Introducción

El género Fusarium comprende algunos de los patógenos más importantes en la agricultura desde el punto de vista económico (^{Sumerell et al., 2010}), que además de su comportamiento fitopatógeno, en su proceso de infección sintetizan micotoxinas de alta toxicidad que generan problemas de salud humana y animal (^{Velarde et al., 2018}). En el cultivo de maíz, ocasiona la pudrición de la raíz, tallo y mazorca. Fusarium verticillioides probablemente sea la más común en el mundo; sin embargo, otras especies como F. subglutinans y F. proliferatum se asocian a la misma sintomatología (^{Leyva-Madrigal et al., 2014}) y han sido reportadas en la región del Bajío (^{Figueroa-Rivera et al., 2010}). La pudrición ocasionada por las especies de Fusarium en maíz difícilmente puede ser controlada con productos químicos, debido a distintos factores, principalmente la característica endofítica de la infección (^{Bacon et al., 2001}). La tendencia actual es la búsqueda de agentes bioprotectores o de biocontrol, a través del uso de microorganismos que permitan el combate de enfermedades fitopatógenas y presenten características asociadas a la promoción del crecimiento vegetal (^{Canchignia-Martínez et al., 2024}, ^{Bhattacharyya y Jha, 2012}). Diferentes estudios han demostrado que las infecciones ocasionadas por Fusarium en maíz pueden combatirse con agentes de biocontrol bacterianos (^{Bhargavi et al., 2024}; ^{Sánchez-Ceja et al., 2023}; ^{Ayala-Torres et al., 2023}; Leyva-Madrigal et al., 2014).

Respecto a lo anterior, ^{Figueroa-López et al. (2016}), analizaron una colección de bacterias para detectar la actividad potencial contra F. verticillioides. Los ensayos que realizaron in planta demostraron que tres aislados de Bacillus (B. megaterium, B. cereus sensu lato y Bacillus spp.) mostraron la mayor actividad antagonista, así como una reducción de la enfermedad. ^{Castro del Ángel et al. (2021}) evaluaron la actividad antifúngica de dos aislamientos endófitos de B. amyloliquefaciens contra F. verticillioides bajo condiciones de laboratorio e invernadero. La inhibición in vitro en cultivos duales del hongo fitopatógeno se obtuvo en un rango entre 59 al 62 %. Las bacterias endófitas redujeron la incidencia y severidad de F. verticillioides en más del 80 % en plantas que recibieron el tratamiento con respecto al testigo.

En los últimos años, nuestro grupo de investigación se ha centrado en la búsqueda de alternativas agrobiotecnológicas para el manejo de enfermedades y plagas de cultivos de interés en México. Se ha desarrollado un banco de rizobacterias asociadas a P. aculeata en ambientes de sequía y salinidad, lo que nos permitió disponer de un grupo bacteriano identificado molecularmente (^{Peñuelas-Rubio et al., 2024}b) con potencial antagonista (^{Herrera-Sepúlveda et al., 2023}) y de promoción del desarrollo vegetal de maíz (Argentel- Martínez et al., 2025), lo cual incentiva a analizar las capacidades microbianas de bioncotrol de estas especies. Por lo anterior, se tiene como hipótesis que estas rizobacterias además de promover el desarrollo vegetal, pueden biocontrolar el crecimiento micelial de Fusarium, partiendo de sus propiedades bioquímicas. También se realizan estudios de aislamiento de cepas de hongos del género Fusarium a partir de raíces de maíces criollos cultivados en distintos regímenes de riego (Peñuelas-Rubio et al., 2024a). En el contexto anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el potencial antagonista de rizobacterias contra cepas de Fusarium spp. asociadas a maíces criollos.

Desarrollo experimental

Colección de rizobacterias y hongos. Se emplearon nueve bacterias antagonistas y dos hongos asociados a raíces del cultivo de maíz que forman parte de la Colección de Microorganismos Edáficos y Rizosféricos del Instituto Tecnológico del Valle del Yaqui. Las bacterias que se utilizaron fueron Enterobacter cloacae (BA1; ON869243), Priestia megaterium (BA4; ON869245 y BA7B; ON869246), Staphylococcus warneri (BP5; MH1982281.1), Priestia endophytica (BP6; MT373518.1), Bacillus subtilis (TP1; MN538531.1 y TP2; MN756672.1), Sinomonas halotolerans (BA10-B; ON869249) y Staphylococcus hominis (TM6; MT585539.1) aisladas de la rizósfera de Parkinsonia aculeata en dos regiones geográficas del semi-desierto sonorense (^{Peñuelas-Rubio et al., 2024}). Estas rizobacterias mostraron capacidad antagónica contra cepas de Fusarium aisladas de raíces de tomate (datos no publicados).

Caracterización bioquímica de las rizobacterias. Se realizaron pruebas bioquímicas de hemólisis (^{Khalil et al., 2021}), producción de enzimas: quitinasas (^{Roberts y Selitrennikoff, 1988}), glucanasas (^{Teather y Wood, 1982}), proteasas (^{Jones et al., 2007}) y lipasas (^{Salwoom et al., 2019}; ^{Stead, 1984}), así como mecanismos de promoción de crecimiento vegetal (PCV): producción de sideróforos (^{Pérez-Miranda et al., 2007}), ácido indolacético (^{Gravel et al., 2007}) y solubilización de fósforo (^{Edi-Premono et al., 1996}; ^{Pikovskaya, 1948}). La caracterización bioquímica de PCV de las cepas BA1 y BA7B fue publicada en un trabajo anterior (^{Argentel-Martinez et al., 2025}).

Caracterización macro y microscópica de los hongos. Las cepas fúngicas se aislaron de raíces de maíces nativos Gavilán (Guanajuato) y Halcón (Michoacán) que mostraban síntomas (necrosis) asociados a la presencia de Fusarium spp. (^{Peñuelas-Rubio et al., 2024}). Se realizaron pruebas de patogenicidad mediante un ensayo de papel enrollado, reportado por ^{Leyva-Madrigal et al. (2014}), donde las cepas presentaron una severidad de 80 y 100 % según la escala de ^{Figueroa-Rivera et al. (2010}). En este estudio, se realizó una caracterización macro y microscópica de estas cepas. Para la evaluación del crecimiento macroscópico, se sembró un pedazo de micelio fresco (~5 mm de diámetro) en el centro de placas Petri estériles que contenían medio PDA (Papa Dextrosa Agar). Las placas se incubaron a 28 °C durante 10 días en condiciones de oscuridad parcial. Al término del periodo de incubación, se registraron las características morfológicas del crecimiento, incluyendo textura, color, forma y presencia de pigmentación tanto en el anverso (superficie superior del cultivo) como en el reverso (base del medio). Para la observación de estructuras fúngicas, se realizaron microcultivos colocando un pedazo de micelio fresco en el centro de una caja Petri que contenía medio PDA recién preparado. Sobre el inóculo se colocó cuidadosamente un cubreobjetos estéril. Los cultivos fúngicos se incubaron a 28 °C durante 5 días en condiciones de oscuridad parcial, permitiendo el desarrollo de estructuras reproductivas adheridas a la superficie inferior del cubreobjetos. Transcurrido el periodo de incubación, el cubreobjetos fue retirado con pinzas estériles y montado sobre un portaobjetos con una gota de azul de lactofenol como medio de montaje y tinción. Las observaciones se realizaron bajo un microscopio óptico compuesto (Primo Star, Zeiss, Alemania) a 40 y 100X (con aceite de inmersión), documentando las estructuras miceliales y conidiales características de cada cepa. Para ambos casos, las imágenes se capturaron con una cámara digital (MU-500, AmScope, Estados Unidos) bajo condiciones de iluminación estandarizada para asegurar la comparabilidad entre cepas (^{Riddell, 1950}).

Bioensayo de confrontación dual. Se siguió la metodología propuesta por ^{Khalil et al. (2021}), donde las rizobacterias fueron transferidas a agar Luria Bertani (LB) e incubadas a 30 °C por 24-48 h a 200 rpm. La suspensión bacteriana para inocular fue ajustada a 2x10⁸ CFU mL^-1. En el centro de cajas Petri con agar SNA (Spezieller Nährstoffarmer Agar) se colocó un plug del micelio del hongo (8 mm de diámetro) y a 2 cm de distancia se colocaron 5 μL de la suspensión bacteriana. Las placas fueron incubadas por cinco días a 28 °C.

Figura 1 Diagrama del ensayo de confrontación dual hongo-rizobacteria. a) Distribución de los microorganismos en la placa Petri; b-c) Características macroscópicas de las nueve bacterias [E. cloacae (BA1), P. megaterium (BA4 y BA7B), S. halotolerans (BA10B), S. warneri (BP5), P. endophytica (BP6), S. hominis (TM6), B. subtilis (TP1 y TP2)] y dos hongos (MC-03 y MC-05), respectivamente. 

Diseño experimental y análisis estadístico. Se empleó un diseño completamente aleatorizado, donde los hongos (MC-03 y MC-05) fueron confrontados con las nueve rizobacterias (BA1, BA4, BA7B, BP5, BP6, BA10B, TM6, TP1, TP2,) y dos controles: el control comercial (CC) a base de B. subtilis (Biosutil Bs a razón de 2 L Ha^-1; FIASA) y un control absoluto (CA; sólo hongo). Cada confrontación dual se realizó por triplicado. Se determinó el crecimiento micelial después de los 5 días de incubación a través de la medición radial del hongo (cm) con una regla milimétrica, determinando la distancia entre el crecimiento fúngico y bacteriano. Se realizó una prueba de homogeneidad y normalidad a los datos obtenidos de crecimiento micelial. Posteriormente, se realizaron ANOVA, basados en un modelo lineal de efectos fijos. Cuando se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre las medias del crecimiento micelial de los hongos por efecto de los tratamientos (rizobacterias), se empleó la prueba de comparación múltiple de medias de DMS. Para verificar la eficiencia del modelo matemático empleado se calculó el coeficiente de determinación (R²) sin ajustar. Se utilizó para estos análisis el software profesional STATISTICA para Windows, versión 14.0.

De acuerdo con la Cuadro 1, a excepción de BP6, todas las rizobacterias presentan actividad enzimática; ninguna rizobacteria fue positiva a la prueba de quitinasas. B. subtilis (TP1 y TP2) presentó la capacidad de sintetizar glucanasas y P. megaterium (BA4) producen proteasas. S. warneri (BP5), S. hominis (TM6) y B. subtilis (TP1) fueron más eficientes en la producción de lipasas. En cuanto a los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal (PCV), E. cloacae (BA1), S. halotolerans (BA10B) y B. subtilis (TP1 y TP2) producen sideróforos con mayor eficiencia. Sobre la capacidad de síntesis de auxinas (ácido indolacético), E. cloacae (BA1), P. megaterium (BA4 y BA7B) y BA10B (S. halotolerans) dieron positivo en la reacción de Salkowski, E.cloacae (BA1) presentó la mayor producción de auxinas, además, fue la más eficiente en la prueba de solubilización de fósforo. De manera general, TP1 (B. subtilis) presentó la mayor eficiencia en la producción de enzimas relacionadas con mecanismos de antagonismo fúngico. Estas especies bacterianas han sido reportadas por su potencial antagonista (^{Sallam et al, 2024}; ^{Biedendieck et al., 2021}).

De acuerdo con la caracterización macro y microscópica de las cepas fúngicas presentada en la Figura 2, se observó que la textura de las colonias fue algodonosa con micelio aéreo y el color a los 10 días de observación fue vináceo intenso (Figura 2A). Como características unicelulares se observaron estructuras conidiales propias del género Fusarium (Figura 2B y C). Para ambos hongos se encontraron macro y microconidios así como clamidosporas (^{SENASICA, 2020}).

Los resultados de la confrontación dual de la cepa MC-03 (Figura 3a) y MC-05 (Figura 3b), presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) entre las rizobacterias evaluadas respecto al crecimiento micelial de los dos hongos.

En la confrontación rizobacterias-MC-03 (Figura 3a), las cepas de B. subtilis (TP1 y TP2) fueron estadísticamente iguales y lograron la mayor inhibición del crecimiento micelial (23 %). Con el hongo MC-05, P. endophytica (BP6) y S. warneri (TM6) fueron estadísticamente superiores al resto de las rizobacterias al inhibir el 17 % del crecimiento micelial, seguidas por las dos cepas de B. subtilis (TP1 y TP2) que inhibieron un 10 y 7 % respectivamente. Aun cuando P. endophytica (BP6), no resultó positiva para las pruebas bioquímicas de antagonismo realizadas, destaca por su potencial en ambas confrontaciones, lo que sugiere la posibilidad de que esta rizobacteria presente otros mecanismos de inhibición de Fusarium spp. que no se consideraron en el presente estudio, como la producción de cianuro de hidrógeno (HCN) o actividad celulasa, amilasa y xilanasa (^{Sharma et al., 2023}). El análisis del coeficiente de determinación sin ajustar permitió inferir que por efecto de los tratamientos se obtuvo más de un 98 % de contribución a la variabilidad total del crecimiento micelial de los hongos. Por tanto, en estos mismos porcentajes promedio de la evaluación para los dos hongos fue la contribución del modelo matemático lineal de efectos fijos empleados para el procesamiento de los datos (Figura 3).

Figura 2 Caracterización morfológica de cepas fúngicas e Fusarium. A) Características macroscópicas de las cepas fúngicas: vistas de anverso (superior) y reverso (inferior) de placas Petri con medio PDA de 10 días después de la siembra; B y C) Estructuras miceliales y conidiales observadas mediante microscopía óptica a 40 y 100X (con aceite de inmersión), a partir de microcultivos de 5 días después de la siembra y teñidos con azul de lactofenol (^{Riddell, 1950}). 

Figura 3 Crecimiento micelial presentado por las cepas de Fusarium spp. MC-03 (a) y MC-05 (b) durante las confrontaciones duales con bacterias antagonistas. En el eje de las Y se presentan los tratamientos: CA: control absoluto; CC: control comercial; bacterias antagonistas: BA1 (E. cloacae), BA4 y BA7B (P. megaterium), BA10B (Sinomonas halotolerans), BP5 (S. warneri), BP6 (P. endophytica), TM6 (S. hominis), TP1 y TP2 (B. subtilis). 

En ambas confrontaciones, las rizobacterias E. cloacae (BA1), P. megaterium (BA4) y S. halotolerans (BA10B) y el control comercial (Biosutil Bs), propiciaron el crecimiento de ambas cepas fúngicas, posiblemente asociado a la capacidad de producción de compuestos que el hongo aprovecha para su crecimiento (^{Pangihotan, 2025}).

El control de hongos fitopatógenos mediante prácticas amigables con el medio ambiente se ha desarrollado con base en el uso de microorganismos antagónicos que, a través de mecanismos competitivos, antibiosis e inducción de resistencia, limitan su desarrollo. Este análisis sugiere que las rizobacterias tienen diferentes grados de efectividad en la inhibición de Fusarium spp., posiblemente relacionados con la producción de metabolitos secundarios específicos. Lo anterior representa un potencial antagonista relacionado con las características propias de las bacterias. Además, este estudio confirma que las rizobacterias presentan varios caracteres relacionados con la adaptación a regiones semiáridas, síntesis de fitohormonas, solubilización de fosfatos y síntesis de metabolitos secundarios (Peñuelas et al., 2024b). Finalmente, el ensayo muestra la importancia de explorar otras vías metabólicas de las rizobacterias, este enfoque permitiría la comprensión de sus mecanismos de acción y potencial para el control biológico. Además, se resalta la necesidad de confirmar la identificación del nivel especie de las cepas fúngicas evaluadas. Para ello, es fundamental realizar una caracterización utilizando marcadores moleculares y el cumplimiento de los postulados de Koch. Estas consideraciones abren la posibilidad de realizar futuras investigaciones que incluyan una modificación de las concentraciones de los inóculos bacterianos o la formación de consorcios entre las rizobacterias. Tales estrategias pueden incrementar su potencial antagonista, mejorando así su eficacia en el biocontrol de Fusarium.

Conclusiones

Las rizobacterias B. subtilis (TP1 y TP2), TM6 (S. hominis) y BP6 (P. endophytica), presentaron un efecto antagónico, ya que inhibieron el crecimiento micelial de las cepas de Fusarium spp. hasta un 23 % respecto al control absoluto y comercial. Los resultados obtenidos demuestran la existencia de variabilidad significativa de respuesta de los hongos ante las diferentes rizobacterias. El presente estudio establece las bases científicas preliminares para la obtención de un biofungicida con capacidades específicas de inhibición del crecimiento de los hongos estudiados.

Limitaciones. El presente estudio representa las bases para la selección de bacterias antagonistas que pueden probarse in planta en futuros ensayos.

Conflicto de interés. Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés en relación con este artículo.

Financiamiento. La realización de esta investigación fue sufragada por el proyecto “Rhizobacterias nativas y extractos vegetales como alternativas sustentables para el biocontrol de Fusarium asociado al cultivo de maíz (19252.24-P)” financiado por el Tecnológico Nacional de México.

Agradecimientos. Los autores agradecen al Tecnológico Nacional de México por el recurso financiero otorgado.

Contribución de los autores. Argentel-Martínez y Peñuelas-Rubio participaron en la investigación, conceptualización, validación, administración del proyecto y adquisición de fondos. Escritura, revisión y edición: Argentel-Martínez y Peñuelas-Rubio. Peñuelas- Rubio, Fierro-Coronado y Romo-Rodríguez desarrollaron la investigación, y metodología Cervantes-Ortíz y Arias-Moscoso elaboraron la escritura y preparación del borrador original. La escritura: revisión y edición estuvo a cargo de Peñuelas-Rubio. Argentel- Martínez realizó la escritura, revisión y análisis formal.