS basal al 50% de sales (CP) y plantas tratadas con 140 mM de MSE en medio MS basal al 50% de sales (CN). La variable de respuesta evaluada fue el porcentaje de inducción de raíces.

Análisis estadístico

Para la formación de brotes se midieron como variables de respuesta el número de brotes generados por cada unidad experimental a los 45 días por conteo manual. Los datos fueron analizados mediante un ANOVA multifactorial para cada factor general y mediante un ANOVA simple para las interacciones entre factores. Las medias se compararon con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) empleando el software Statgraphics Centurion XVI^® (^{Statgraphics, 2005}).

En la rizogénesis in vitro, en plantas mutagenizadas, se empleó un diseño de superficie de respuesta (3²) en el cual se evaluó el efecto del ácido indolbutírico (AIB) y el ácido naftalenacético (ANA) en concentraciones de 0.5, 1.75 y 3 mg L^-1 cada uno. Las variables de respuesta estudiadas en la rizogénesis in vitro fueron el porcentaje de formación de raíces por cada unidad experimental. Los datos fueron analizados mediante un modelo de superficie de respuesta 3² (dos factores en tres niveles cada uno) empleando el software estadístico Statgraphics Centurion XVI^® (^{Statgraphics, 2005}).

Aclimatación

La aclimatación se realizó en dos fases. Durante la fase uno, plántulas de entre 5 y 7 cm de altura y con seis hojas verdaderas fueron extraídas del medio de cultivo y se retiró por completo el medio restante en las raíces empleando una solución de NaClO comercial al 5% (v:v). Posteriormente, las plántulas fueron transferidas a charolas de aclimatación con dimensiones de 18 × 14 × 11 cm con 12 cavidades, colocando una planta por cavidad. El sustrato empleado consistió en una mezcla de PeatMost^® y Agrolita^® en proporción 1:1 (v:v). A cada planta se le suministró 10 mL de una solución acuosa de Raizal 400^® al 10% (p:v). Las charolas de aclimatación se mantuvieron en una cámara bioclimática bajo las condiciones de incubación antes descritas por un periodo de 30 días, aplicando irrigación por aspersión cada tercer día (^{Vallejos-Torres, Sánchez, García, Trigoso y Arévalo, 2019}).

En la segunda fase, las plantas fueron transferidas a contenedores de polietileno de 1 L de capacidad que contenían PeatMost^®, Agrolita^® y tierra negra en relación 1:1:1 (v:v:v) como sustrato y fueron colocadas en invernadero con exposición solar del 60% durante 30 días (Vallejo-Torres et al., 2019). Cada planta se fertilizó con 2 g de fósforo en forma de fosfato diamónico (DAP; 46% de P₂O₅) (^{Khalajabadi, 2008}).

Formación de brotes

A los 45 días de cultivo, se observó la formación de brotes en los tratamientos suplementados con 3 y 6 mg L^-1 de BAP. En concentración de 3 mg L^-1 de BAP, los brotes se formaron de manera lateral a partir del tallo que estaba en contacto con el medio de cultivo (Figura 1b), mientras que en concentraciones de 6 mg L^-1, se observó la formación de callo en la base de las yemas, a partir de la cual se generaron brotes que lograron desarrollarse (Figura 1c). En contraste, en el tratamiento control no se observó la formación de ninguna estructura en la base en contacto con el medio (Figura 1a). Este comportamiento es producto del efecto que tiene el BAP en los tejidos vegetales, ya que forma parte del grupo de reguladores de crecimiento vegetal del tipo citoquinina, las cuales son esenciales para controlar la respuesta a estímulos externos y son clave en numerosos procesos fisiológicos y de desarrollo (morfogénesis, organogénesis, formación de brotes) (^{Nehnevajova et al., 2019}), así como, el correcto flujo del ciclo celular, promoviendo así la división celular (^{Schaller, Street y Kieber, 2014}). Mientras tanto, a partir del reconocimiento de las citoquininas por parte de la célula, comienza una ruta de transducción de señales que desemboca en respuestas fisiológicas tales como la proliferación de brotes y raíces, generación de cúmulos de células indiferenciadas y diferenciación celular (^{Müller y Sheen, 2007}; ^{Zürcher and Müller, 2016}; ^{Jameson y Song, 2020}).

Figura 1: Brotes generados a partir de yemas apicales cultivadas en diferentes concentraciones de BAP. (a) = 0 mg L^-1; (b) = 3 mg L^-1; (c) = 6 mg L^-1. La escala en la barra corresponde a 1 centímetro.  

Figure 1: Shoots generated from apical buds cultured in different concentrations of BAP. (a) = 0 mg L^-1; (b) = 3 mg L^-1; (c) = 6 mg L^-1. The scale on the bar corresponds to 1 centimeter.  

En la variable número de brotes se observó que, a medida que aumentó la concentración de BAP en el medio, también incrementó el número de brotes generados, sin embargo, no hubo diferencia estadística significativa (P > 0.05) respecto al origen de los explantes. Por el contrario, las diferentes concentraciones de BAP mostraron diferencia estadística significativa (P ≤ 0.05) respecto al número de brotes, obteniendo una media de 5.1 brotes por explante en los tratamientos adicionados con 6 mg L^-1 de BAP (Cuadro 2).

Los resultados son correspondientes con lo obtenido por diversos grupos de trabajo, donde se reportan concentraciones cercanas a 6 mg L^-1 para la mayor formación de brotes mediante organogénesis directa en diversas variedades de Coffea arabica (^{Ebrahim, Shibli, Makhadmeh, Shatnawi y Abu-Ein, 2007}; ^{El Gawad, Mahdy y Boshra, 2012}; ^{Suliansyah, Resigia, Febjislami, Amanda y Rahimah, 2021}). De igual manera, ^{Suliansyah et al. (2021)}, indicaron que existen concentraciones mayores a 7 mg L^-1 que son perjudiciales para la formación de brotes, por lo que concentraciones entre 5 y 7 mg L^-1 son las óptimas para la obtención de esta respuesta morfogénica.

El comportamiento similar entre genotipos utilizados sugiere que el tratamiento con 140 mM de MSE no generó cambios en receptores que afectaran la sensibilidad a estímulos generados por reguladores de crecimiento del tipo citoquinina como el BAP. Efectos similares fueron observados por ^{Nehnevajova et al. (2019)}, en mutantes de Brassica napus. Sin embargo, en mutantes de Arabidopsis con mutaciones en múltiples genes de receptores de citoquininas (IPT) se encontró un bajo crecimiento del meristemo y baja proliferación de brotes (^{Werner y Schmülling, 2009}). Esto indica que la sensibilidad a citoquininas en mutantes puede variar respecto a la especie.

Rizogénesis in vitro

La rizogénesis in vitro se observó a los 45 días en plantas de Coffea arabica no mutagenizadas en medio de cultivo MS al 50% de sales, mientras que, las plantas mutagenizadas con dosis de 140 mM de MSE no presentaron desarrollo de raíces. Debido a ello, fue necesaria la adición de ANA y AIB al medio de cultivo para las plantas mutantes. En este sentido, después de 35 días se observó la formación de raíces en los tratamientos 2, 5, 6, 7 y 9 (Figura 2). En general, las plántulas generaron raíces amorfas, desdiferenciación celular previa a la formación de raíces, engrosamiento de la raíz principal y formación de raíces adventicias. La resistencia o insensibilidad a auxinas es un efecto documentado por diversos autores en el mutante Ibr5 de Arabidopsis, donde se ha reportado baja formación de raíces, insensibilidad a auxinas sintéticas y limitada taza de producción endógena de citoquininas (^{Monroe-Augustus, Zolman y Bartel, 2003}; ^{Strader et al., 2011}; ^{Emenecker et al., 2023}).

Figura 2: Formación de raíces en plantas de Coffea arabica. (a) y (b) Tratamiento control; (c) Tratamiento 2; (d) Tratamiento 5; (e) y (f) Tratamiento 6; (g) Tratamiento 7; (h) e (i) Tratamiento 9; La escala en la barra corresponde a 1 centímetro. 

Figure 2: Root formation in Coffea arabica plants. (a) and (b) Control treatment; (c) Treatment 2; (d) Treatment 5; (e) and (f) Treatment 6; (g) Treatment 7; (h) and (i) Treatment 9; The scale on the bar corresponds to 1 centimeter.  

La rizogénesis es una respuesta morfogénica normalmente mediada por hormonas del tipo auxina (^{Roychoudhry y Kepinski, 2022}). Esto se debe a la acumulación de auxinas en las células del ápice radicular generada por un gradiente de auxinas en la planta (^{Remy y Duque, 2014}), lo cual desencadena la activación de genes asociados a la formación y desarrollo de raíces y la desdiferenciación celular (^{Quint y Gray, 2006}). Así mismo, el transporte de auxinas genera acidificación en la pared celular y la ruptura de las microfibras de celulosa por activación de enzimas denominadas expansinas (^{Majda y Robert, 2018}). Esta ruptura genera que la pared se vuelva laxa y la célula sufra expansión, lo cual genera un alargamiento y engrosamiento en las estructuras radiculares. Un sistema radicular defectuoso también fue observado en mutantes de Arabidopsis con mutaciones en los genes ARR del tipo A, ARR7 y ARR15 donde estas mutaciones resultaron en una señalización ectópica de citoquinina, abolieron la expresión de genes que codifican células madre y causaron defectos severos en el patrón de la raíz (^{Riefler, Novak, Strnad y Schmülling, 2006}; ^{Müller y Sheen, 2008}). Esto último se atribuye a mutaciones que disminuyen la producción de citoquinina endógena, resultando en la inhibición de los reguladores del tipo B involucrados en la regulación de la elongación de la raíz (^{Argyros et al., 2008}; ^{Ishida, Yamashino, Yokoyama y Mizuno, 2008}; ^{Werner y Schmülling, 2009}).

Los resultados del análisis estadístico del modelo de superficie de respuesta donde se evaluó el efecto del ANA, AIB y las interacciones entre ambos factores indicaron que el efecto con mayor significancia estadística en la formación de raíces con P = 0.0047 fue el generado con AIB (Figura 3a). Dicho resultado se puede comprobar en el gráfico de efectos principales que muestra que el factor AIB tuvo mayor participación en la formación de raíces que ANA (Figura 3b). Además, se observó que las concentraciones óptimas para la obtención del mayor porcentaje de formación de raíces (83%) fue cuando ambos reguladores de crecimiento se encuentran en la concentración más alta; es decir, 3 mg L^-1 cada uno (Figura 3c).

Figura 3: Gráficos estadísticos generados por el diseño experimental de superficie de respuesta para evaluar el efecto de ANA y AIB sobre la rizogénesis in vitro en plantas mutagenizadas de Coffea arabica. (a) Gráfica de Pareto estandarizada del efecto del AIB y ANA; (b) Gráfico de efectos principales de AIB y ANA sobre el porcentaje de formación de raíces; (c) Gráfico de superficie de respuesta estimada del efecto relativo de AIB y ANA sobre el porcentaje de formación de raíces. 

Figure 3: Statistical graphs generated by the response surface experimental design to evaluate the effect of NAA and IBA on in vitro rhizogenesis in mutagenized Coffea arabica plants. (a) Standardized Pareto chart of the effect of IBA and NAA; (b) Main effects plot of IBA and NAA on the percentage of root formation; (c) Estimated response surface plot of the relative effect of IBA and NAA on the percentage of root formation. 

Se ha reportado que concentraciones mayores a 3 mg L^-1 de AIB han resultado ser efectivas en la inducción del mayor porcentaje de formación de raíces in vitro (^{Ebrahim et al., 2007}, ^{El Gawad et al., 2012}). Sin embargo, se ha demostrado que concentraciones similares de ANA (mayores a 3 mg L^-1) no inducen porcentajes elevados de formación de raíces, como indican Meherat et al. (2012). Además, la combinación de diversas auxinas promueve el crecimiento temprano de raíces y su desarrollo in vitro (^{Ahmed, Feyissa y Disasa, 2013}; ^{Dumaslan, Tad-awan y Manuel, 2023}), resultando efectiva la combinación entre ANA y AIB. No obstante, es probable que, para genotipos mutantes, como es el caso de los evaluados en este estudio, la concentración de hormonas deba ser elevada para suplir las deficiencias que puedan existir en receptores, vías de transducción de auxinas o desequilibrio en la homeostasis de auxinas (^{Werner y Schmülling, 2009}; ^{Rasmussen, Hosseini, Hajirezaei, Druege y Geelen, 2015}).

Aclimatación

Finalmente, después de la aclimatación, se obtuvo el 80% de supervivencia para plantas control y 70% para plantas mutagenizadas. La muerte de las plantas ocurrió en la primera etapa de la aclimatación, cuando estas fueron colocadas en sustrato orgánico. Durante esta etapa, también se observó la elongación de las raíces en la primera semana, así como elongación de entrenudos y crecimiento apical (Figura 4a). Una vez concluida esta fase, no se registró muerte de ningún ejemplar, y el crecimiento fue notable en todos los casos (Figura 4b).

Figura 4: Plantas de Coffea arabica en las diferentes fases de aclimatación. (a) Planta con una semana en condiciones ex vitro, la escala en la cara corresponde a 1 cm; (b) Planta de Coffea arabica con 45 días en condiciones ex vitro, la escala en la barra corresponde a 5 centímetros. 

Figure 4: Coffea arabica plants in different stages of acclimatization. (a) Plant with one week under ex vitro conditions, scale on the side corresponds to 1 cm; (b) Coffea arabica plant with 45 days under ex vitro conditions, scale on the bar corresponds to 5 centimeters. 

Resultados similares a los obtenidos en este estudio fueron reportados por ^{El Gawad et al. (2012)}, donde se indujo la supervivencia hasta el 71% empleando una mezcla de turba y agrolita en relación 1:1 (v:v). Es preciso señalar que, en esta investigación; la aclimatación en dos fases resultó ser adecuada para este cultivo, ya que el período de aclimatación es esencial para las plántulas cultivadas in vitro, puesto que facilita su transición a condiciones naturales, promoviendo la adaptación y supervivencia fuera del ambiente controlado del laboratorio (^{Quisen, Raizer y Iriarte, 2013}). Los resultados también indican que la mezcla de sustratos fue la adecuada, ya que permitió la oxigenación en la zona radicular de las plantas, promoviendo así la transpiración y el intercambio gaseoso (^{Valdés, Shukla, González y Saxena, 2021}).