Localización del sitio donde se realizó el estudio

Este estudio se llevó a cabo en los invernaderos de la corporación colombiana de investigación agropecuaria - AGROSAVIA, en el centro de investigación La Suiza, con un promedio de temperatura de 28 °C y una humedad relativa de 85%, localizada a una altitud de 540 m, ubicada a 7° 22’ 11.14” N y 73° 10’ 37.92” O en Rionegro - Colombia.

Selección y multiplicación de hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA)

Se evaluaron los HFMA Rhizoglomus intraradices ((N.C. Schenck & G.S. Sm.) Sieverd., G.A. Silva & Oehl comb. nov.) y Glomus macrocarpum (Tul & C. Tul) junto con un consorcio de HFMA provenientes de suelos cacaoteros con altos contenidos de Cd del Departamento de Santander del Municipio de San Vicente de Chucuri. Estos microrganismos hacen parte de la colección de trabajo de AGROSAVIA.

La multiplicación de los HFMA se llevó a cabo bajo condiciones de invernadero utilizando como hospedero plantas de Brachiria decumbens y Allium cepa L., las semillas de estas dos especies fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio al 2% y sembradas en bandejas de 72 alvéolos. A cada alvéolo se le aplicó una concentración de 70 esporas de HFMA g^-1 de suelo seco. Después de un mes, las plantas fueron trasplantadas a macetas de 500 g de capacidad, después de tres meses las plantas fueron sometidas a estrés hídrico para obtener un mayor número de esporas.

Establecimiento de ensayos

Para el establecimiento de los ensayos se usó el patrón de cacao IMC67, estos ensayos se llevaron a cabo en el C.I. La Suiza. El diseño experimental fue de bloques completos al azar (BCA) con tres repeticiones, una unidad experimental con 15 plantas y un arreglo factorial de 4 × 5 que corresponden a 4 tratamientos de inoculación con HFMA (T1: Testigo; T2: G. macrocarpum; T3: Rizoglomus intraradices y T4: HFMA - nativos y 5 dosis de Cd (0, 6, 12, 18 y 25 mg kg^-1). El patrón de cacao fue sembrado bajo condiciones de vivero en bolsas con capacidad de 1 kg, cada planta se inoculó con una concentración de 80 esporas g^-1 de suelo seco de cada uno de los HFMA evaluados. Esta inoculación se realizó al momento de la siembra de las semillas de los patrones evaluados (tiempo cero). Cuarenta días después de la siembra, se realizó la aplicación de Cd a razón de 10 ml planta^-1 con una única dosis, de acuerdo con las dosis mencionadas anteriormente. Para el mantenimiento de las plantas, estas fueron fertilizadas con 10-30-10 aplicando 5 g para el testigo (T1) que corresponde al 100% de fertilización y 2.5 g para los demás tratamientos inoculados con HFMA (T2, T3 y T4) que corresponde al 50% de fertilización.

Sistema de muestreo y variables analizadas

Se realizaron cuatro muestreos destructivos (30, 60, 90 y 120 días después de la siembra). El muestreo inicial se realizó a los 30 días después de establecido el ensayo y antes de aplicar las diferentes dosis de cadmio.

En cada muestreo destructivo se midieron variables agronómicas como altura, diámetro del tallo de la planta, peso fresco y seco de las hojas, tallos y raíz. A nivel simbiótico, se evaluó el porcentaje de colonización por parte de los HFMA en el primero y último muestreo, empleando la metodología de tinción con Azul de Tripán, propuesta por ^{Phillips y Hayman (1970)}. Al final se realizó un análisis de la concentración de Cd en los órganos de la planta, así como un análisis de la concentración de elementos en toda la planta. Para la determinación de nutrientes en toda la planta, las muestras fueron secadas en una estufa a 60 °C por tres días, posteriormente fueron molidas y tamizadas. La cuantificación de P, K, Ca, Fe, Cu, Zn y Mn en toda la planta se realizó en digestión cerrada con ácido nítrico, peróxido y agua en relación 5:1:2 respectivamente, la cuantificación se llevó a cabo en un espectrómetro de absorción atómica marca Agilent 280; la concentración de nitrógeno se hizo por el método de Kjeldahl, teniendo en cuenta la metodología EPA 351.3. La extracción y cuantificación de Cd en cada uno de los órganos evaluados (raíz, tallo y hojas) se realizó por digestión abierta con ácido nítrico y perclórico en relación 5:2 a través de un espectrómetro óptico de plasma acoplado inductivamente (ICP) marca Thermo Fisher Scientific 6000.

Las concentraciones obtenidas de Cd, en cada órgano de la planta, fueron usadas para estimar el factor de translocación (FT). Este factor indica la capacidad que tiene la planta para translocar el metal de las raíces a la parte aérea y está representado por la siguiente Ecuación 1 (^{Pachura et al., 2016}).

Análisis estadístico

Se realizó un ANAVA multifactorial. Después se realizó la prueba de comparación de medias de Tukey para los análisis paramétricos que resultaron significativos. El nivel de significancia empleado para todas las pruebas fue de 0.05. Los análisis fueron realizados con el programa STATISTIX 9.0 software (Analytical Software; Tallahasse, FL, USA).

Variables agronómicas

La interacción dosis por tratamiento, no presentó diferencias estadísticas significativas (P > 0.05) entre tratamientos, en las variables de altura de la planta, diámetro del tallo (Cuadro 1) y peso seco de raíz, tallo y hojas (Cuadro 2). A pesar de que no se presentaron diferencias estadísticas en las variables mencionadas anteriormente, se observó que todos los tratamientos inoculados con HFMA, en las diferentes dosis evaluadas, presentaron valores iguales o superiores en comparación con el tratamiento que no estaba inoculado con HFMA (testigo), lo que significa que los tratamientos con HFMA, al tener solo el 50% de la fertilización, fueron más eficientes en la toma de nutrientes del suelo, en comparación con el testigo que tenía el 100% de fertilización (Cuadros 1 y 2).

La tendencia fue similar para la variable de biomasa representada en peso seco de las hojas, tallos y raíz en donde no se observaron diferencias estadísticas (P > 0.05) (Cuadro 2). Sin embargo, aunque no se encontraron diferencias entre tratamientos, se observa que los tratamientos inoculados con HFMA, especialmente el inoculado con HFMA-nativas, presentó mayores valores de biomasa con relación a los testigos sin y con aplicación de Cd. Estos incrementos en la biomasa en las plantas inoculadas con HFMA pueden ser debido a que, cuando las plantas están en asociación con HFMA, son más eficientes en la toma de nutrientes y agua del suelo.

Los metales pesados en el suelo afectan el crecimiento de las plantas y representa una amenaza potencial para los agroecosistemas, así como para la salud humana, a través de las cadenas alimentarias. ^{Chang et al. (2018)} encontraron que las aplicaciones de lantano (La) y Cd tanto en forma individual y combinada tiene efectos negativos sobre el crecimiento en maíz disminuyendo en un 15.3% la biomasa de las hojas, raíces y total de la planta, sin embargo, cuando las plantas de maíz estaban micorrizadas con C. etunicatum la biomasa se incrementaba en un 26.2% más, comparado con los tratamientos con los metales sin micorrizas; lo que indica que la asociación HFMA - planta puede disminuir la f itotoxicidad de metales pesados y esto ha sido documentado en numerosos estudios (^{Garg y Kaur, 2013}; ^{Liu et al., 2014}; ^{Jiang et al., 2016}; ^{Gunathilakae et al., 2018}; ^{Chang et al., 2018}). Estudios realizados en plantas de Lonicera japonica inoculadas con G. versiforme y R. intraradices bajo diferentes niveles de Cd (0, 10 y 20 mg kg^-1) demostraron que la biomasa de las plantas (hojas y raíz) fue más alta en los tratamientos inoculados con los HFMA en comparación al testigo independientemente de la dosis evaluada (^{Jiang et al., 2016}).

Porcentaje de colonización por parte de los HFMA

Un incremento en la colonización por parte de los HFMA a medida que aumenta la edad de la planta se puede apreciar en la Figura 1. En este caso, el tratamiento inoculado con HFMA nativos (T4) fue el que obtuvo los mayores valores de colonización [59.3% a los 120 días después del trasplante (ddt)]. Los porcentajes de colonización observados en el T1 (testigo + 100% de fertilización) en las diferentes dosis evaluadas, pueden atribuirse a esporas nativas presentes en ese suelo.

Figura 1 Porcentaje de colonización por parte de los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) en plantas de cacao bajo diferentes dosis de Cd a los 30 y 120 dds (a y b respectivamente). T1 = testigo + 100% de fertilización; T2 = Glomus macrocarpum + 50% de fertilización; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% de fertilización; T4 = HFMA - nativos + 50% de fertilización. Letras distintas indican diferencias significativas, según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). 

Figure 1  Percentage of colonization by arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in cocoa plants under different doses of Cd at 30 and 120 das (a and b respectively). T1 = control + 100% fertilization; T2 = Glomus macrocarpum + 50% fertilization; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% fertilization; T4 = HFMA - native + 50% fertilization. Different letters indicate significant differences according to the Tukey test (P ≤ 0.05).  

En este estudio se pudo observar que la adición de diferentes dosis de Cd (0, 6, 12, 18 y 24 mg kg^-1) al suelo, no afecto la simbiosis HFMA - planta como se ha visto en muchos trabajos realizados (^{Ortiz-Cano et al., 2009}; ^{Liu et al., 2014}; ^{Gunathilakae et al., 2018}; ^{Gai et al., 2018}). Estos resultados, concuerdan con estudios realizados en plantas de Amaranthus hybridus L. en suelos contaminados con 300 mg kg^-1 de Pb y 15 mg kg^-1 de Cd e inoculado con diferentes dosis del metal (0, 2.5 y 5 g kg^-1) y de una mezcla de HFMA (Entrophospora colombiana, Glomus intraradices, G. etunicatum y G. clarum) donde se encontró que los porcentajes de colonización aumentaban a medida que pasaba el tiempo (^{Ortiz-Cano et al., 2009}). Muchas especies de HFMA como Gi. rosea, G. mossae, G. caledonium y G. claroideum se pueden volver más tolerantes en sustratos contaminados con As, Cu, Cd, Pb y Mn a medida que pasa el tiempo (^{Sánchez-Viveros et al., 2004}), lo que puede indicar que quizá algunas de estas especies de HFMA mencionadas podría estar presente en el tratamiento inoculado con HFMA nativos, ya que este tratamiento fue el que presentó los porcentajes de colonización más altos (Figura 1). ^{Liu et al. (2014)} inocularon tres cepas diferentes de HFMA (G. intraradices, G. constrictum y G. mosseae) en maíz con diferentes dosis de Cd (0.02 y 0.2 mM) bajo condiciones de invernadero y observó que los porcentajes de colonización de estos hongos aumentaba con la dosis de Cd aplicado durante las primeras 6 semanas. Sin embargo, después de 9 semanas, estos porcentajes de colonización disminuyeron para los tratamientos inoculados con G. constrictum y G. mosseae siendo G intraradices el que mostró los mayores valores de colonización de la raíz (72.3%).

Absorción de cadmio en hojas, tallos y raíces

Se presentó una absorción de Cd hacia todos los órganos de la planta evaluados, donde se observó una disminución de este metal en el tratamiento inoculado con HFMA - nativos en la dosis de 24 mg kg^-1 a los 120 ddt, en comparación a los demás tratamientos con HFMA (T2 y T3) y el testigo (T1) en esta misma dosis (24 mg kg^-1) (Figura 2). En contraste, se pudo observar que en las demás dosis de Cd evaluadas (0, 6, 12 y 18 mg kg^-1) las plantas que estaban inoculadas con HFMA (T2, T3 y T4) translocaron más Cd que el testigo (T1), esto pudo ser debido a que las plantas cuando están colonizadas por HFMA aumentan el área superficial de exploración del suelo a través de su micelio extraradical, permitiendo una mayor translocación de macro y micronutrientes incluyendo metales pesados (^{Smith et al., 2010}).

Figura 2 Absorción de cadmio (Cd) en hojas, tallos y raíces en plantas de cacao (IMC67) bajo la aplicación de diferentes dosis de Cd. T1 = testigo + 100% de fertilización; T2 = Glomus macrocarpum + 50% de fertilización; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% de fertilización; T4 = HFMA - nativos + 50% de fertilización.  

Figure 2  Absorption of cadmium (Cd) in leaves, stems and roots in cocoa plants (IMC67) under the application of cadmium doses. T1 = control + 100% fertilization; T2 = Glomus macrocarpum + 50% fertilization; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% fertilization; T4 = HFMA - native + 50% fertilization. 

Las concentraciones obtenidas fueron usadas para estimar el FT, en donde los resultados obtenidos en el patrón IMC67 demuestran que el Cd es fácilmente transferible en este patrón ya que se encontraron valores superiores a 1 tanto en el tallo como en las hojas, sin embargo, los tratamiento inoculados con R. intraradices y HFMA-nativos presentaron valores menores a 1 a la concentración de 24 mg kg^-1 en las hojas (Cuadro 2), lo que indica que la mayor concentración del metal queda en el tallo de la planta, en esta etapa fenológica de la planta.

Se ha demostrado que algunos HFMA pueden soportar mejor el estrés por metales pesados como los son Glomus intraradices, Glomus mosseae y algunas otras especies importantes de Glomus (^{Bano y Ashfaq, 2013}), quizá algunas de estas especies está presente en el tratamiento inoculado con HFMA - nativos evaluado en este proyecto y de ahí la importancia de realizar este tipo de estudios para poder seleccionar HFMA que estén más adaptados a esas condiciones y que estos les pueda brindar cierta protección a las plantas contra el estrés causado por metales como lo es el Cd.

^{Li et al. (2016)}, evaluaron dos especies de micorrizas (Rhizophagus intraradices y Funneleformis mosseae) bajo diferentes concentraciones de Cd (0, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 mM) por tres días en un sistema de cultivo hidropónico con plantas de arroz (Oriza sativa L.), y observaron que los hongos micorrízicos disminuyeron significativamente las concentraciones de Cd en las hojas y raíces de las plantas, siendo el tratamiento inoculado con F. mosseae quien realizó una notable disminución del metal a una concentración de 0.025 mM en comparación a R. intraradices. Existen diferentes posibles mecanismos responsables de la reducción de Cd en plantas inoculadas con hongos micorrízicos, uno de ellos es un posible efecto de dilución por un aumento de biomasa debido al efecto positivo que tienen los HFMA sobre el crecimiento de las plantas (^{Liu et al., 2011}); por otra parte los HFMA producen una glicoproteína insoluble llamada glomalina lo cual actúa como secuestrante de metales pesados (^{González-Chávez et al., 2004}; ^{Cornejo et al., 2008}; ^{Bedini et al., 2010}). Adicionalmente, las plantas cuando están micorrizadas disminuyen los niveles de expresión de algunos transportadores del metal en la raíz en comparación con las plantas no micorrizadas (^{Burleigh et al., 2003}), por lo tanto los HFMA pueden actuar como amortiguadores de metales aumentando el suministro del metal en concentraciones bajas pero disminuyéndolo cuando está en concentraciones toxicas para la planta (^{González-Guerrero et al., 2016}), como lo observado en este estudio, en donde a concentraciones altas (24 mg kg^-1) de Cd los HFMA disminuyeron su translocación hacia la planta.

Absorción de nutrientes

Se presentó una mayor absorción de nutrientes como el N, P, K y Ca en los tratamientos inoculados con HFMA en comparación al testigo, en donde el tratamiento inoculado con HFMA - nativos fue el que obtuvo las mayores concentraciones de estos elementos tanto en la dosis cero como hasta la dosis de 12 mg kg^-1, la concentración de estos elementos disminuye a una alta concentración de Cd (24 mg kg^-1) tal y como se puede observar en la Figura 3.

Figura 3 Absorción de N, P, K y Ca en plantas de cacao (IMC67) bajo diferentes dosis de cadmio. T1 = testigo + 100% de fertilización; T2 = Glomus macrocarpum + 50% de fertilización; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% de fertilización; T4 = HFMA - nativos + 50% de fertilización. Letras distintas indican diferencias significativas, según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). 

Figure 3  Absorption of N, P, K and Ca in cocoa plants (IMC67) under different doses of cadmium. T1 = control + 100% fertilization; T2 = Glomus macrocarpum + 50% fertilization; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50 % fertilization; T4 = HFMA - native + 50% fertilization. Different letters indicate significant differences according to the Tukey test (P ≤ 0.05).  

Dentro de los metales pesados se pueden distinguir dos grupos. El primero de estos grupos está formado por aquellos elementos considerados como esenciales para las plantas. Es decir, aquellos elementos que las plantas necesitan en muy pequeñas cantidades para completar su ciclo de vida como lo son el Fe, Cu, Zn y Mn. El segundo grupo lo forman aquellos elementos que, en muy baja concentración no los requiere la planta como lo es el Cd. El mantenimiento de la homeostasis del grupo de los metales esenciales es clave para la existencia de un ser vivo, ya que tanto su exceso como su defecto pueden resultar perjudiciales (^{González-Guerreo, 2005 3}). Los resultados obtenidos en la absorción de micronutrientes como el Fe, Cu, Zn y Mn se pudieron observar que los tratamientos inoculados con HFMA presentaron la mayor absorción de esos micronutrientes, siendo el tratamiento inoculado con los HFMA - nativos (T4) seguido de R. intrarradices los que obtuvieron los mayores valores en las diferentes dosis de Cd aplicadas en comparación con los testigos y los demás tratamientos inoculados con HFMA (Figura 4).

Figura 4 Absorción de Fe, Cu, Zn y Mn en plantas de cacao (IMC67) bajo diferentes dosis de cadmio. T1 = testigo + 100% de fertilización; T2 = Glomus macrocarpum + 50% de fertilización; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% de fertilización; T4 = HFMA - nativos + 50% de fertilización. Letras distintas indican diferencias significativas, según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).  

Figure 4  Absorption of Fe, Cu, Zn and Mn in cocoa plants (IMC67) under different doses of cadmium. T1 = control + 100% fertilization; T2 = Glomus macrocarpum + 50% fertilization; T3 = Rhizoglomus intraradices + 50% fertilization; T4 = HFMA - native + 50% fertilization. Different letters indicate significant differences according to the Tukey test (P ≤ 0.05).  

La distribución de micro y macroelementos en los tratamientos inoculados y no inoculados con HFMA, bajo diferentes concentraciones de Cd, indican que los HFMA nativos fueron los que obtuvieron mayores concentraciones de estos elementos en las plantas de cacao (patrón IMC67) (Figuras 3 y 4). Los hongos formadores de micorrizas arbusculares son bien conocidos porque mediante su red de micelio externo pueden explorar un mayor volumen de suelo y así tomar los nutrientes esenciales para las plantas, especialmente el P. En ese sentido, las plantas al tener una mejor nutrición por P aumentarían su biomasa y podría existir un posible efecto de dilución por el crecimiento de las plantas como se ha observado en diferentes estudios (^{Shen et al., 2006}; ^{Shahabivand et al., 2012}; ^{Huang et al., 2017}). Un estudio realizado en Phragmites australis inoculado con R. irregularis bajo diferentes concentraciones de Cd, se observó que hubo una fuerte correlación entre el Cd y el P al mejorar la absorción de P en las hojas y proporcionando una mayor protección a las plantas (^{Huang et al., 2017}).