Introducción

La agricultura en México emplea fertilizantes que proveen nutrientes a los cultivos para aumentar la producción y calidad de los productos. Esto permite a los productores obtener un mayor rendimiento y en consecuencia mayor ingreso económico (^{SAGARPA, 2025}). En Sinaloa, el uso de fertilizantes químicos en la agricultura tiene una participación aproximadamente el 98 %. No obstante, además del costo económico que representa su adquisición, el uso excesivo de químicos tiene repercusiones ecológicas y ambientales (^{Debnath et al., 2020}).

Los biofertilizantes contienen microorganismos con capacidad de sintetizar compuestos químicos que promueven el crecimiento vegetal, ayudan a fijar el nitrógeno atmosférico, solubilizar o movilizar los nutrientes del suelo, un ejemplo es el hongo Trichoderma (^{Shahwar et al., 2023}). Los beneficios del uso de Trichoderma spp., incluyen la promoción del crecimiento y desarrollo vegetal mediante factores de crecimiento, disminución del pH del suelo, solubilización de componentes del metabolismo vegetal, y disminución de la contaminación del suelo por medio de la biorremediación (^{Rodríguez-García y Vargas- Rojas, 2022}). Se han sugerido diversos mecanismos para explicar cómo las especies de Trichoderma favorecen el crecimiento vegetal. Entre ellos se encuentra la biosíntesis de metabolitos secundarios, lo que promueve la producción de enzimas como la xylanasa, celulasa y glucanasa, la solubilización de fósforo que sintetiza el ácido indol-acético y la promoción del crecimiento de raíces y tallos vegetales, así como el aumento de la tasa del metabolismo de carbohidratos, fotosíntesis y mecanismos de defensa de las plantas (^{Contreras-Cornejo et al., 2024}).

Además, Trichoderma actúa como control biológico al combatir bacterias, hongos y nematodos fitopatógenos por diversos mecanismos como la competencia por sustrato y espacio, antibiosis, antagonismo, micoparasitismo, reconocimiento, crecimiento quimiotrófico, actividad lítica y la promoción de resistencia sistémica inducida en plantas (^{Yao et al., 2023}; ^{Sánchez-Rivera et al., 2025}). En México se reproduce y comercializa a

T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. asperellum, T. longibrachiatum, T. virens, T. lignorum y T. aureoviridae como agentes de control biológico (^{Allende-Molar et al., 2022}; ^{SENASICA, 2025}). Se destaca el uso de especies certificadas del género Trichoderma que se utilizan con fines biotecnológicos en la formulación de biofertilizantes las cuales son: T. harzianum, T. viride, T. asperellum, T. virens, T. atroviride, T. gamsii, T. hamatum y T. polysporum. La mayoría de los biofertilizantes se preparan a base de T. viride, T. virens y en mayor proporción T. harzianum (^{Hernández-Melchor et al., 2019}; ^{Yao et al., 2023}). La empresa Humisol Orgánico S.A. de C.V. produce y comercializa el biofertilizante líquido BioHumisol®, el cual de acuerdo a su etiqueta contiene bacterias anaeróbicas y nitrificantes; no obstante, se desconocen las especies de Trichoderma presentes en el producto comercial. El biofertilizante BioHumisol® se emplea en cultivos como berries, espárrago y hortalizas. Debido a que no se cuenta con una cepa certificada y se desconoce la especie de Trichoderma presente en este biofertilizante fue necesaria su caracterización cultural, morfológica, morfométrica y molecular (^{Biohumisol, 2025}). Por tanto, este trabajo tuvo como objetivo identificar cultural, morfológica, morfométrica y molecularmente las especies de Trichoderma presentes en el biofertilizante líquido comercial BioHumisol® de uso agrícola en Culiacán y Navolato, Sinaloa, México.

Desarrollo experimental

Muestreo, aislamiento, purificación y conservación. El muestreo se llevó a cabo en la empresa Humisol Orgánico S.A de C.V. ubicada en la Cofradía de San Pedro, Navolato, Sinaloa, México donde se produce el biofertilizante líquido BioHumisol® (registro RSCO- 381/X/21), y se comercializa en los municipios de Culiacán y Navolato en Sinaloa. Para el aislamiento de los hongos, se preparó una solución madre de la producción final, para ello se tomaron 50 mL del biofertilizante líquido y se vació en un frasco de vidrio con 450 mL de agua destilada estéril y se agitó durante 30 s (solución madre). Posteriormente, se realizaron seis diluciones seriadas (10-1 hasta 10-6), tomando 1 mL a partir de la solución madre y se colocó en un tubo de vidrio con 9 mL con agua destilada estéril, después, se agitó durante 30 s en un vórtex (Cis-Lab, México) para homogenizar solución (Suárez- Palacios et al., 2023). Partiendo de esa suspensión se realizaron diluciones seriadas hasta 1 x 10-6. Adicionalmente, se colocó 100 µL de la suspensión de conidios en cajas Petri con medio de cultivo Agar papa dextrosa (Bioxon®) adicionado con ácido láctico (PDA-AL), se homogenizó la suspensión de conidios utilizando perlas de vidrio de 0.8 mm estériles. Las cajas Petri se sembraron por triplicado por cada dilución, se incubaron a (±) 28° C durante cuatro días en una incubadora (Ecoshel, USA) (^{Savín-Molina et al., 2021}). La purificación se llevó a cabo mediante la técnica de punta de hifa (^{Cuervo-Parra et al., 2024}). Una vez obtenidos los cultivos por punta de hifa, se tomaron discos miceliales con un sacabocados de 5 mm y se conservaron en tubos de 1.5 mL con agua destilada estéril (método Castellani) y se almacenaron a 4 °C hasta su posterior uso (^{Fernández et al., 2013}).

Identificación cultural, morfológica y morfométrica. Para la identificación cultural, morfológica y morfométrica se utilizaron tres cajas Petri con crecimiento fúngico por aislado, se registraron las características de color, forma del micelio y disposición en el medio de cultivo, días de esporulación, tamaño y forma de conidios, fiálides y clamidosporas (^{Ynfante-Martínez et al., 2023}). Las estructuras se observaron mediante una cámara digital (Dino-Lite) acoplada al microscopio compuesto serie CxL (Labomed®) (^{Sánchez-Hernández et al., 2018}). Las mediciones de conidios, fiálides y clamidosporas (n=50) se realizaron en el software (Dino Capture 2.0) (^{Zainudin et al., 2023}). Las características culturales, morfológicas y morfométricas fueron comparadas con las características taxonómica reportadas por ^{Barnett y Hunter (1998}) y ^{Samuels y Hebbar (2015}). Además, se determinó la tasa de crecimiento micelial de las cepas mediante una medición continua de las placas de Petri con medio de cultivo PDA-AL incubadas a (±) 28 °C bajo las condiciones de 12 h luz/12 h oscuridad durante cuatro días. La tasa de crecimiento micelial se calculó midiendo el diámetro del crecimiento radial en direcciones perpendiculares con un vernier cada 24 h durante cuatro días. La tasa de crecimiento se expresó en mm/día (^{Samaniego et al., 2018}).

Identificación molecular. Se utilizaron tres cajas Petri con crecimiento fúngico libre de contaminación por aislado, el micelio se raspó con espátula estéril de cajas Petri que contenían 7 días de crecimiento fúngico en medio de cultivo PDA-AL. Luego, se depositaron 150 mg del micelio en tubos estériles de 1.5 mL. Posteriormente, se realizó la extracción de ADN fúngico siguiendo las instrucciones del fabricante del Kit comercial ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep® (Zymo Research, USA) (^{Manfredini et al., 2025}). Para verificar la concentración y pureza del ADN de las muestras se determinó con un espectrofotómetro (QIAxpert, QUIAGEN®) y se verificó su integridad mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Las muestras de ADN se almacenaron en un ultracongelador a -80 °C hasta su posterior uso (^{Matas-Baca et al., 2022}). La Región Espaciadora Transcrita Interna (ITS) fue amplificada utilizando los iniciadores ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') e ITS5 (5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3')

de acuerdo con las siguientes condiciones de amplificación: Desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, seguido de 29 ciclos con desnaturalización a 94 °C durante 30 s, alineamiento a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 45 s con una extensión final a 72 °C durante 5 min (^{Ríos et al., 2016}).

Además, se amplificó el gen Factor de Elongación 1 alfa (TEF-1 α) de los aislamientos ATV y ATB utilizando los iniciadores: EF1-728 (5'CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3') y TEF1R (5'GCCATCCTTGGGAGATACCAGC3') con las siguientes condiciones de amplificación: Desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min, seguido de 29 ciclos con desnaturalización a 94 °C durante 30 s, alineamiento a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min con una extensión final a 72 °C durante 10 min (^{Lee et al., 2020}). La amplificación se realizó en un Termociclador Biorad C1000 con un volumen final de 25 µL (^{Samuels et al., 2002}; ^{García-Nuñez et al., 2017}). Se verificó la integridad de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % teñido con Bromuro de Etidio, y el gel se visualizó en un fotodocumentador UV (Axygen™, USA) (Lee et al., 2020).

El producto de PCR obtenido fue purificado y secuenciado mediante el método de Sanger y enviados a la Unidad de Genómica Avanzada de LANGEBIO, Cinvestav, Irapuato. Las secuencias obtenidas se analizaron en el programa BioEdit (^{García-Nuñez et al., 2017}) y se enviaron a GenBank con los siguientes números de accesión: PP956784, PP956785, PP968400 y PP968399; posteriormente, se compararon con otras secuencias de la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (^{NCBI, 2024}).

Análisis filogenético. Las secuencias parciales de nucleótidos de la región ITS y el gen TEF-1α se alinearon con secuencias de referencias obtenidas del GenBank y las relaciones filogenéticas se infirieron basándose en un alineamiento múltiple mediante el programa MAFFT (^{Vences et al., 2022}). Las secuencias se concatenaron con el programa Mesquite versión 3.8. El árbol filogenético se construyó con el método de máxima verosimilitud e inferencia Bayesiana, para determinar los valores de confianza para los clados dentro del árbol resultante, se realizó un análisis bootstrap con 1000 réplicas, utilizando el modelo de sustitución TPM2+F+G4 en IQTREE y se visualizó en FigTree versión 1.4.4 (^{Zhao et al., 2024}). Las secuencias utilizadas en el análisis filogenético se muestran en el Cuadro 1. Como grupo externo se utilizó una secuencia de Fusarium oxysporum (número de acceso GenBank: OR734798 y ON316841).

Identificación cultural, morfológica y morfométrica. Este estudio aporta la identificación cultural, morfológica, morfométrica y molecular de dos aislamientos con características similares a Trichoderma ATV y ATB, a partir del biofertilizante líquido de uso agrícola BioHumisol®. Después de cuatro días, las colonias consistieron en micelio con textura polvoso de color blanco que se volvió verde con la edad, se observó esporulación abundante y crecimiento radial. La tasa de crecimiento radial diaria en promedio de los dos aislados durante cuatro días fue de 26, 57, 84 y 90 mm. Las colonias fúngicas presentaron características morfológicas tales como conidióforos hialinos, ramificados, no verticilados, fiálides simples o en grupos con ramificaciones terminales, conidios color turquesa, unicelulares, ovoides y clamidosporas subglobosas intercalares y terminales (Figura 1). Los conidios (n=50) midieron de 3.6-5.09 × 3.27-6.41 µm, las fiálides (n=50) midieron de 4.1-

6.2 × 9.7-15.3 µm y el tamaño de las clamidosporas fueron de 21.41 × 21.72 µm. Con base a las características culturales, morfológicas y morfométricas los dos aislados se identificaron tentativamente como Trichoderma de acuerdo a las claves taxonómicas de ^{Barnett y Hunter (1998}) y ^{Samuels y Hebbar (2015}).

El tamaño de los conidios coincide con lo reportado para T. asperellum (^{Calle-Cheje et al., 2023}); no obstante, en este estudio los conidios presentaron tamaño superior con respecto a otros estudios sobre caracterización morfológica de T. asperellum (^{Sebumpan et al., 2022}; ^{Andrade-Hoyos et al., 2023}). Trichoderma se utiliza ampliamente como biofertilizante y bioplaguicida en la agricultura mexicana en distintos cultivos de importancia económica por sus distintos mecanismos de acción; T. asperellum se emplea en bioformulaciones en México, especie que presenta variedad morfo-cultural (^{Andrade- Hoyos et al., 2023}). Además, ^{Foyate (2023}) reportó la diversidad de caracteres morfológicos como la pigmentación, tamaño, forma de conidios y fiálides. Esta variabilidad morfológica puede deberse al tipo de formulación de los productos comerciales. Por otra parte, la variabilidad morfo-cultural dificulta la identificación precisa de Trichoderma sp. por lo que se requiere del uso de distintas claves taxonómicas e identificación molecular (^{Ynfante-Martínez et al., 2023}).

Figura 1 Morfología de aislamientos de Trichoderma asperellum. A) Caja Petri con siete días de crecimiento en PDA-AL a) anverso, b) reverso; B-D) Conidióforos con fiálides y conidios en racimos; E) Hifas y conidios y F) clamidosporas. 

Identificación molecular. Las secuencias de los aislados ATV y ATB se depositaron en GenBank (ITS, PP956784, PP956785; TEF 1-α, PP968400 y PP968399). El análisis

BLAST de las secuencias parciales de ITS (549 pb y 588 pb) mostró una similitud de 99

% con los aislamientos de T. asperellum (KY750369, KY750373) y las secuencias parciales de TEF 1-α (631 pb y 624 pb) mostró una similitud de 100 % con T. asperellum (JQ040494, KP747448). El árbol filogenético obtenido con las secuencias concatenadas de este estudio y otras secuencias basadas en especies de Trichoderma pertenecientes a diferentes clados, muestra que los aislados obtenidos del biofertilizante BioHumisol® pertenecen al clado Viride (Figura 2).

Figura 2 Árbol filogenético basado en secuencias parciales concatenadas de ITS y TEF 1-α de especies de Trichoderma. El árbol se construyó utilizando el método máxima verosimilitud e inferencia Bayesiana con 1000 réplicas, las probabilidades posteriores bayesianas (PP>0.5) y valores de Bootstrap (BS>50) se muestras en los nodos. Las secuencias de este estudio se encuentran en negrita. Como grupo externo se utilizó Fusarium oxysporum (número de acceso GenBank: OR734798 y ON316841). 

Actualmente, para una correcta identificación se requiere la caracterización cultural, morfológica, morfométrica completada con la caracterización molecular. Existen diversos estudios sobre la caracterización molecular de T. asperellum utilizando la región génica ITS (^{Ma et al., 2020}; ^{Sehim et al., 2023}). En el presente estudio, el porcentaje de homología con T. asperellum utilizando ITS fue de 99 %; reportes de estudios moleculares empleando la región ITS mencionan una similitud del 98 % (número de acceso de GenBank: MN950427) de la especie nativa de Trichoderma asperellum aislada de suelo en Guasave, Sinaloa, México (^{Matas-Baca et al., 2022}). En México, la identificación molecular de T. asperellum se basa principalmente en la región ITS y el gen TEF-1α (^{Allende-Molar et al., 2022}). El marcador universal para la identificación molecular en hongos es la región ITS (^{Maldonado-Bonilla et al., 2024}); sin embargo, no permite distinguir la variabilidad entre especies relacionadas y presenta baja resolución en especies de Trichoderma (^{Samuels et al., 2002}); por lo que este género se ha clasificado como notoriamente difícil de identificar, por lo tanto se sugiere el uso de más de un gen para aumentar la especificidad y proporcionar mayor robustez a la identificación molecular (Samuels y Hebbar, 2015). Un gen ampliamente utilizado para la identificación molecular de Trichoderma es TEF-1α ya que permite evaluar la precisión y robustez de los marcadores génicos empleados en hongos y así identificar especies no descritas anteriormente. Se ha reportado que el gen TEF-1 α tiene alta eficacia filogenética debido a su mayor relación con la identificación de especies desconocidas y su alienabilidad entre las especies de Trichoderma (^{Hewedy et al., 2020}). De acuerdo con ^{García-Nuñez et al. (2017}) el porcentaje de identidad para la identificación molecular de T. asperellum utilizando la región TEF-1 α fue del 99 %, además sugieren que el análisis filogenético es más preciso si se utiliza la región ITS y el gen TEF-1 α. Este análisis se debe complementar con la caracterización morfológica para una identificación confiable. La identificación molecular de Trichoderma requiere del uso de uno o más de marcadores: ITS, TEF1, ACT, CAL, ACL1, CHI18-5 y RPB2, así como el análisis filogenético. Basado en este análisis el género que se agrupa en 24 clados (Samuels y Hebbar, 2015), donde destacan los clados Harzianum, Viride, Virens y Longibrachiatum (^{Rodríguez et al., 2021}).

El clado Viride agrupa el mayor número de especies (54 especies), las cuales son similares en morfología como T. asperellum, T. asperelloides y T. viride (^{Samuels y Hebbar, 2015}; ^{Allende-Molar et al., 2022}). El árbol filogenético basado en los marcadores ITS y TEF-1 α confirma que T. asperellum aislado del biofertilizante Biohumisol® producido por la empresa Humisol Orgánico S.A de C.V. pertenece al clado Viride, especie que se ha reportado dentro de este clado (Samuels y Hebbar, 2015). Los aislamientos obtenidos en la presente investigación están genéticamente relacionados con otras especies de T. asperellum en comparación con otras especies agrupadas dentro del mismo clado (T. atroviride y T. composticola). De acuerdo con ^{Sánchez-Miranda et al. (2021}) el análisis filogenético permite relacionar diversas especies nativas de Trichoderma incluyendo a T. asperellum aisladas de diferentes cultivos y procedentes de diferentes localidades. La cercanía genética entre secuencias de Trichoderma aisladas de diferentes localidades geográficas puede deberse a las regiones genéticas empleadas ya que son altamente conservadas entre especies, lo que genera alta homología incluso en aislamientos geográficamente distantes, además este género es cosmopolita y tiene alta adaptabilidad ecológica, lo que facilita su dispersión a nivel global.

Conclusiones

La caracterización cultural, morfológica, morfométrica (cuyas mediciones en promedio de fialides fue de 4.1-6.2 × 9.7-15.3 µm, conidios fue de 3.6-5.09 × 3.27-6.41 µm y clamidosporas fue de 21.41 × 21.72 µm) y molecular de cepas de Trichoderma aisladas del biofertilizante líquido Biohumisol® de uso agrícola en Culiacán y Navolato, Sinaloa, México permitió identificar a Trichoderma asperellum. La importancia de esta especie a nivel biotecnológico respalda la eficiencia del biofertilizante líquido Biohumisol® en la agricultura regional. Además, la integración de métodos morfológicos y moleculares garantiza una identificación precisa, lo que es fundamental para el desarrollo de estrategias sostenibles de manejo agrícola basadas en microorganismos nativos con alta capacidad adaptativa.