Evaluación del golfo de California como una fuente potencial de actinobacterias marinas bioactivas

 

Evaluation of the Gulf of California as a potential source of bioactive marine actinobacteria

 

M Torres-Beltrán¹, F Cardoso-Martínez¹, N Millán-Aguiñaga², A Becerril-Espinosa¹, IE Soria-Mercado¹*

 

¹ Facultad de Ciencias Marinas, Universidad Autónoma de Baja California, Ensenada 22820, Baja California, México. *Corresponding author. E-mail: iesoria@uabc.edu.mx

² Scripps Institution of Oceanography, University of California San Diego, La Jolla, CA 92093-0204, USA.

 

Received March 2012,
received in revised form August 2012,

 

RESUMEN

Las actinobacterias son productoras de una gran variedad de compuestos utilizados actualmente como antibióticos y anticancerígenos. En este trabajo se evaluó el potencial del golfo de California como fuente de cepas de actinobacterias bioactivas. En total, se aislaron 235 cepas de actinobacterias de los sedimentos de bahía Concepción y bahía de los Ángeles, (México). Con base en su morfología, requerimiento de agua de mar para su crecimiento y secuenciación del gen 16S del ARNr, las cepas se clasificaron como Streptomyces, Micromonospora y Salinispora. Mediante la técnica de extracción líquido-líquido con acetato de etilo como disolvente, se obtuvieron 69 extractos orgánicos y acuosos; 17 mostraron actividad citotóxica contra las líneas celulares de cáncer de mama (MCF7) y cérvix (HeLa). Los valores máximos de actividad, expresados como porcentaje de supervivencia, fueron de 20-25% contra MCF7 (cepas S-365, S-355 y S-361) y de 24-25% contra HeLa (cepas S-165, S-361 y S-353). Tres extractos en su fracción acuosa mostraron actividad antibiótica contra Staphylococcus aureus, que es resistente a la meticilina, con valores de actividad de 3% y 6% (cepas S-370 y S-369, respectivamente). Con base en el análisis de cromatografía líquida con detector de masas, se encontraron pesos moleculares de compuestos previamente documentados para especies terrestres del genero Micromonospora; sin embargo, no se identificaron los pesos moleculares de metabolitos específicos previamente documentados para las cepas del género Salinispora. La bioactividad observada en este trabajo ofrece la oportunidad de un estudio químico posterior para definir los metabolitos responsables de la actividad a fin de contribuir con el descubrimiento de nuevos fármacos y ubicar al golfo de California como una fuente potencial de cepas de actinobacterias productoras de compuestos bioactivos de importancia para la salud humana.

Palabras clave: actinobacterias marinas, Salinispora, citotóxico, antibiótico, golfo de California.

 

ABSTRACT

Actinobacteria produce many bioactive compounds currently used as antibiotics and anticancer drugs. The objective of this project was to evaluate the Gulf of California as a novel source of bioactive actinobacterial strains. A total of 235 actinobacterial strains were isolated from marine sediment collected in Concepción and los Ángeles bays (Mexico). Based on their morphology, seawater requirements, and 16SrRNA sequencing, actinobacterial strains were classified as Streptomyces, Micromonospora, and Salinispora. Sixty-nine organic and aqueous extracts were obtained using liquid-liquid extraction with ethyl acetate; 17 showed cytotoxic activity against breast cancer cells (MCF7) and cervical cancer cells (HeLa). The highest activity values observed, expressed as survival percentage, were 20-25% against MCF7 cells (strains S-365, S-355, and S-361) and 24-25% against HeLa cells (strains S-165, S-361, and S-353). Only three aqueous extracts showed antibiotic activity towards methicillin-resistant Staphylococcus aureus, with activity values of 3% and 6% for strains S-370 and S-369, respectively. Molecular weights found by liquid chromatography-mass spectrometry analysis are reported for Micromonospora species isolated from soil, but no species-specific secondary metabolite evidence was observed for Salinispora isolates. The biological activity observed in this work offers opportunities for further chemical studies to define the compounds responsible for this activity in order to contribute to the discovery of new drugs and to acknowledge the Gulf of California as a reservoir of marine bioactive actinobacteria strains that are important for human health.

Key words: marine actinobacteria, Salinispora, cytotoxic, antibiotic, Gulf of California.

 

Introducción

El sedimento marino tiene la capacidad de mantener una numerosa población de microorganismos (Ward y Bora 2006), por lo que es considerado como un ambiente altamente competitivo en donde las bacterias requieren del desarrollo de estrategias que les permitan acceder a los nutrientes de su medio (Vernam y Evans 2000, Challis y Hopwood 2003). La producción de sustancias antagonistas específicas es una estrategia competitiva que puede inhibir o regular el crecimiento de ciertos microorganismos en una población (Vernam y Evans 2000). La capacidad de algunos microorganismos para producir este tipo de metabolitos secundarios les ofrece una respuesta más eficiente a diferentes factores de estrés y una ventaja de supervivencia con respecto a aquellos que no los producen (Maier et al. 2000, Surajit-Das et al. 2006).

Las actinobacterias son bacterias Gram-positivas filamentosas que pertenecen al orden Actinomycetales y se caracterizan por la producción de compuestos con actividad biológica (Fenical y Jensen 2006). Las actinobacterias son un grupo ampliamente distribuido y con diversas características que les permiten competir exitosamente con otros microorganismos saprofíticos. Se caracterizan por la producción de diferentes tipos de esporas que les sirven como agentes de dispersión y supervivencia, y la mayoría tiene la capacidad de formar un micelio radial que le permite la colonización de substratos lejos de su centro de crecimiento (Maier et al. 2000, Prieto- Davó et al. 2008).

Los metabolitos secundarios producidos por bacterias marinas han demostrado ser altamente eficientes contra agentes patógenos que afectan a la salud humana (Davies 2006, Surajit-Das et al. 2006). Dos tercios de los antibióticos actualmente utilizados son los productos fermentativos de actinobacterias, como la estreptomicina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la eritromicina, que son obtenidos a partir de diferentes especies terrestres del género Streptomyces (Challis y Hopwood 2003, Magarvey et al. 2004, Fenical y Jensen 2006).

Recientemente el sedimento marino se ha convertido en un nuevo y prometedor reservorio de nuevas cepas de actinobacterias bioactivas (Mincer et al. 2002, Bull et al. 2005, Maldonado et al. 2005b). Las actinobacterias marinas son actualmente reconocidas como una fuente de metabolitos nuevos con gran importancia biotecnológica y farmacéutica. Algunos de estos nuevos metabolitos son compuestos con actividad antitumoral e inmuno-supresora (Mincer et al. 2002). Estos compuestos incluyen el agente anticancerígeno salinosporamide A aislado de Salinispora tropica, que actualmente se encuentra en la fase clínica II de tratamiento contra cáncer (Maldonado et al. 2005a, Fenical et al. 2009); las marinomicinas A a D aisladas de cepas Marinophilus con actividad antitumoral y antibiótica; y el antibiótico abisomicina C obtenido a partir de cepas Verrucosispora (Fenical y Jensen 2006, Kwon et al. 2006).

Existen dos familias que son reconocidas por su gran producción de metabolitos secundarios: Streptomycetaceae y Micromonosporaceae (Magarvey et al. 2004, Fenical y Jensen 2006). El género Salinispora fue el primer descrito como puramente marino y pertenece a la familia Micromonosporaceae (Mincer et al. 2002, Maldonado et al. 2005a).

Para este género, se han descrito dos especies: Salinispora arenicola y S. tropica (Maldonado et al. 2005a, Fenical y Jensen 2006, Jensen 2010). Una tercera especie, S. pacifica, ha sido propuesta por Jensen y Mafnas (2006). Más de 100 cepas pertenecientes al género Salinispora han sido cultivadas, y más del 80% han mostrado actividad antitumoral y 35% actividad antibiótica (Fenical y Jensen 2006).

El aislamiento de cepas de sedimento marino pertenecientes a Salinispora en la actualidad es de gran importancia debido a su alto potencial biotecnológico (Feling et al. 2003, Charan et al. 2004). El golfo de California, por sus características oceanográficas, representa un sitio estratégico para el aislamiento de cepas con actividad biológica como Salinispora (Maldonado et al. 2009). Considerando este antecedente, el objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial del golfo de California como un reservorio de actinobacterias bioactivas, principalmente cepas pertenecientes al género Salinispora, mediante el aislamiento y pruebas de actividad biológica.

 

Materiales y métodos

Área de estudio

El golfo de California es una extensión del océano Pacífico localizado entre la península de Baja California y el noroeste de México. Para este estudio, se tomaron muestras de sedimento en dos diferentes localidades de la costa oeste del golfo de California: bahía Concepción y bahía de los Ángeles (fig. 1). Bahía Concepción, localizada en la región sur del golfo de California, tiene una profundidad promedio de 17 m (un máximo de 30 m), valores de temperatura superficial del agua entre 18 y 32 °C y valores de salinidad promedio de 35 durante todo el año. Bahía de los Ángeles, localizada en la región norte del golfo de California, tiene una profundidad promedio de 40 m, valores de temperatura superficial del agua entre los 15 y 29.8 °C y valores de salinidad que varían entre 32.25 y 35.55. (Canino-Herrera et al. 1990).

Cultivo y aislamiento de actinobacterias

Las muestras de sedimento fueron recolectadas manualmente en abril de 2008 mediante buceo libre o con el uso de una draga Kahlisco de acero inoxidable de 12 cm de diámetro. La técnica de recolección estuvo en función de la profundidad del sitio de muestreo. En total, se tomaron 43 muestras de sedimento de distintas localidades de bahía Concepción y bahía de los Ángeles (tabla 1).

En el laboratorio, el sedimento se secó en cajas de petri estériles y posteriormente se pulverizó con un mortero estéril. Las cepas de actinobacterias fueron aisladas selectivamente con la técnica de estampado seco (Mincer et al. 2002) en seis diferentes medios de cultivo (Ensign 1978; Mincer et al. 2002; Gontang et al. 2007; Becerril-Espinosa 2011, Becerril-Espinosa et al. 2012): M1 (18 g L^-1 de agar), M2 (0.5 g L^-1 de mannitol, 0.1 g L^-1 de peptona y 18 g L^-1 de agar), M3 (1 g L^-1 de almidón, 0.2 g L^-1 de peptona, 0.4 g L^-1 de extracto de levadura y 18 g L^-1 de agar), M4 (2.25 gL^-1 de mannitol, 1 gL^-1 de peptona y 18 g L^-1 de agar), M5 (2.25 g L^-1 de mannitol, 0.2 g L^-1 de casaminoácidos y 18gL^-1 de agar) y M6 (0.6 g L^-1 de triptona, 1 g L^-1 de casi-tona, 0.8 g L^-1 de glucosa y 18 g L^-1 de agar). Se adicionó ciclohexamida (100 μg mL^-1) y rifampicina (5 μg mL^-1) a cada medio de cultivo como agentes antimicótico y antibiótico, respectivamente.

Las cajas de cultivo se dejaron incubar por un periodo de tres a cuatro semanas hasta la aparición de colonias de actinobacterias. Las colonias de actinobacterias se pasaron a un nuevo medio de cultivo sólido: A1 (10 g L^-1 de almidón, 4g L^-1 de extracto de levadura, 2 g L^-1 de peptona y 18 g L^-1 de agar). Posteriormente, las cepas puras de actinobacterias se transfirieron a 10 mL de medio líquido A1 y se incubaron a 28 °C a 2100 rpm. Después de una incubación de 10 días, los cultivos se escalaron a 100 mL de medio A1 para la obtención de los extractos orgánicos.

Prueba de requerimiento de agua de mar para crecimiento

Todas las cepas de actinobacterias puras se inocularon en medio de cultivo A1 sólido preparado con agua destilada y desionizada (dd H₂O). Después de cuatro semanas de incubación, la presencia de una colonia bien formada y definida se consideró como indicador de no requerimiento de agua de mar para el crecimiento y, por lo tanto, como no perteneciente al género Salinispora. De forma contraria, la ausencia de una colonia se consideró como indicador de requerimiento de agua de mar para el crecimiento y, por lo tanto, como posiblemente perteneciente al género Salinispora.

Extracción de compuestos, ensayos de bioactividad y caracterización química

El procedimiento para la extracción de los cultivos bacterianos fue el siguiente en todos los casos. El medio de cultivo se filtró con la finalidad de separar la masa bacteriana de la fracción líquida del cultivo. La masa celular se extrajo con metanol absoluto (MeOH) y se mantuvo en constante agitación durante 24 h. El extracto se concentró por destilación a presión reducida hasta sequedad. El residuo líquido del medio de cultivo se extrajo mediante partición con 100 mL de acetato de etilo (AcOEt). La fase orgánica se concentró mediante destilación a presión reducida. A la fase acuosa se le agregó resina Amberlite XAD7HP (20 g L^-1 de cultivo) y se dejó en agitación constante por 24 h. Posteriormente, la amberlita se filtró y a la fracción sólida se le agregaron 100 mL de MeOH para la extracción de compuestos y se dejó en constante agitación por 3 h. Después, se eliminó la resina mediante filtración y se concentró el filtrado mediante destilación a presión reducida.

Los ensayos de actividad citotóxica y antimicrobiana se realizaron con los extractos de AcOEt y MeOH obtenidos. Para los ensayos de actividad citotóxica, se utilizaron tres líneas celulares diferentes: cáncer de mama (MCF7), cáncer de cérvix (HeLa) y cáncer de pulmón (H460).

Los ensayos contra la línea celular H460 se realizaron con el método descrito por Villareal-Gómez et al. (2010) para ensayos con líneas celulares de cáncer de colon HCT-116. En una placa de 96 pozos se realizó la dilución serial de los extractos con una concentración inicial de 10 mg mL^-1 hasta una concentración final de 20 μg mL^-1. Después de 72 h de incubación, se calculó el porcentaje de células viables con base en los valores de absorbancia a 490 nm. Los valores de actividad citotóxica fueron expresados como porcentaje de supervivencia y todos aquellos que presentaron menos del 50% de supervivencia de células H460 se consideraron activos.

Para los ensayos de las líneas celulares MCF7 y HeLa, se tomó como base el método descrito por Villareal-Gómez et al (2010) con la modificación de probar los extractos a una concentración final de 20 |ig mL^-1 sin dilución serial. Se utilizaron placas de 96 pozos a las que se les agregaron 100 | L de suspensión celular en medio de cultivo para líneas celulares RPMI (Roswell Park Memorial Institute) a una densidad de 5x 10³ cél por pozo. Posteriormente, se agregaron 20 de extracto diluido en dd H₂O (20 μg mL^-1 concentración final por pozo) por triplicado. Se utilizaron sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 10% como control positivo (0% de supervivencia), dd H₂O como control negativo (100% supervivencia) y medio RPMI como blanco. La placa se dejó incubar por 24 h en una atmósfera de 37 °C al 5% CO₂. Posterior al periodo de incubación, se cuantificó el porcentaje de células viables con el método colorimétrico de proliferación celular CellTiter (Promega). Este método permite cuantificar la cantidad de formazán producido por células metabólicamente activas, consideradas en este caso como viables. El valor de absorbancia a 495 nm es proporcional al número de células viables en cada pozo (Boletín Técnico Promega 2009). Se agregaron 20 μL de la solución reveladora CellTiter a cada pozo, y la placa se dejó incubar por 3 h bajo las condiciones de incubación antes descritas. La placa se procesó en un lector ELISA como una sola lectura, de donde se obtuvieron las absorbancias de cada pozo a 495 nm. El promedio de las absorbancias del control negativo se consideró el 100% de supervivencia; todos los extractos que presentaron en promedio un porcentaje de supervivencia menor que el 50% fueron considerados activos. La viabilidad de las células se corroboró con observaciones en el microscopio invertido Olympus Vanux-S del Departamento de Microbiología del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE). Se corroboró que en aquellos pozos en los que se calculó un porcentaje de supervivencia menor que el 50% existiera prueba física de lisis celular.

La actividad antimicrobiana se probó únicamente con los extractos en MeOH de la fase acuosa. Los extractos fueron diluidos en DMSO a una concentración final de 100 mg mL^-1 (Millán-Aguiñaga et al. 2010). Se utilizaron como agentes patógenos cepas de bacterias Gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii) y Gram-positivas (Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y Staphylococcus aureus), así como de la levadura Candida albicans.

Los patógenos fueron cultivados en placas de 96 pozos con medio de cultivo Caldo LB (Luria Broth) para las bacterias Gram-negativas, Caldo Soya Tríptica y Caldo YM (Yeast Mold) para las bacterias Gram-positivas y la levadura, respectivamente. Se utilizaron distintos antibióticos como control positivo y DMSO como control negativo. Las muestras y controles se probaron por triplicado. Después de 24 h de incubación, la placa se leyó en un lector de ELISA con un barrido simple dentro del intervalo de absorbancias de 405 a 620 nm (Millán-Aguiñaga et al. 2010). El intervalo de longitudes de onda utilizado en el ensayo se eligió con base en el principio de densidad óptica. Este principio considera que las células bacterianas son incoloras mas su crecimiento tiene como consecuencia el incremento de turbidez en el medio de cultivo; por lo tanto, se utilizaron aquellas longitudes de onda que permitieron detectar cambios de turbidez en los diferentes medios de cultivo. La actividad antimicrobiana se expresó en porcentaje de supervivencia bajo el mismo criterio de los ensayos de citotoxicidad. El promedio de las absorbancias del control negativo se consideró el 100% de supervivencia; todos los extractos que presentaron en promedio un porcentaje de supervivencia menor que el 50% fueron considerados activos.

Los extractos con actividad biológica (citotóxica y/o antimicrobiana) se analizaron mediante cromatografía líquida con detector de masas (LC-MS, por sus siglas en inglés) para la caracterización química inicial. Se utilizó un equipo Hewlett-Packard MSD 1100 con una columna C-18 RP y un gradiente de acetonitrilo:agua de 10-100%. Para cada muestra, se obtuvo un cromatograma, el espectro ultraviolta (UV) y el espectro de masas. Los pesos moleculares y las absorciones en el UV se utilizaron para identificar la presencia de compuestos previamente documentados y no documentados que tuvieran relación con la actividad biológica observada. Los pesos moleculares que no pudieron mostrar absorción en el UV fueron buscados en la base de datos Antimarin 707 Chem Finder para conocer si estos habían sido previamente descritos para actinobacterias marinas y relacionar su presencia con la actividad observada.

Diversidad de cepas bioactivas

La identificación genética de las cepas de actinobacterias con actividad biológica se realizó con el análisis del gen 16S del ARNr. El ADN de cada cepa se extrajo utilizando un kit de extracción para ADN (DNeasy Blood and Tissue Kit) y siguiendo el protocolo sugerido por el proveedor (Qiagen Inc., California, EUA). La amplificación del gen 16S del ARNr fue secuenciada con los cebadores FC27 (5'-AGAG-TTTGATCCTGGCTCAG-3') y RC1492 (5'-TACGGC-TACCTTGTTACGACTT-3'), con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C por 15 min seguida de 32 ciclos a 95 °C por 1 min, 61 °C por 1 min y 72 °C por 1 min, y la extensión final a 72 °C por 7 min (Becerril-Espinosa 2011, Gontang et al. 2007). Los productos de PCR fueron purificados con el kit QIAquickPCR siguiendo el protocolo indicado por el proveedor (Qiagen Inc.). Las secuencias se obtuvieron por SeqXcel Inc. (http://www.seqxcel.com/) con el uso de la técnica BigDye Terminator Cycle Sequencing Chemistry 3.1 del analizador Genetic Analyzer ABI Prism 3100 (Applied Biosystem). El intervalo de tamaño de las secuencias consideradas para el análisis filogenético fue de 500 a 700 pb (Becerril-Espinosa 2011).

La secuencia del gen 16S del ARNr de cada cepa se comparó con las secuencias disponibles en la base de datos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las secuencias fueron alineadas con los programas ClustalX y Bioedit con la opción de alineación manual. El árbol filogenético fue construido a un porcentaje de similitud entre secuencias del 97% con el algoritmo del vecino más cercano con 10,000 replicas en el programa Mega 5.0 (Becerril-Espinosa 2011).

 

Resultados

Abundancia de actinobacterias y diversidad de cepas bioactivas

Las cepas de actinobacterias fueron inicialmente clasificadas en tres grupos principales con base en su morfología y requerimiento de agua de mar (iones) para su crecimiento. En total, se aislaron 235 cepas de actinobacterias: 166 (71%) tipo Streptomyces, 26 (11%) tipo Micromonospora y 42 (18%) tipo Salinispora (fig. 1a).

Las cepas clasificadas como tipo Streptomyces se caracterizaron por la formación de colonias convexas con hifas desarrolladas y micelio filamentoso con esporas de colores gris y blanco y textura aterciopelada; estas características han sido previamente descritas para representantes de la familia Streptomycetaceae (Anderson y Wellington 2001; Lo et al. 2002; Sujatha et al. 2005; Bredholt et al. 2007, 2008). Las cepas que en la morfología de su colonia no mostraron desarrollo de hifas ni micelio filamentoso, y con textura sólida de color anaranjado y con esporas negras o anaranjadas, fueron clasificadas como tipo Micromonospora; estas características han sido previamente registradas para la familia Micromonosporaceae (Mincer et al. 2002; Jensen et al. 1991; Bredholt et al. 2007, 2008). Algunas de las cepas clasificadas como tipo Micromonospora presentaron estricto requerimiento de agua de mar para su crecimiento, característica descrita principalmente para el género Salinispora, por lo que fueron reclasificadas como tipo Salinispora (Maldonado et al. 2005a; Bredholt et al. 2007, 2008).

Debido a que la identificación genética fue prioritaria para aquellas cepas con potencial actividad biológica, no se obtuvieron resultados de la secuenciación parcial del gen 16S del ARNr para las cepas tipo Streptomyces. Se observó una alta correlación entre el sistema de clasificación con base en la morfología de las colonias y la identificación genética para las cepas tipo Micromonospora y Salinispora. Estudios previos en donde se compara la clasificación inicial con base en la morfología de las colonias y la identificación genética con base en la secuenciación del gen 16S del ARNr para diferentes cepas de actinobacterias han registrado un intervalo de compatibilidad del 90% al 95% (Jensen et al. 1991, Bredholt et al. 2007). En este estudio se observó una compatibilidad entre el 98% y 99%. Las cepas clasificadas morfológicamente como tipo Micromonospora y Salinispora fueron identificadas con un 97% de similitud con respecto a las secuencias representativas como miembros de estos géneros, con excepción de la cepa S-357 que fue identificada como perteneciente al género Verrucosispora (fig. 2).

En este estudio se observó una distribución específica de los grupos de actinobacterias encontrados: 96% de las cepas tipo Streptomyces fueron obtenidas de sedimentos de bahía Concepción, mientras que 79% de las cepas identificadas como Micromonospora, Salinispora y Verrucosispora fueron aisladas de sedimento de bahía de los Ángeles (fig. 1b).

Actividad biológica

Se obtuvieron 69 extractos crudos de las cepas identificadas como Micromonospora, Salinispora y Verrucosispora. En total, 17 (24%) extractos orgánicos (AcOEt) mostraron actividad biológica (citotóxica y antimicrobiana), de los cuales 15 tuvieron actividad citotóxica contra la línea celular MCF7 y 9 contra la línea celular HeLa. Ningún extracto orgánico mostró actividad citotóxica contra la línea celular H460. Los valores máximos de actividad observados fueron de 20-25% de supervivencia contra MCF7 (cepas S-365, S-355 y S-361) y de 24-25% de supervivencia contra HeLa (cepas S-165, S-361 y S-353). La fase acuosa (MeOH) de los extractos no mostró tener actividad citotóxica contra ninguna de las líneas celulares de cáncer probadas (tabla 2).

Con respecto a la actividad antimicrobiana, solamente tres extractos en su fase acuosa (MeOH) mostraron actividad contra el patógeno MRSA, con valores de actividad de 3%, 6% y 32% de supervivencia (cepas S-370, S-369 y S-355, respectivamente) (tabla 2).

Cincuenta y ocho por ciento de las cepas que presentaron los valores de actividad citotóxica y antimicrobiana más altos fueron recuperadas de bahía de los Ángeles e identificadas como pertenecientes al género Salinispora (tabla 2).

Caracterización química de los extractos

La aproximación inicial de la caracterización química de los extractos crudos consistió en corroborar la presencia de los compuestos previamente registrados para cepas marinas de los géneros Micromonospora y Salinispora que explicaran la actividad biológica observada.

Los cromatogramas obtenidos para los diferentes extractos (AcOEt y MeOH) mostraron patrones de señales claros y bien definidos para cada caso. Los extractos orgánicos mostraron la mayoría de las señales en un intervalo de tiempo de retención (TR) de 12 a 18 min con señales de 244 hasta 300 de relación masa/carga (m/z), mientras que los extractos acuosos mostraron valores TR de 19 a 19.8 min para la mayoría de las señales y valores de m/z 350 hasta 590.

Las señales del espectro UV tuvieron un porcentaje de similitud del 97-99% con compuestos antibióticos y antitumorales como la gramicidina D (TR = 11.7-12.92 min), clorotricina (TR = 14.62 min) y ciclosporina B y C (TR = 20.10 min), aislados previamente de Bacillus brevis, Streptomyces sp. y Bauveria nivea, respectivamente. También fueron identificadas señales correspondientes a compuestos aislados del género Streptomyces, como la baci-tracina (TR = 16.45 min), vancomicina (TR = 19.54 min) y nifitricina B (TR = 20.00 min).

La comparación de las m/z (que podían no tener señal UV) con base en el análisis de espectrometría de masas resultó mas útil para la caracterización inicial de los extractos crudos. Valores de peso molecular fueron observados repetitivamente en los diferentes espectros analizados, la mayoría correspondientes a compuestos previamente documentados para el género Streptomyces, como la mutamicina (m/z 491.536 correspondiente al ión molecular [M⁺]) obtenida de S. caespitosus. De igual manera, compuestos con actividad biológica documentados para distintas especies de Micromonospora también fueron detectados, como los antibióticos fortamicina AP, KE y AM, micinamicina (m/z 505.687 M⁺), gentamina (m/z 290.353 M+) y el inhibidor celular macquarimicina (m/z 370.496 M⁺), obtenidos de M. olivoasterospona, M. griseorubida y M. chalcea. Aunque la presencia de estos compuestos puede explicar la actividad observada de los extractos obtenidos de cepas de Micromonospora, éstos no han sido registrados anteriormente para cepas marinas.

 

Discusión

Abundancia de actinobacterias y diversidad de cepas bioactivas

Se ha documentado que el pretratamiento del sedimento (diluciones seriales y estampado en placa) puede influir en la recuperación de cepas y sobreestimar la abundancia de las cepas que realmente son metabólicamente activas en el medio marino, pues no se diferencia entre aquellas que se encuentran en estado latente en su medio (Becerril-Espinosa 2011, Becerril-Espinosa et al. 2012). Por lo tanto, se debe considerar que el número total de actinobacterias aisladas corresponde a la fracción cultivable de éstas en las muestras de sedimento y a aquellas que resultaron metabólicamente activas bajo las condiciones de cultivo utilizadas (Jensen et al. 1991, Takizawa et al. 1993).

Maldonado et al. (2009) realizaron un estudio en el golfo de California en el que se evaluó la diversidad y abundancia de actinobacterias con base en el análisis del gen 16S del ARNr. En su estudio identificaron nueve géneros de actinobacterias, incluyendo los géneros Micromonospora, Salinispora y Verrucosispora también encontrados en este estudio independientemente de la diferencia en el método de recolección y cultivo utilizados. La diferencia en las técnicas de aislamiento y cultivo de las cepas bacterianas y en las localidades muestreadas puede explicar la variación en la recuperación de ciertos géneros que existe entre el trabajo de Maldonado et al. (2009) y el presente estudio. Sin embargo, las técnicas selectivas de aislamiento y cultivo utilizadas en el presente estudio permitieron recuperar cepas con importante actividad biológica.

Las características ambientales de los diferentes sitios de muestreo (i.e., tipo de sedimento, distancia de la costa, profundidad) pueden explicar la distribución específica de las actinobacterias aisladas. Además, es con base en estas características que consideramos a los sitios de muestreo como representativos de los distintos ambientes que ocurren en la zona norte y zona sur del golfo de California. Por lo tanto, la diferencia en la abundancia y distribución de las cepas recuperadas en este estudio también la consideramos representativa de la diversidad de ambientes que ocurren en el golfo de California.

Se ha documentado que las actinobacterias del género Streptomyces son abundantes en sitios cercanos a la costa con influencia terrígena (Jensen et al. 1991, Takizawa et al. 1993, Moran et al. 1995). Las muestras de bahía Concepción fueron recolectadas en un ambiente somero donde el aporte de material terrígeno es abundante como consecuencia de los escurrimientos en la temporada de lluvias durante el verano y el aporte de sedimento por el viento (Rodríguez-Meza et al. 2009). Se ha documentado que representantes terrestres del género Streptomyces tienen una alta tolerancia a ambientes salinos. Bajo estas circunstancias, producen esporas resistentes que pueden ser transportadas al ambiente marino en donde permanecen latentes hasta que las condiciones ambientales favorecen su desarrollo (Jensen et al. 1991, Moran et al. 1995). La alta abundancia de cepas tipo Streptomyces en bahía Concepción puede deberse a su origen terrestre, así como a su capacidad de adaptación a los cambios de salinidad y otros factores físicoquímicos del ambiente somero costero marino (Jensen et al. 1991, Moran et al. 1995).

Las cepas Micromonospora y Salinispora fueron más abundantes en sitios alejados de la costa y de mayor profundidad donde la influencia terrígena es mínima, como ocurre en bahía de los Ángeles. En diferentes estudios se ha obtenido una mayor recuperación de estos géneros en muestras de sedimento profundo (≤100 m) (Jensen et al. 1991; Maldonado et al. 2005a, 2009; Jensen y Mafnas 2006). Estos géneros de actinobacterias se caracterizan por tener extrema tolerancia a condiciones de alta salinidad e incluso requerir estrictamente de los iones del agua de mar para su crecimiento (Jensen et al. 1991, Mincer et al. 2002, Jensen y Mafnas 2006). Estas características hacen referencia a su adaptación para vivir tanto en ambientes costeros, donde el gradiente de salinidad puede variar ampliamente, como en ambientes marinos, donde los valores de salinidad tienden a ser mas constantes (Jensen et al. 1991, Mincer et al. 2002). Las características ambientales de los sitios de muestreo explican la abundancia observada de estos dos grupos en bahía de los Ángeles.

Actividad biológica y caracterización química de extractos activos

Los extractos crudos son una mezcla de compuestos que son extraídos debido a su afinidad química durante el mismo tratamiento de separación. Rusnak et al. (2001) documentaron la extracción de una mezcla de compuestos aromáticos (similares a la gentamicina) con actividad antimicrobiana en contra de distintas cepas bacterianas Gram-positivas producidas por diferentes especies del género Micromonospora. La actividad biológica observada, por lo tanto, puede ser el resultado de un efecto sinérgico entre compuestos; sin embargo, también es posible que la actividad de un compuesto sea afectada por la presencia de otro, o que la actividad se deba al efecto de un compuesto en específico (Challis y Hopwood 2003). Por lo tanto, la falta de actividad y el amplio espectro de actividad observados pueden ser explicados por la naturaleza química de los extractos crudos.

La obtención de compuestos activos con AcOEt como disolvente en el método de extracción ha sido previamente registrada para cepas Micromonospora y Salinispora. En estos estudios previos los compuestos extraídos mostraron actividad antimicrobiana contra Candida albicans y Entero-coccus faecium, y actividad citotóxica contra la línea celular de cáncer de colon (HCT-116) (Mincer et al. 2002, Jensen et al. 2007). La obtención de compuestos activos se encuentra definida en gran parte por el método de extracción que se utilice; por ejemplo, la salinosporamida A fue extraída con resina amberlita XAD-16 eluído con acetona (Feling et al. 2003). Sin embargo, el grupo bacteriano con el que se realizó el presente trabajo tiene el potencial de producir una amplia gama de metabolitos secundarios, lo que incrementa la probabilidad de la obtención de compuestos bioactivos. Los miembros de la familia Micromonosporaceae, a la que pertenecen los géneros Micromonospora y Salinispora, se caracterizan por ser importantes productores de compuestos bioactivos con actividad citotóxica, como salinosporamida A obtenido de Salinispora tropica y las rifamicinas obtenidas de Micromonospora (Feling et al. 2003, Fenical y Jensen 2006, Eccleston et al. 2008).

El género Salinispora es un claro ejemplo del potencial de las actinobacterias para producir compuestos bioactivos. En este estudio se encontró que el 90% de los extractos bioactivos correspondían a cepas pertenecientes al género Salinispora. Este género es una fuente prolífica de metabolitos secundarios con una amplia diversidad estructural (Jensen et al. 2007, Udwary et al. 2007). Fenical y Jensen (2006) mencionan que el 80% de las cepas de este género muestran actividad antitumoral y 35% actividad antimicrobiana, independientemente de su origen geográfico. Se ha demostrado que la mayoría de las cepas de S. tropica producen los mismos dos compuestos, salinosporamida A y sporolida A, así como la mayoría de las cepas de S. arenicola producen compuestos de la familia de la rifamicina, estaurosporina y salicetal (Jensen et al. 2007, Udwary et al. 2007). Sin embargo, para identificar el tipo de compuestos relacionado con la actividad observada, se realizó la caracterización química inicial de los extractos obtenidos.

A pesar del alto porcentaje de similitud entre las señales UV obtenidas con los compuestos antibióticos y antitumorales descritos previamente para Bacillus brevis, Streptomyces sp. y Bauveria nívea, consideramos que éstos pueden no ser parte de los extractos crudos analizados. Esto, principalmente, se debe a la diferencia entre los géneros a partir de los cuales éstos compuestos fueron aislados originalmente y los géneros de los que fueron extraídos en este estudio. Se ha comprobado que la transferencia lateral de genes es un mecanismo que permite la adquisición de genes biosintéticos responsables de la producción de compuestos activos (Jensen et al. 2007). Sin embargo, en este estudio no existe prueba de este tipo intercambio génico que explique la producción de estos compuestos por los géneros de actinobacterias aislados.

Las señales de los cromóforos pueden ser muy similares entre compuestos sin distinción interespecífica. En este caso, el análisis espectrométrico de UV sólo fue útil como aproximación inicial al tipo de compuestos presentes en los extractos. Por esta razón, el análisis de masas resultó una mejor aproximación para identificar con mayor resolución la variedad de compuestos presentes en los extractos crudos. En este caso los pesos moleculares correspondientes a los compuestos identificados por UV no fueron detectados en el análisis de masas.

La producción de metabolitos secundarios específicos para S. arenicola y S. tropica ha sido comprobada independientemente de la diferencia geográfica de los sitios de aislamiento de las cepas de estas especies (Jensen et al. 2007). Sin embargo, los pesos moleculares de estos metabolitos no fueron identificados con el análisis de masas para poder explicar los altos valores de actividad biológica observados para estas cepas. Probablemente esto puede deberse a la variación de las rutas biosintéticas de los compuestos como consecuencia del uso de diferentes condiciones de cultivo (medios de cultivo). La purificación de los extractos crudos y el uso de técnicas para la elucidación estructural de éstos (i.e., resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X) serían necesarios para confirmar la hipótesis de la expresión de rutas biosintéticas alternas. Sin embargo, la aparente ausencia de los pesos moleculares de compuestos característicos y específicos previamente registrados para el género Salinispora permite hacer el planteamiento de nuevas hipótesis relacionadas con la naturaleza bioactiva de los extractos obtenidos en este estudio.

El aislamiento geográfico y las condiciones oceanográficas del golfo de California pueden ser factores que determinan la diversidad filogenética y metabólica asociada con la producción de metabolitos secundarios para las cepas del género Salinispora. Becerril-Espinosa 2011 identificaron, con base en el análisis filogenético de los genes policétido sintasa, la presencia de dominios cetosintasa asociados con la producción de nuevos compuestos activos para cepas del género Salinispora aisladas del golfo de California. Por lo tanto, la actividad observada en este estudio se puede deber a compuestos no registrados previamente para este género de actinobacteria.

Los resultados de este estudio demuestran que el golfo de California es una fuente potencial de cepas de actinobacterias productoras de compuestos con actividad biológica importante para la salud humana en la actualidad, además de su potencial como fuente de posibles nuevos compuestos bioactivos. Consideramos necesario el desarrollo de nuevas técnicas de cultivo y extracción de compuestos químicos, así como el desarrollo de estudios que describan el potencial de nuevos sitios para la recuperación de este tipo de microorganismos para continuar explorando las fronteras de la diversidad de compuestos activos que producen las actinobacterias y su aplicación biotecnológica.

 

Agradecimientos

El primer autor agradece la beca otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Se agradece a A Licea y a los miembros de su laboratorio en el Departamento de Biotecnología en CICESE (Ensenada, México) por su asistencia en la realización de los ensayos de actividad citotóxica, a W Gerwick y a los miembros de su laboratorio en el Centro para la Biotecnología Marina y Biomedicina (CBMB) del Instituto de Oceanografía Scripps de la Universidad de California en San Diego (SIO-UCSD), al Departamento de química de la Universidad de Hawaii por su apoyo en la realización de los ensayos de actividad citotóxica y antibiótica, y a P Jensen y miembros de su laboratorio (CBMB, SIO-UCSD) por su apoyo en la identificación genética de las cepas de actinobacterias y la caracterización química de los extractos.

 

References

Anderson AS, Wellington EMH. 2001. The taxonomy of Streptomyces and related genera. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 797-814.         [ Links ]

Becerril-Espinosa A. 2011. Actinobacterias aisladas del sedimento marino del Golfo de California y de Bahía Todos Santos: diversidad, bioactividad y dominios cetosintetasa. PhD thesis, Universidad Autónoma de Baja California, México, 114pp.         [ Links ]

Becerril-Espinosa A, Guerra-Rivas G, Ayala-Sánchez N, Soria-Mercado IE. 2012. Antitumor activity of actinobacteria isolated in marine sediment from Todos Santos Bay, Baja California, Mexico. Rev. Biol. Mar. Oceanogr. 47: 317-325.         [ Links ]

Bredholt H, Galatenko O, Engelhardt K, Fjaervik E, Terekhova L, Zotchev S. 2007. Rare actinomycete bacteria from the shallow water sediments of the Trondheim fjord, Norway: Isolation, diversity and biological activity. Environ. Microbiol. 9: 2756-2764.         [ Links ]

Bredholt H, Fjaervik E, Johnsen G, Zotchev SB. 2008. Actinomycetes from sediments in the Trondheim fjord, Norway: Diversity and biological activity. Mar. Drugs 6: 12-24.         [ Links ]

Bull AT, Stach JEM, Ward AC, Goodfellow M. 2005. Marine actinobacteria: Perspectives, challenges, future directions. Antonie Van Leeuwenhock 87: 65-79.         [ Links ]

Canino-Herrera SR, Gaxiola-Castro G, Segovia-Zavala JA. 1990. Efecto de procesos físicos sobre la variación de clorofila, seston y productividad primaria en la ensenada norte de bahía de los Ángeles (verano 1986). Cienc. Mar. 16(2): 67-85.         [ Links ]

Challis GL, Hopwood DA. 2003. Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Stremtomyces species. PNAS 100: 14555-14561.         [ Links ]

Charan RD, Schlingmann G, Janso J, Bernan V, FengX, Carter GT. 2004. Diazepinomicin, a new antimicrobial alkaloid from a marine Micromonospora sp. J. Nat. Prod. 67: 1431-1433.         [ Links ]

Davies J. 2006. Are antibiotics naturally antibiotics? J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33: 496-499.         [ Links ]

Eccleston G, Brooks P, Kurtboke I. 2008. The occurrence of bioactive Micromonosporae in aquatic habitats of the sunshine coast in Australia. Mar. Drugs 6: 243-261.         [ Links ]

Ensign JC. 1978. Formation, properties, and germination of actinomycete spores. Ann. Rev. Microbiol. 32: 185-219.         [ Links ]

Feling RH, Buchanan GO, Mincer TJ, Kauffman CA, Jensen PR, Fenical W. 2003. Salinosporamide A: A highly cytotoxic proteasome inhibitor from a novel microbial source, a marine bacterium of the new genus Salinispora. Angew. Chem. Int. Ed. 42: 355-357.         [ Links ]

Fenical W, Jensen PR. 2006. Developing a new resource for drug discovery: Marine actinomycete bacteria. Nat. Chem. Biol. 2: 666-673.         [ Links ]

Fenical W, Jensen PR, Palladino MA, Lam KS, Lloyd GK, Potts BC. 2009. Discovery and development of the anticancer agent salinosporamide A (NPI-0052). Bioorgan. Med. Chem. 17: 2175-2180.         [ Links ]

Gontang EA, Fenical W, Jensen PR. 2007. Phylogenetic diversity of Gram-positive bacteria cultured from marine sediements. Appl. Environ. Microbiol. 37: 3272-3282.         [ Links ]

Jensen PR. 2010. Linking species concepts to natural product discovery in the post-genomic era. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 37: 219-224.         [ Links ]

Jensen PR, Mafnas C. 2006. Biogeography of the marine actinomycete Salinispora. Environ .Microbiol. 8: 1881-1888.         [ Links ]

Jensen PR, Dwight R, Fenical W. 1991. Distribution of actinomycetes in near-shore tropical marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1102-1108.         [ Links ]

Jensen PR, Williams P, Dong-Chan O, Zeigler L, Fenical W. 2007. Species-specific secondary metabolite production in marine actinomycetes of the genus Salinispora. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1146-1152.         [ Links ]

Kwon HC, Kauffman CA, Jensen PR, Fenical W. 2006. Marinomycins A-D, antitumor-antibiotics of a new structure class from a marine actinomycete of the recently discovered genusMarinispora. J. Am. Chem. Soc. 128: 1622-1632.         [ Links ]

Lo CW, Lai NS, Cheah HY, Wong NKI, Ho CC. 2002. Asian review of biodiversity and environmental conservation. Http://www.arbc.com.my/pdf/art21julysep02.pdf.         [ Links ]

Magarvey NA, Keller JM, Bernan V, Dworkin M. 2004. Isolation and characterization of novel marine-derived actinomycete taxa rich in bioactive metabolites. Appl. Environ. Microbiol. 70: 7520-7529.         [ Links ]

Maier R, Pepper I, Gerba C. 2000. Environmental Microbiology. Academic Press, 585 pp.         [ Links ]

Maldonado L, Fenical W, Jensen PR, Kauffman C, Mincer T, A Ward A, Bull, Goodfellow M. 2005a. Salinispora arenicola gen. nov., sp. nov. and Salinispora tropica sp. nov., obligate marine actinomycetes belonging to the family Micromonosporaceae. Int J Syst Evol Micr. 55: 1759-1766.         [ Links ]

Maldonado L, Stach J, Pathom-aree W, Ward A, Bull A, Goodfellow M. 2005b. Diversity of cultivable actinobacteria in geographically widespread marine sediments. Antonie Van Leeuwenhoek 87: 11-18.         [ Links ]

Maldonado L, Fragoso-Yáñez D, Pérez-García A, Rosellón-Druker J, Quintana E. 2009. Actinobacterial diversity from marine sediments collected in Mexico. Antonie Van Leeuwenhoek 95: 111-120.         [ Links ]

Millán-Aguiñaga N, Soria-Mercado IE, Williams P. 2010. Xestosaprol D and E from the Indonesian marine sponge Xestospongia sp. Tetrahedron Lett. 51: 751-753.         [ Links ]

Mincer TJ, PR Jensen, Kauffman CA, Fenical W. 2002. Widespread and persistent populations of a major new marine actinomycete taxon in ocean sediments. Appl. Environ. Microbiol. 68: 5005-5011.         [ Links ]

Moran M, Rutherford L, Hodson R. 1995. Evidence for indigenous Streptomyces populations in a marine environment determined with a 16S rRNA probe. Appl. Environ. Microbiol. 61: 3695-3700.         [ Links ]

Prieto-Davó A, Fenical W, Jensen PR. 2008. Comparative actinomycete diversity in marine sediments. Aquat. Microb. Ecol. 52: 1-11.         [ Links ]

Rodríguez-Meza G, Shumilin E, Sapozhnikov D, Méndez-Rodríguez L, Acosta-Vargas B. 2009. Evaluación geoquímica de elementos mayoritarios y oligoelementos en los sedimentos de Bahía Concepción (BCS, México). Bol. Soc. Geol. Mex. 61: 57-72.         [ Links ]

Rusnak K, Troyanovich J, Mierzwa R, Chu M, Patel M, Weistein M. 2001. An antibiotic with activity against Gram-positive bacteria from the gentamicin-producing strain of Micromonospora purpurea. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 502-503.         [ Links ]

Sujatha P, Bapi Raju KVVSN, Ramana T. 2005. Studies on a new marine streptomycete BT-408 producing polyketide antibiotic SBR-22 effective against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Microbiol. Res. 160: 119-126.         [ Links ]

Surajit-Das P, Lyla S, Ajmal-Khan S. 2006. Marine microbial diversity and ecology: Importance and future perspectives. Curr. Sci. Vol. 98: 1325-1335.         [ Links ]

Takizawa M, Colwell R, Hill R. 1993. Isolation and diversity of actinomycetes in the Chesapeake Bay. Appl. Environ. Microbiol. 59: 997-1002.         [ Links ]

Udwary D, Zeigler L, Asolkar R, Singan V, Lapidus A, Fenical W, Jensen PR, Moore B. 2007. Genome sequencing reveals complex secondary metabolome in the marine actinomycete Salinispora tropica. PNAS 104: 10376-10381.         [ Links ]

Vernam A, Evans M. 2000. Environmental Microbiology. ASM Press, Washington DC, 160pp.         [ Links ]

Villarreal-Gómez LJ, Soria-Mercado IE, Guerra-Rivas G, Ayala-Sánchez NE. 2010. Antibacterial and anticancer activity of seaweeds and bacteria associated with their surface. Rev. Biol. Mar. Oceanogr. 45: 267-275.         [ Links ]

Ward AC, Bora N. 2006. Diversity and biogeography of marine actinobacteria. Curr. Opin. Microbiol. 9: 279-286.         [ Links ]