Características del Área de Estudio

La investigación se realizó bajo condiciones controladas en un invernadero del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad (CIIDIR-IPN, Unidad Oaxaca), ubicado en el municipio de Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México. El clima es de tipo A(C)w, catalogado como semicálido subhúmedo con lluvias en verano seguido de una estación seca en invierno, con temperatura media anual de 14.8 a 22 °C, precipitación media anual de 600 a 1000 mm (^{SEMAEDESO, 2022}). Se sitúa en las coordenadas geográficas de 16° 57’- 17° 04’ N y 96° 42’- 96° 49’ O y con una altitud de 1523 m (^{INEGI, 2010}).

Muestreo de Sitios para Obtención de Suelo Rizosférico

Se realizó un muestreo en enero de 2023, en suelos agrícolas destinados al cultivo de frijol delgado, en condiciones de riego en planicie y bajo condiciones de temporal en ladera, en distintas parcelas de las localidades Santiago Suchilquitongo (17° 15’ 00” N - 96° 53’ 00” O), Santa Cruz Lachixolana (17° 22’ N - 96° 85’ O) y Santo Domingo Tlaltinango (17° 14’ 17” N - 96° 50’ 48” O), de acuerdo con la NOM-021-RECNAT-2000 (^{NOM-021-SEMARNAT-2000, 2002}). El número de muestras compuestas fue de 27, 15 en sitios de riego y 12 en temporal.

Obtención de Inóculos Experimentales de HMA

Los inóculos se generaron a partir de las muestras de suelo obtenidas en las parcelas de cultivo de los sitios de estudio, mediante la técnica de propagación en “plantas trampa”, en macetas con sorgo (Sorghum bicolor L.) y alfalfa (Medicago sativa L.) durante cinco meses (Aguilar-Ulloa, Arce, Galiano y Torres, 2015), finalizado este periodo, las plantas en desarrollo fueron inducidas a estrés hídrico por 15 días, se secaron y se cosechó el sustrato con raíces (inoculante), los cuales se mezclaron por separado de acuerdo al tratamiento y se resguardaron en un lugar fresco y seco. Estos inoculantes fueron considerados experimentales y se utilizaron para los ensayos con plantas en condiciones controladas.

Para la inoculación de las semillas de frijol se realizó una desinfección con alcohol de 96° durante un minuto y tres enjuagues con agua esterilizada. Se procedió a la siembra inmediata, depositando tres semillas y 20 g de inoculante en la parte media de las macetas de plástico de 1 kg de capacidad de los 27 tratamientos por triplicado, por último, se regaron todas las macetas con agua para favorecer la emergencia.

Obtención de Inóculos Experimentales de Rizobios

Las bacterias se aislaron a partir de la colecta de nódulos radicales de 15 plantas de frijol por parcela mediante un muestreo aleatorio simple. Cada planta colectada se envolvió en papel de estraza y una bolsa plástica con rótulo de colecta, el traslado al laboratorio se realizó en un contenedor térmico comercial con capacidad de 40 L. Una vez ingresadas las muestras al laboratorio, fueron resguardadas en refrigeración para su posterior uso. Se extrajeron los nódulos de cada planta, fueron lavados y se corroboró su viabilidad al observar su tonalidad rosa con la ayuda de un microscopio electrónico (Figura 1).

Figura 1: Observación microscópica de nódulos de Rhizobium. 

Figure 1: Microscopic observation of Rhizobium nodules.  

Los nódulos fueron desinfectados con alcohol de 96° y se extirparon en el fondo de un tubo de ensaye estéril para obtener las colonias bacterianas que fueron sembradas en placa acorde a la metodología de ^{Hernández, Cubillos y Milian (2012)}, con medio de cultivo YMA (levadura-manitol-agar) a base de 1.31 g de K₂HPO₄, 0.2 g de MgSO₄.7H₂O, 0.1 g de NaCl, 2.5 g de manitol, 7.5 g de sacarosa, 7.5 g de extracto de sacarosa, 0.5 g de extracto de levadura por L de medio de cultivo, suplementado con 10 mL de rojo Congo (^{Vincent, 1970}). La incubación duró 15 días a 30±2 grados centígrados.

Para el uso de inóculos experimentales se preparó un medio líquido YMA modificado sin agar, se sembraron las bacterias contenidas en placa mediante la técnica de asa bacteriológica, la incubación duró 12 días a 30° 2±C, con una densidad de 10⁸ UFC mL^-1. Estos inoculantes experimentales se utilizaron para los ensayos con plantas en condiciones controladas.

Para la inoculación de las semillas de frijol se realizó una desinfección con alcohol de 96° durante un minuto y tres enjuagues con agua esterilizada. Posteriormente se embebieron las semillas durante una hora en el medio líquido preparado para cada uno de los 15 inóculos (Arzola, 2017¹), por último, transcurrido el tiempo de la imbibición, se procedió a la siembra inmediata, depositando tres semillas en una maceta de plástico de 1 kg de capacidad de los 16 tratamientos por triplicado, por último, se regaron con agua para favorecer la emergencia.

Características del Sustrato

Las características físicas y químicas del suelo utilizado como sustrato fueron determinadas bajo la NOM-021-RECNAT-2000 (^{NOM-021-SEMARNAT-2000, 2002}) que incluye: pH 7.6, conductividad eléctrica (CE) 0.24 dS m^-1, contenido de materia orgánica (MO) 4.47%, fósforo aprovechable Olsen (P) 3.79 mg kg^-1, potasio extraíble (K) 0.02 cmol(+) kg^-1, nitrógeno total (N) 0.29% y calcio extraíble (Ca) 0.14 cmol(+) kg^-1, con 15.24% arcilla, 19.44% limo, 65.32% de arena, clasificación textural franco-arenoso, densidad aparente (DA) de 1.41 gramos por centímetro cúbico.

Diseño de los Experimentos

Se establecieron dos experimentos para la evaluación de los inóculos experimentales en un invernadero bajo condiciones controladas de temperatura, humedad relativa y radiación solar. El primero de ellos para la evaluación de HMA por 60 días, abril y mayo de 2023, mediante un diseño completamente al azar (DCA) con 27 tratamientos más un testigo, con tres repeticiones con un total de 84 unidades experimentales. Para la evaluación de los inóculos experimentales de rizobios, se utilizó también un DCA, con 15 tratamientos más un testigo, por triplicado; para un total de 48 unidades experimentales, la evaluación se hizo en el mismo periodo y duración que el primer experimento. Para los tratamientos testigos, las semillas se embebieron en agua común durante el mismo periodo que en los inóculos experimentales líquidos (Cuadro 1).

Variables de Estudio y Análisis Estadísticos

Se evaluó la efectividad de HMA en el frijol a partir de las variables índice RAS (relación biomasa seca aérea (g)/biomasa seca de raíz (g)); tasa relativa de crecimiento en altura (TRCA, cm semana^-1).

Donde: A1 y A2 representan la altura inicial y final, T1y T2 el tiempo de medición respectivamente; tasa relativa de crecimiento en diámetro (TRCD, mm semana^-1).

Donde: D1 y D2 representan al diámetro inicial y final de la base del tallo, T1 y T2 el tiempo de medición respectivamente (^{Cardillo y Bernal, 2006}); área foliar (AF, cm²) mediante el programa ImageJ^® y colonización micorrícica (MIC, %), a partir de la clasificación categórica de ^{Nicholson y Schenck, (1979)}, cuya escala de colonización es: baja (0-20%), media (20.1-50%) y alta (>50%).

Para la evaluación de la efectividad de los rizobios asociados al frijol, las variables fueron índice RAS (relación biomasa seca aérea (g)/biomasa seca de raíz (g)), tasa relativa de crecimiento en altura (TRCA, cm semana^-1), tasa relativa de crecimiento en diámetro (TRCD, cm semana^-1), nódulos por planta (NOD, número) y área foliar (AF, cm²) utilizando las mismas fórmulas anteriores.

Los datos se analizaron en el programa computacional SAS versión 9.4^® (^{SAS Institute, 2018}), mediante pruebas de normalidad y homogeneidad de varianzas (P ≤ 0.05), análisis de varianza y separación de medias con la DSH de Tukey (P ≤ 0.05).

Efecto de Inóculos de HMA Nativos

Para todas las variables medidas se registraron diferencias estadísticas altamente significativas entre tratamientos (P ≤ 0.01) (Cuadro 2).

En todos los tratamientos, para la variable RAS se obtuvieron valores superiores a 2.5. De acuerdo con los índices de calidad de planta reportados por ^{Rodríguez-Ortiz et al. (2020)}, se trata de plantas de baja calidad en desarrollo radicular y aéreo. Solo los tratamientos con inóculos de los parajes Atoyac y Lachixolana se acercan a los valores propuestos en este índice de calidad, con valores de 2.8±0.1 y 3±0.03, respectivamente (Cuadro 3).

Para la variable TCRA, se obtuvieron 16 tratamientos con valores superiores al testigo (14.400.9±0 cm semana^-1). Sobresalieron los inóculos provenientes de los parajes Jícara, Puerta del Coyote y Lachixolana (20.531.2±0, 18.731.7±0 y 18.600.3±0 cm semana^-1), respectivamente.

Para la variable TCRD, 20 tratamientos lograron valores superiores al testigo (0.34 0.03±mm semana^-1), sobresaliendo los tratamientos con inóculos de los parajes Mangal y Puerta del Coyote (0.440.0±1 y 0.420.0±1 mm semana^-1, respectivamente). Para la variable AF, los tratamientos con inóculos de los parajes Puerta del Coyote y Jícara obtuvieron valores de 418.24.0±60 y 352.32.7±0 cm², superiores al testigo (252.010.6±0 cm²). En la variable MIC, 24 tratamientos registraron valores superiores al testigo (8.330.8±0%). Los inóculos con mayor porcentaje de colonización micorrícica fueron los obtenidos en los parajes Pinos (72.338.4±0%) y Puerta del Coyote (52.335.4±0%) (Figura 2).

Figura 2: Colonización micorrícica (%) en los diferentes tratamientos evaluados. Las barras verticales en columnas indican la desviación estándar. Valores con la misma letra dentro de cada gráfica no son significativamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). 

Figure 2: Mycorrhizal colonization (%) in the different treatments evaluated. Vertical bars in columns indicate standard deviation. Values with the same letter within each graph are not significantly different (Tukey, P ≤ 0.05). 

De acuerdo con las categorías de colonización micorrícica propuesta por ^{Nicholson y Schenck (1979)}, el 50% de los suelos, principalmente los de riego, registran una colonización baja; el 46% media, especialmente en los suelos de temporal, y el 4% en categoría alta, predomina el tratamiento con inóculos del paraje Pinos con el MIC de 72.3±8.4.

Esta colonización media (20.1-50%) y alta (>50%) que se observa en los sitios de temporal de los parajes Pinos, Puerta Coyote, Teyacua, Salina, Higo, Chichicaxtle, Jícara, Totondé y Presa se debe a que los HMA pertenecientes al Phylum Glomeromycota son capaces de formar asociaciones simbióticas mutualistas con el 72 % de las familias de plantas en los ecosistemas terrestres principalmente en selvas tropicales lluviosas y secas, desiertos, humedales, bosques mesófilos de montaña y bosques templados (^{Chávez-Hernández, Barrera, Téllez, Chimal y García, 2021}).

Efecto de inóculos bacterianos nativos fijadores de nitrógeno

La inoculación de las semillas de frijol delgado con los rizobios mostró efectos benéficos promovidos por este grupo de bacterias. En el análisis de varianza, los tratamientos no mostraron diferencias significativas para la variable RAS (Cuadro 4).

Todos los tratamientos presentaron valores de RAS superiores a 2.5 (P > 0.05), lo que significa que existe baja calidad de las plantas con relación a su desarrollo radicular y aéreo (Cuadro 5).

Para las variables TCRA y TCRD no se registraron diferencias significativas entre tratamientos, pero numéricamente manifiestan el mayor crecimiento en altura y diámetro con los inóculos del paraje San Miguel, 18.532.6±0 y 0.40, 0.05± respectivamente; superiores al testigo (15.830.9±0 y 0.31±0.03). En la variable AF se registraron diferencias altamente significativas entre tratamientos (P ≤ 0.01), sobresalen cuatro inóculos, parajes Paredón, Presa, Tlaltinango y Cajón, 368.030.5±0, 423.210.6±0, 380.270.6±0 y 441.15±0.60 cm², respectivamente; superiores al testigo (364.210.6±0 cm²). En la variable NOD se registraron diferencias altamente significativas entre tratamientos (P ≤ 0.01), sobresale el inóculo del paraje Cajón (43.3318.7±0 nódulos/planta) (Figura 3).

Figura 3: Número de nódulos por tratamientos evaluados. Las barras verticales en columnas indican la desviación estándar. Valores con la misma letra dentro de cada gráfica no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).  

Figure 3: Number of nodules by treatments evaluated. Vertical bars in columns indicate standard deviation. Values with the same letter within each graph are not significantly different according to the Tukey test (P ≤ 0.05).  

Efectividad de HMA en el Frijol Negro Delgado

Los efectos benéficos de los HMA en la promoción del crecimiento de las plantas se deben principalmente al intercambio de nutrientes, lo que justifica la sustitución de hasta el 75% del fertilizante fosfórico (^{Mora-Quilismal, Águila, Revelo, Benavides y Balarezo, 2019}). Estos microorganismos mejoran la absorción de fósforo por la planta debido al aumento en el transporte de elementos inorgánicos desde el suelo a las plantas (^{Adavi y Tadayoun, 2014}), y el incremento de la biomasa de las plantas cultivadas (Parra-Zambrano, 2012²).

Los valores obtenidos de la RAS, superiores a 2.5, indican, de acuerdo con ^{Rodríguez-Ortiz et al. (2020)}, que todos los tratamientos generan plantas de baja calidad, y se atribuye al limitado espacio del contenedor, lo que limitó el desarrollo radical y biomasa aérea, similar a lo reportado por ^{Pérez-Moncada et al. (2019)}. Así mismo, existió una deficiente aireación y baja retención de agua debido al bajo volumen de sustrato en las macetas y su compactación, lo que provocó escaso crecimiento radical y baja germinación de esporas de HMA, resultados también reportados por ^{Domínguez-Arrieta et al. (2021)}.

^{Callejas-Ruiz et al. (2009)} reportan que la efectividad en la simbiosis depende de la cantidad de raíces emitidas por la planta y de las características fisicoquímicas del suelo, y su déficit puede afectar directamente la germinación de las esporas de los HMA, determinantes para su establecimiento.

Los resultados en la variable TCRA demuestran que los HMA promueven el crecimiento vegetal (P ≤ 0.01), como se demuestra en los inóculos provenientes del paraje Lachixolana (18.6±0.03) y Jícara (20.5±1.20), similarmente reportado por ^{Domínguez-Arrieta et al. (2021)}. ^{González, Sosa y Díaz (2012)} obtuvieron diferencias significativas en la altura de planta con la aplicación de HMA al cultivo de frijol (P. vulgaris) variedad CC-25-9 negro.

Por el contrario, las plantas con menor altura con respecto al testigo fueron influidas por factores bióticos, dado que los HMA se benefician de diferente manera según el cultivo hospedero principalmente por el aumento de la colonización micorrícica tal y como se demuestra en los parajes de Teyacua, Puerta del Coyote y los Pinos en donde el RAS presenta valores bajos con respecto al testigo, pero MIC presenta valores altos, otro factor influyente en la altura de la planta son los factores abióticos tales como el flujo no equilibrado de nutrimentos del suelo a la planta debido a condiciones ambientales como luz, temperatura y pH; lo cual también fue reportado por ^{Grace, Cotsaftis, Tester, Smith y Smith (2009)} y ^{Ley-Rivas, Sánchez, Ricardo y Collazo (2015)}.

Para la TCRD se encontró un desarrollo homogéneo en todos los tratamientos, debido a las ventajas que proporciona la simbiosis micorrícica (P ≤ 0.01); tal como lo reportan ^{Domínguez-Arrieta et al. (2021)} y ^{Calero-Hurtado et al. (2022)}, quienes encontraron valores superiores de área foliar con la utilización de HMA en el cultivo de frijol.

Los valores de MIC con micorrización media y alta procedieron en su mayoría de los inóculos provenientes de sitios de temporal (P ≤ 0.01); lo que coincide con ^{Espinosa-Cuéllar, Rivera, Ruiz y Lago (2018)}, quienes obtuvieron porcentajes mayores de microorganismos provenientes de suelos cultivados bajo temporal en épocas lluviosas, ya que, bajo esas condiciones, ^{Koch, Antunes, Maherali, Hart y Klironomos (2017)} reportan que los HMA incrementan sus estructuras y la producción de esporas.

^{Crespo-Flores et al. (2021)} indican que la eficiencia en la inoculación de HMA nativos depende de su capacidad para producir hifas externas, la velocidad de la hifa para colonizar las raíces y su habilidad para mantener niveles de colonización bajo condiciones competitivas, lo que ^{González-Cañizares, Ramírez, Morgan, Rivera y Plana (2015)} manifiestan que repercute positivamente en el aumento de la colonización micorrícica, biomasa y rendimiento.

Efectividad de Rizobios en el Frijol Negro Delgado

El uso de cepas nativas de rizobios para la inoculación en semillas ofrece ventajas significativas en el crecimiento vegetal, al aumentar la disponibilidad de nutrientes limitantes como el P y N, principalmente (^{Uc-Ku et al., 2019}). Respecto a la RAS, se encontraron valores >4.3 en todos los tratamientos (CV = 41.2%). De acuerdo con ^{Rodríguez-Ortiz et al. (2020)}, son plantas con reducido desarrollo, posiblemente debido las bajas dimensiones del contenedor donde se sembraron. Aunque no se encontraron diferencias significativas, los valores obtenidos en el peso seco de raíces (P ≤ 0.01) evidencian diferencias entre tratamientos y eficiencia de las cepas de rizobios comparados con el testigo. ^{García et al. (2023)} señalan que el uso de estos inóculos estimula la nodulación, crecimiento y rendimiento del cultivo. ^{Di Benedetto et al. (2017)} añaden que esta simbiosis influye directamente en el crecimiento y profundidad de las raíces, y permite al cultivo beneficiarse de los nutrimentos del suelo con mayor facilidad.

La capacidad de estos inóculos para la generación de biomasa y área foliar se manifestó en el peso seco aéreo (P ≤ 0.01). Para ^{Cuzcano y Dávila (2002)}, el estudio de estas variables en frijol común es de importancia para la generación y disponibilidad de fotosintatos. ^{Lalande, Bigwanesa y Antoun (1990)} y ^{Hernández, Nápoles, Rosales, Baños y Ramírez (2013)} indican que la biomasa aérea se utiliza como indicador de la eficiencia en la fijación de nitrógeno debido a su importancia en el crecimiento, desarrollo y fijación biológica del nitrógeno (FBN).

Aunque la TCRA y TCRD no mostraron diferencia significativa entre tratamientos (P > 0.05), numéricamente existen algunos de ellos que superan al testigo, debido a que las leguminosas tienen la capacidad de establecer simbiosis con los rizobios nativos del suelo (^{Madigan, Bender, Buckley, Sattley y Stahl, 2017}); al fijar el N atmosférico para convertirlo a formas disponibles para las plantas y su uso en procesos metabólicos (^{Cántaro-Segura et al., 2019}); que inciden directamente en el crecimiento y rendimiento (^{Granda-Mora, Alvarado y Torres, 2017}).

Existe heterogeneidad en cuanto a NOD (CV=30.9%), sin embargo, el tratamiento con inóculos del paraje Cajón fue el que presentó 43.3 nódulos/planta, ubicados en las raíces laterales y zona media de crecimiento. Predominaron las formas esféricas y elípticas, que al observarse en microscopio muestran una coloración rosada; característica observada por ^{Nap y Bisseling (1990)} y ^{Colás-Sánchez, Díaz, Rodríguez, Gatorno y Rodríguez (2018)}.

^{Mendoza-Labrador y Bonilla (2014)} obtuvieron resultados significativos en biomasa aérea, radical y número de nódulos con la aplicación de rizobios en frijol Caupí bajo condiciones de invernadero. De acuerdo con ^{Velázquez, García, Ramírez, Rivas y Molina (2017)}, esta afinidad repercute positivamente en una mayor colonización del sistema radicular y establecimiento de los bacteroides dentro de los nódulos.

A excepción del tratamiento 3 y 8, todos los tratamientos evaluados produjeron mayor número de nódulos que el testigo y mostraron gran afinidad a las plantas de frijol, similar a lo reportado por ^{Cántaro-Segura et al. (2019)}, quienes mejoraron rendimientos con inóculos de rizobios en frijol. De acuerdo con ^{Tajini y Drevon (2012)} y ^{Crespo-Flores et al. (2021)}, esto se debe a que la nodulación de las bacterias nitrofijadoras en las raíces de las plantas, abastecen de N y movilizan al P y otros nutrimentos desde el suelo hacia las raíces de las plantas.