Introducción

El cultivo del café en México es una actividad estratégica por su importancia económica, sociocultural y ambiental (^{Escamilla, 2021}). La superficie destinada, el volumen de comercialización y el número de productores dedicados a su cultivo, han dado lugar a regiones reconocidas a nivel nacional e internacional como Chiapas, Veracruz, Oaxaca, Puebla y Guerrero (SIAP, 2022), lo que les ha concedido reputación, tradición e identidad (^{Nava-Tablada, 2012}). No obstante, el sector enfrenta desafíos significativos, siendo la roya del café (Hemileia vastatrix) su principal amenaza fitosanitaria. La crisis de 2012- 2013 provocó pérdidas cuantiosas, afectando más de 100 mil hectáreas y reduciendo la producción nacional en un 50 % (^{Boudrot et al., 2016}). Por tal motivo, la roya es una enfermedad de relevancia internacional, nacional y regional (^{Chambe, 2020}), por lo que en México está sujeta a control oficial (^{Haddad et al., 2009}).

La infección se manifiesta por manchas amarillas en el envés de las hojas, provocando su caída prematura, desecación de las ramas e incluso la muerte de las plantas (Quispe- Apaza et al., 2021). Esto afecta negativamente la calidad de los granos y reduce los rendimientos, hasta un 40 % (^{Alvarado-Castillo et al., 2017}; ^{Escamilla, 2021}). En el control de la enfermedad se ha utilizado principalmente fungicidas sistémicos y de contacto, formulados a base de cobre (^{Avelino et al., 2015}; ^{Haddad et al., 2009}; ^{Ramírez-Rodríguez et al., 2020}), que, aunque efectivos, presentan riesgos para la salud humana y el ambiente, debido a su manipulación directa, efectos residuales y contaminación del suelo, aire y agua; además, implican altos costos y riesgo de desarrollo de resistencia (Ramírez-Rodríguez et al., 2020).

Ante esta situación, una estrategia promisoria es la utilización de microorganismos antagonistas tales como Lecanicillium lecanii y Trichoderma spp. (^{Michel-Aceves et al., 2019}) reconocidos por su capacidad para actuar como agentes beneficiosos en la agricultura (^{Alfonso et al., 2005}). Este último es particularmente eficaz debido a su rápida colonización de la rizosfera, promoción del crecimiento vegetal y múltiples mecanismos de acción, como el parasitismo, la competencia, la inducción de resistencia sistémica (RSI) y absorción de nutrientes, especialmente fósforo (^{Harman et al., 2004}; ^{Aswani et al., 2022}; ^{Yao et al., 2023}). Cabe destacar que, aunque el patógeno es foliar, aplicar Trichoderma al suelo puede desencadenar respuestas sistémicas que modulan la severidad en la parte aérea, lo que posiciona a este organismo como un candidato prometedor para el biocontrol de la roya (Aswani et al., 2022; ^{Sharma et al., 2022}).

En este sentido, la detección temprana y precisa de la enfermedad es crucial para la aplicación adecuada de los agentes fitosanitarios, predecir pérdidas y pronosticar epidemias. En el caso de la roya, se han desarrollado escalas diagramáticas basadas en estimaciones visuales para evaluar la gravedad de la enfermedad, siendo importantes en la toma de decisiones (^{Barbedo, 2014}). Por ejemplo, CENICAFÉ en Colombia desarrolló diagramas con 15 niveles de severidad que van del 0.05 al 80.0 % (^{López-Vásquez et al., 2018}), Brasil con seis (2.5, 5, 10, 20, 40 y 80 %) (^{Capucho et al., 2011}) y en México, SENASICA estableció siete categorías del daño que van del 0 al 70 % (^{Calderón, 2016}). Sin embargo, estas estimaciones pueden ser subjetivas y depender de la experiencia del evaluador, lo que genera imprecisiones (^{Avelino et al., 2015}).

Por ello, la evaluación de enfermedades ha avanzado hacia el uso de análisis de imágenes digitales, agilizando el proceso y proporcionando estimaciones precisas (^{Bock et al., 2020}; ^{Gallego-Sánchez et al., 2020}; ^{Mutka y Bart, 2015}). Algunos softwares utilizados

son ImageJ con el script rust (^{Schneider et al., 2012}), Quant (^{Bock et al., 2020}) y R-Studio con el paquete Pliman (^{Olivoto et al., 2022}). Estos programas analizan los valores de los colores rojo, verde y azul (RGB) de fotografías digitales para cuantificar el área foliar afectada por enfermedades de manera objetiva (Bock et al., 2020). No obstante, su aplicación para cuantificar la roya del café no ha sido reportada en la literatura. Por ello, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto de la aplicación al suelo de Trichoderma spp. sobre la severidad de H. vastatrix en café, utilizando el paquete Pliman en R-Studio como herramienta para su cuantificación.

Materiales y Métodos

Área de estudio. El experimento se llevó a cabo en la finca Los Barreales, ubicada en el municipio de Teocelo, Veracruz (19°23'37.3" N, 96°59'01.0" O; 19°23'39.7" N, 96°59'12.4" O), desde abril de 2022 hasta febrero de 2023.

Material biológico. Se emplearon las cepas T. harzianum (IE-996) y T. asperellum (TA- 3) obtenidas del cepario del Instituto de Ecología A.C. (INECOL) y de la Universidad Veracruzana campus Tuxpan, respectivamente. Éstas se cultivaron en Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (Bioxon®) bajo condiciones asépticas y oscuridad durante cinco días a una temperatura de 26 °C. Las plantas de café (C. arabica) utilizadas fueron de la variedad Catuaí Amarillo con una edad de ocho años con manejo convencional.

Producción de inóculo. La obtención masiva de Trichoderma spp. se realizó usando arroz como sustrato, siguiendo el método de ^{Michel-Aceves et al. (2008}) con modificaciones. Para ello, 3 kg del grano se lavaron con agua corriente y se hidrataron durante 20 minutos en 5 L de agua con 1.25 g de cloranfenicol (Lebrocetin®) para prevenir contaminación bacteriana. Tras escurrir el exceso de agua, se pesaron porciones de 350 g y se envasaron en bolsas de polipropileno para su esterilización bajo condiciones convencionales, durante 30 minutos. Una vez que el sustrato se enfrió a temperatura ambiente, se inoculó con una suspensión de conidios obtenida de cultivos en PDA, previamente ajustada a una concentración de 1×10⁷ conidios mL⁻¹ mediante el uso de una Cámara de Neubauer. Bajo condiciones estériles, se inyectaron 20 mL de esta suspensión en cada bolsa. Éstas se incubaron a 25 ± 2 °C durante 21 días, agitándose cada 72 h para favorecer una esporulación homogénea. Finalmente, el arroz colonizado se lavó con agua destilada estéril, adicionada con TWEEN 80 al 0.01 %, filtrando el líquido con un tamiz de malla No 20 (0.850 mm). A partir de esta suspensión, se ajustaron las concentraciones finales para los tratamientos de campo: 1x108 (C1) y 1x1012 (C2) conidios mL⁻¹. Las soluciones se almacenaron en contenedores de 500 mL hasta su aplicación (^{Martínez et al., 2008}; ^{Yáñez-Hernández et al., 2023}).

Diseño experimental. Se empleó un diseño de bloques al azar con arreglo factorial 3x2x2, cuyos factores fueron: 1) Cepas: T. harzianum (Th), T. asperellum (Ta) y un consorcio (Th_Ta) (mezclando volúmenes iguales de las suspensiones de Th y Ta en la concentración correspondiente), 2) Concentraciones: 1x10⁸ (C1) y 1x10¹² (C2) conidios mL⁻¹ y 3) Estado sanitario inicial de la planta: Sintomática (con pústulas de H. vastatrix) y Asintomáticas (sin pústulas visibles), resultando 12 tratamientos. Adicionalmente, se incluyeron dos controles: un testigo (T), que recibió agua estéril, y un blanco (B), que correspondió al manejo convencional del productor, totalizando 14 tratamientos. Cada tratamiento, se tuvo tres repeticiones (plantas de café), dando un total de 42 unidades experimentales. Para minimizar la interferencia, se dejó una calle de plantas sin inocular entre cada tratamiento. Cada planta recibió 1 L de la suspensión correspondiente, aplicado directamente al suelo en la zona de goteo, cada dos meses durante un año (seis aplicaciones en total). Dado que el ensayo se condujo en condiciones de campo sin barreras físicas, se permitió la dispersión natural del patógeno. Esta condición permitió evaluar la eficacia de los tratamientos bajo una presión de inóculo realista, aunque implicó que el estado sanitario de algunas plantas podría cambiar a lo largo del estudio. La variable respuesta fue el porcentaje de severidad de la roya, mediante el análisis de imágenes con el paquete Pliman (^{Enríquez-López et al., 2025}).

Análisis digital de la severidad de la roya con el paquete Pliman. La evaluación se realizó mediante análisis de imágenes digitales con dicho paquete en R-Studio. El protocolo de captura y análisis fue previamente establecido y validado por ^{Enríquez-López et al. (2025}) para esta misma variedad de café y patosistema. El protocolo consiste en la estandarización del proceso a través de cuatro etapas de validación con muestras de precisión creciente, que permite seleccionar el índice de diferencia normalizada verde-rojo (NGRDI) con un umbral de 0.045 como el parámetro más preciso para distinguir el tejido infectado por H. vastatrix del tejido sano. En el presente estudio, se aplicó este protocolo para cada tratamiento, en cada periodo de aplicación, recolectando tres hojas por planta (una del estrato alto, medio y bajo del dosel) de las 42 unidades experimentales. Las hojas se fotografiaron sobre un fondo blanco bajo iluminación natural difusa, con una cámara Sony A6400 y lente Sigma 30 mm, siguiendo los parámetros técnicos definidos (Enríquez- López et al., 2025). Las imágenes fueron procesadas de forma automatizada en R-Studio utilizando el índice y umbral predefinidos (NGRDI = 0.045) para cuantificar el porcentaje de área foliar afectada (severidad) en cada tratamiento a lo largo del tiempo.

Análisis de la información. Los datos obtenidos se organizaron en una base, verificando los supuestos de normalidad, homocedasticidad e independencia y posteriormente se aplicó un ANOVA de medidas repetidas para evaluar los distintos factores y sus interacciones, así como la evolución temporal de la severidad de la roya durante el año de estudio, seguidos de una prueba de comparación de medias, Tukey (p < 0.05). Todos los análisis se efectuaron en el programa R-Studio versión 4.3.2.

Resultados y Discusión

Efecto de Trichoderma en la severidad de la roya. Se encontraron diferencias significativas (Tukey, p < 0.05) entre los tratamientos. La aplicación de Trichoderma spp. redujo la severidad de H. vastatrix en comparación con los controles. Los tratamientos más efectivos fueron el consorcio (Th_Ta; 8.10 %ᵃ) y T. harzianum (Th; 8.43 %ᵃ), seguidos de

T. asperellum (Ta; 9.2 %ᵃ). Todos estos valores fueron significativamente inferiores al manejo convencional o blanco (13.58 %ᵇ) y al testigo (20.66 %ᶜ). Estos resultados señalan el potencial biocontrolador de Trichoderma contra un patógeno foliar, incluso cuando se aplica al suelo, tal como se ha documentado en otros sistemas, como el control de Cercospora beticola en betabel (^{Galletti et al., 2008}) y Exserohilum turcicum en maíz (^{Limdolthamand et al., 2023}), lo que sugiere la activación de mecanismos de resistencia sistémica inducida en la planta.

Efecto de la concentración de conidios. No se encontraron diferencias significativas (Tukey, p < 0.05) entre las dos concentraciones evaluadas, siendo la C1 (8.40 %a) igual de efectiva que la C2 (8.76 %a) en la reducción de la severidad. Este hallazgo es de gran relevancia práctica, ya que la dosis menor es más económica. La efectividad de concentraciones en el rango de 1x10⁸ conidios mL⁻¹ ha sido reportada en la reducción y control de enfermedades foliares en diversas plantas y comúnmente es utilizada en trabajos de invernadero (^{Galletti et al., 2008}; ^{Limdolthamand et al., 2023}), para promover el crecimiento en jitomate (^{Celis-Perera et al., 2023}), controlar "damping off" en Capsicum chinense (^{Larios et al., 2019}) y mejorar la germinación de semillas de maracuyá (Passiflora edulis var. flavicarpa), lo que respalda la viabilidad de su uso a campo (^{Cubillos-Hinojosa et al., 2009}).

Influencia del estado sanitario inicial de la planta. Este fue un factor altamente significativo (Tukey, p < 0.05). Las plantas clasificadas inicialmente como asintomáticas presentaron una severidad promedio final significativamente menor (8.06 %ᵃ) que las plantas que inicialmente eran sintomáticas (13.37 %ᵇ). Esto indica que los tratamientos fueron más efectivos en condiciones de prevención que de curación. Las plantas asintomáticas, al poseer una mejor condición fisiológica, probablemente tuvieron una mayor capacidad para generar una respuesta de defensa robusta inducida por Trichoderma (^{Aswani et al., 2022}). Este resultado refuerza la importancia de implementar estrategias de biocontrol de manera preventiva dentro del manejo integrado de la roya.

Interacción entre Trichoderma y el estado sanitario. Se detectó un efecto de interacción significativo (Tukey, p < 0.05) en la efectividad de los tratamientos según la condición inicial de la planta. En plantas asintomáticas, el consorcio Th_Ta (5.99 %ab) y T. harzianum (Th; 5.61 %ᵃ) formaron el grupo estadístico de menor severidad, seguidos de T. asperellum (Ta; 8.61 %abc). En contraste, en plantas sintomáticas, T. asperellum (Ta; 8.25 %abc) fue la cepa más efectiva, mostrando una severidad estadísticamente igual a la de las plantas asintomáticas tratadas y significativamente menor que el consorcio (Th_Ta; 10.2 %cd) y T. harzianum (Th; 12.8 %de) en este grupo (Figura 1A).

Este resultado sugiere una especialización en los mecanismos de acción de las cepas. Mientras el consorcio (Th_Ta) parece ser ideal para una protección preventiva en plantas asintomáticas (“sanas”), posiblemente debido a una sinergia que potencia la inducción de defensas, T. asperellum (Ta) demostró una mayor capacidad para inducir una respuesta curativa o de contención en plantas sintomáticas (“enfermas”). Este efecto sistémico, mediado desde la rizosfera hacia el follaje, respalda firmemente la hipótesis de que Trichoderma activa mecanismos de resistencia sistémica en la planta. Este fenómeno, ampliamente documentado (^{Shoresh et al., 2005}), se manifiesta en la protección contra diversos patógenos foliares como Cercospora beticola (^{Galletti et al., 2008}), Exserohilum turcicum (^{Limdolthamand et al., 2023}) y Phytophthora palmivora (^{Sirikamonsathien et al., 2023}). Dicha activación conlleva la expresión de genes de defensa en tejidos distantes al sitio de la infección patógena, lo que constituye un sello característico de la resistencia sistémica inducida (^{Mukherjee et al., 2012}).

Interacción entre Trichoderma y la concentración. El efecto entre estos factores no fue significativo (p > 0.05). Esto confirma que la efectividad de ambas concentraciones (1x10⁸ y 1x10¹² conidios mL⁻¹) fue consistente para las diferentes cepas, independientemente de que las plantas fueran inicialmente asintomáticas o sintomáticas, reforzando la recomendación de utilizar la dosis más baja (Figura 1D).

Figura 1 Efecto de los tratamientos con Trichoderma spp. en la severidad de la roya del café (Hemileia vastatrix) en plantas sintomáticas y asintomáticas. A) Interacción entre tipo de planta (sintomática y asintomática) y tratamientos; B) Interacción entre tipo de planta y concentración: (C1 = 1×10⁸ conidios mL⁻¹, C2 = 1×10¹² conidios mL⁻¹); C) Variación de la severidad a lo largo del año; D) Interacción entre tratamientos y concentraciones Las barras indican la media ± error estándar. Las diferencias significativas se determinaron mediante ANOVA de medidas repetidas y prueba de Tukey (p < 0.05). 

Interacción entre la concentración y el estado sanitario. Se hallaron diferencias significativas (Tukey, p < 0.05). El mayor beneficio de aplicar Trichoderma se obtuvo en plantas asintomáticas, donde ambas concentraciones, C2 (6.57 %ᵃ) y C1 (6.90 %ᵃᵇ), lograron el menor grado de severidad, formando un grupo estadístico de máxima eficacia. Por el contrario, en plantas sintomáticas, la severidad general fue mayor. Sin embargo, los tratamientos con Trichoderma en ambas concentraciones redujeron significativamente la enfermedad, comparado con el manejo convencional o blanco (16.69 %ᵈ) y, especialmente, con el testigo (27.76 %ᵉ) (Figura 1B). Este patrón demuestra que, si bien el estado sanitario inicial es determinante, la aplicación de Trichoderma ejerce un control significativo en ambos escenarios. La capacidad de mantener los niveles de severidad más bajos en plantas asintomáticas refuerza el concepto de que una planta con su sistema inmunológico intacto responde de manera más robusta a los elicitores microbianos, maximizando la expresión de la resistencia sistémica inducida (^{Aswani et al., 2022}; ^{Shoresh et al., 2005}). Incluso en plantas sintomáticas, la reducción de la severidad sugiere que Trichoderma es capaz de modular la fisiología de la planta para frenar el avance del patógeno. El hecho de que no exista una diferencia clara entre C1 y C2 incluso dentro de cada tipo de planta, refuerza la robustez y confiabilidad de la dosis más baja (1x10⁸ conidios mL⁻¹) para su implementación práctica en campo, ya sea en estrategias preventivas o curativas.

Variación temporal de la severidad. Se encontró una fluctuación estacional altamente significativa (F = 18.92; GL = 5; p < 0.001), directamente influenciada por las condiciones climáticas de la región. Los valores más bajos se registraron durante los meses secos: agosto (4.71 %ᵃ), febrero (4.89 %ᵃ) y abril (5.23 %ᵃ), donde las condiciones de alta radiación solar y baja precipitación limitan naturalmente la germinación de las uredosporas (^{Toniutti et al., 2017}). Por el contrario, los picos máximos de la enfermedad ocurrieron en los meses húmedos: junio (15.29 %ᶜ), octubre (10.79 %ᵇ) y especialmente diciembre (23.39

%ᵈ). El incremento en la severidad durante estos meses coincide con periodos de mayor precipitación (^{Parada-Molina et al., 2020}) y con la concurrencia de alta humedad y temperaturas moderadas que crean el ambiente ideal para la germinación y dispersión del hongo (^{Avelino et al., 2006}; ^{Hinnah et al., 2020}). Cabe destacar que el tipo de lluvia es determinante: intensas pueden lavar las esporas, mientras que lluvias ligeras o salpicaduras favorecen su germinación y dispersión en el envés de la hoja (^{Lasso et al., 2020}; ^{Li et al., 2023}). Adicionalmente, el drástico pico en diciembre puede atribuirse a la dispersión mecánica de esporas facilitada por las labores de cosecha (^{Moreira-Morrillo et al., 2023}).

Efectividad de los tratamientos en el tiempo. El análisis de la interacción tratamiento por mes reveló que las combinaciones más efectivas fueron T. harzianum en febrero (1.86 %ᵃ),

T. asperellum en febrero (2.14 %ᵃ), el consorcio Th_Ta en agosto (2.93 %ᵃᵇ) y T. harzianum en agosto (3.55 %ᵃᵇ), las cuales formaron el grupo estadístico de menor afectación. En contraste, las combinaciones de mayor severidad corresponden al testigo en diciembre (49.11 %ʲ) y octubre (23.45 %ⁱ). Todos los tratamientos con Trichoderma mantuvieron la enfermedad significativamente controlada durante estos meses críticos (octubre-diciembre) (Figura 2). Este control bajo alta presión de inóculo sugiere que, Trichoderma indujo un estado de resistencia sistémica en la planta. Se ha demostrado que el género Trichoderma actúa como un elicitor, activando respuestas de defensa sistémicas en la planta huésped (^{Woo et al., 2006}). Mecanismos como la expresión de genes que codifican para quitinasas y β-1,3-glucanasas (^{Shoresh y Harman, 2008}), así como la participación de rutas de señalización del ácido jasmónico y etileno (^{Mamani-Huayhua et al., 2021}), crean un estado de "alerta temprana" potenciado que permite a la planta responder con mayor eficacia a infecciones posteriores de patógenos foliares, como se ha observado en sistemas como frijol (^{Yedidia et al., 2001}) y pepino (Yedidia et al., 2003).

La capacidad de las cepas aplicadas al suelo para reducir la severidad de un patógeno foliar respalda firmemente que este mismo mecanismo de resistencia sistémica inducida (^{Pocurull et al., 2019}) estuvo operando en el cultivo de café, siendo lo suficientemente potente como para mitigar la infección incluso bajo las condiciones ambientales más favorables para H. vastatrix.

Influencia del estado sanitario inicial en la dinámica temporal. El análisis de la interacción entre el estado sanitario inicial y el mes de evaluación reveló un patrón significativo (Tukey, p < 0.05). Durante la mayor parte del año, las plantas asintomáticas mantuvieron una severidad significativamente menor que las sintomáticas.

Figura 2 Interacción entre tratamientos con Trichoderma spp. y meses de evaluación sobre severidad de la roya del café. La figura muestra la evolución temporal de la severidad en plantas tratadas con T. harzianum (Th), T. asperellum (Ta), su consorcio (Th_Ta), el manejo convencional (blanco) y el testigo sin aplicación. Las barras representan la media ± error estándar. Diferencias significativas determinadas mediante ANOVA de medidas repetidas (p < 0.05). 

Esto fue particularmente evidente en los meses de junio, donde las asintomáticas (7.91%ᵇ) mostraron una severidad moderada, mientras que las sintomáticas alcanzaron uno de sus valores más altos (22.67 %ᵈ). En octubre, las asintomáticas se mantuvieron en un grupo intermedio (6.55 %ᵃᵇ) y las sintomáticas en un 15.03 %ᶜ (Figura 1C). Sin embargo, el hallazgo más revelador de esta interacción se observó en el pico epidémico de diciembre. En este mes, tanto las plantas asintomáticas como las sintomáticas convergieron en el mismo grupo estadístico de máxima severidad (ᵈ). Este resultado podría indicar que, bajo una presión de inóculo ambiental extremadamente alta, la ventaja inicial de estar sano se ve superada por la intensidad de la epidemia.

No obstante, los tratamientos con Trichoderma lograron modular la severidad gran parte del año. Esto indica que la aplicación del biocontrolador puede amortiguar la pérdida de la ventaja fisiológica en plantas inicialmente sanas y, al mismo tiempo, ofrecer un nivel de protección significativo a las plantas ya enfermas, posiblemente mediante la activación de los mecanismos de resistencia sistémica inducida que han sido previamente documentados (^{Pocurull et al., 2019}). En conjunto, estos resultados demuestran que la aplicación al suelo de Trichoderma spp., particularmente a una concentración de 1x10⁸ conidios mL⁻¹, representa una estrategia confiable y económicamente viable para el manejo integrado de la roya del café, ofreciendo protección tanto preventiva como curativa y resultando más valiosa precisamente durante los períodos de mayor potencial de daño económico.

Conclusiones

La aplicación al suelo de Trichoderma spp. es una estrategia efectiva para el manejo de la roya del café. La efectividad fue consistente entre las cepas evaluadas, destacando el consorcio de T. harzianum y T. asperellum en plantas asintomáticas para protección preventiva, y T. asperellum en plantas sintomáticas por su acción curativa. La concentración de 1x10⁸ conidios mL⁻¹ demostró ser igual de efectiva que dosis mayores, lo que representa la opción más viable por su menor costo. La cuantificación objetiva con el paquete Pliman validó que la mayor eficacia del biocontrol ocurre durante los meses epidémicos de octubre a diciembre, cuando la severidad de la roya es naturalmente más alta. Por lo tanto, la incorporación de Trichoderma en los esquemas de manejo integrado se justifica como una práctica confiable, económica y de base biológica para reducir la severidad de H. vastatrix en condiciones de campo.