Introducción

El chile (Capsicum annuum) es una de las hortalizas más importantes en el mundo. En México se produce en todo el territorio. En 2024 se reportaron 157,186.45 ha sembradas, con una producción de 3,129,877.88 t siendo los principales estados productores, en orden de importancia, Sinaloa, Chihuahua, Zacatecas, San Luis Potosí y Sonora (SADER, 2025). Al norte del estado de Guerrero, se siembran genotipos de chile denominados criollos, estos tienen gran aceptación local y regional y solo se siembran en el ciclo de temporal, en consecuencia, están más expuestos a problemas fitosanitarios (^{Ayvar et al., 2007}). Los hongos facultativos del suelo pueden ser un fuerte problema, como lo es Sclerotium rolfsii, actualmente denominado Agroathelia rolfsii (Sacc.) (Redhead & Mullineux, Index Fungorum 554: 1 (2023) [MB#901174]). Este hongo forma abundantes esclerocios que pueden sobrevivir en suelo por más de un año; en chile, los síntomas que induce son tizón de plántula, ‘damping-off’, marchitez, pudrición de raíz y cuello, pudiendo causar importantes pérdidas en cualquier estado fenológico del cultivo (^{Huang et al., 2023}). El manejo óptimo de la enfermedad requiere un diagnóstico efectivo del agente causal. Sclerotium rolfsii se identifica con base en sus características culturales, morfológicas, morfométricas, patogénicas, y moleculares (^{Díaz et al., 2018}; ^{Terrones et al., 2023}). Por la importancia de esta enfermedad y la capacidad de pervivencia del inóculo en suelo es imprescindible realizar un efictivo control preventivo del patógeno, a través de un manejo integrado, privilegiando el uso de diferentes métodos, como prácticas culturales, uso de microorganismos benéficos y la aplicación de fungicidas sintéticos (Díaz et al., 2018; ^{Michel et al., 2013}). Algunos de fungicidas químicos más extensamente utilizados son carboxin, tebuconazole, captan, tridemorf, propiconazol, mancozeb, hinosan, thiram, propineb, benlate, mancozeb, thiram, quintozeno, carbendazim, benomyl, oxycarboxin y triadimenol (^{Akarapisan et al., 2017}), algunos de estos con efectividad comprometida y/o de uso restringido como el carbendazim (https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-

pesticides-database/start/screen/active-substances/details/506).

En manejo integrado de enfermedades, se sugiere incorporar métodos de control alternativos a las moléculas químicas con el objetivo de reducir paulatinamente su uso bajo una visión sostenible. La aplicación de hongos del género Trichoderma, extensivamente conocidos como excelentes agentes de biocontrol es una alternativa promisora con altas expectativas para la supresión de hongos fitopatógenos (^{Díaz et al., 2018}). Varias especies de Trichoderma se ha aplicado con éxito en el manejo de enfermedades causadas por S. rolfsii en chile, frijol, pepino, tomate, cacahuate, remolacha, soya, arroz, trigo, caña de azúcar, algodón, banano, higuerilla, girasol, jengibre, cardamomo, pimienta negra, cocotero y tabaco contra diferentes patógenos (^{Kotasthane et al., 2015}; ^{Rao et al., 2015}).

El potencial de Trichoderma contra este y otros hongos patogénicos se ha documentado ampliamente en México (p.e., ^{Michel et al., 2009}; 2013; ^{Díaz et al., 2014}; 2015). Complementariamente, recientemente se ha impulsado el empleo de aceites y extractos vegetales para el manejo de enfermedades debido a su bajo o nulo nivel de contaminación y alta efectividad biológica. Numerosas investigaciones han documentado exitosamente el uso de aceites vegetales contra patógenos que inducen diversas enfermedades. Por ejemplo, se ha usado in vitro extracto de R. sachalinensis contra Podosphaera xanthii (^{Margaritopoulou et al., 2020}) y Fusarium oxysporum (Santos- Esteban et al., 2021); este extracto y Lippia graveolens vs. Colletotrichum truncatum (^{Terrones et al., 2025}); y aplicaciones foliares de R. sachalinensis en el manejo de Podosphaera physocarpi (^{Baysal-Gurel y Bika, 2021}). En este contexto, los objetivos de la presente investigación fue caracterizar patogénica, cultural, morfológica y molecularmente al agente causal del tizón sureño del chile, así como el desarrollo de estudios in vitro para determinar la sensibilidad del S. rolfsii a diferentes cepas comerciales y nativas de Trichoderma spp., extractos vegetales y fungicidas químicos comerciales.

La metodología de esta investigación se implementó a material vegetal de chile (Capsicum annuum) cultivado en condiciones experimentales el Centro de Estudios Profesionales del Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero (CEP- CSAEGRO) localizado en km 14.5 de la carretera Iguala-Cocula, Gro., entre coordenadas 18°15’56.97’’ LN y 99°38’52.49’’ LO, a 639 msnm. Se realizó un muestreo al azar dirigido a plantas de los criollos Ancho Liso, Carricillo y Chino con síntomas putativos de tizón sureño. Las plantas se depositaron individualmente en bolsas de papel, las cuales se etiquetaron, se sellaron y se transportaron en frio en una hielera al laboratorio de Fitopatología del CEP-CSAEGRO donde se almacenaron a 4 °C. Fragmentos (cortes de tejido de 1cm2) de la zona de avance de pudrición en raíces se desinfestaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1 % por 1 min, enseguida, se lavaron con agua destilada estéril dos veces y se dejaron secar a temperatura ambiente sobre toallas de papel estériles. Posteriormente, los trozos de tejido sintomáticos se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo sólido PDA 39 g L-1 de agua (Papa Dextrosa Agar, Bioxon, PDA) adicionado con ácido láctico (0.1 % v / v) y se incubaron en condiciones de laboratorio (28 ± 1°C). Una vez que se observó crecimiento micelial con el morfotipo de S. rolfsii, aproximadamente a los tres días, se purificó con la técnica de punta de hifa y se incubaron por ocho días en condiciones previamente descritas.

Para las pruebas de patogenicidad, en adherencia a los postulados de Koch, se inocularon plantas de chile criollo de 45 días de edad. Estas plantas crecieron en arena de rio previamente esterilizada en macetas de plástico de 10×7×8.5 cm bajo condiciones de invernadero y se regaron y fertilizaron regularmente. El hongo purificado se incrementó en sustrato de olote de maíz (Zea mays) triturado estéril el cual se inoculó con discos de 5 cm de diámetro de medio de cultivo PDA con micelio del hongo de cinco días de edad. El sustrato se incubó en condiciones de laboratorio (28 ± 1°C) hasta su colonización del 100

% aproximadamente a 12 días después de la inoculación (d.d.i.). Posteriormente se preparó una mezcla de 15 g de olote inoculado (aproximadamente 1500 UFC) más 150 g de arena estéril y se colocó en las macetas de 10×7×8.5 cm. Al centro de la maceta se trasplantaron plántulas con raíz desnuda previamente desinfestada y se incubaron bajo condiciones de invernadero (28 ± 1 °C). El experimento consistió en cinco repeticiones y cinco testigos, los cuales se asperjaron con agua destilada estéril. A los cuatro d.d.i. se observaron síntomas. Se hicieron re-aislamientos por lesión individual para completar las pruebas de patogenicidad, estas se realizaron por duplicado.

La caracterización cultural y morfológica se realizó con un microscopio compuesto Olympus BX 41 con cámara Olympus U-CMAD3 T2, U-TV1X-2 T2 (Tokio, Japón). Las características taxonómicas observadas como color, presencia de septos, ramificación de hifas, tasa de crecimiento y presencia de esclerocios sirvieron como base para identificación del hongo mediante las claves taxonómicas de ^{Barnett y Hunter (2000}) y ^{Watanabe (2002}). Esta información se utilizó para agrupar por similitud o morfotipos a los aislamientos.

Para la caracterización molecular, se extrajo el ADN de morfotipos S. rolfsii a partir de micelio de siete días de edad mediante el kit DNeasyMR (QIAGEN®, Hilden, Germany) según las instrucciones del fabricante. Se amplificaron las regiones del espacio transcrito interno (ITS) utilizando los iniciadores ITS1 / ITS4, combinado con el programa de termociclado propuestos por ^{White et al. (1990}). Los productos amplificados fueron purificados y secuenciados en ambas direcciones con el método Sanger por Macrogen Inc. (http://dna.macrogen, Corea del Sur). Las secuencias resultantes se analizaron por DNASTAR (2001) y Sequencher (2014), y la alineación se realizó con Clustal W en MEGA 6.0 (^{Tamura et al., 2013}). Las secuencias se compararon usando el algoritmo BLAST del NCBI (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi). Con fin de diagnóstico se realizó un análisis comparativo con secuencias ITS de NCBI y una secuencia ITS de un aislado seleccionado de un total de 20 obtenidos en esta investigación. Se empleó el método máxima verosimilitud en MEGA 11, con valores de Bootstrap estimados a partir de 1000 réplicas.

En la evaluación de actividad antibiótica in vitro de especies de Trichoderma contra

S. rolfsii. se utilizaron siete productos/cepas de Trichoderma, tres comerciales y cuatro nativas, las cuales fueron caracterizadas cultural y morfológicamente en un estudio previo (^{Michel et al., 2013}). Los tratamientos evaluados se describen en el Cuadro 1. La antibiosis de cepas de Trichoderma se evaluó mediante la técnica de celofán en cajas Petri de 9 cm de diámetro con PDA (^{Patil et al., 2014}). En estas cajas se colocaron círculos de 9 cm de diámetro de papel celofán previamente esterilizados; posteriormente, para cada tratamiento se depositó en centro de caja un disco de 5 mm de diámetro con micelio activo de Trichoderma con el objetivo de estimular la producción y difusión de metabolitos secundarios en el medio de cultivo. Después de 24 h incubación se retiró el papel celofán con el disco de Trichoderma y en seguida se depositó en centro de caja discos de PDA con micelio activo de S. rolfsii de cinco días de edad. La incubación se realizó a 25 ± 1 °C con fotoperiodo de 12 h y 40 % de humedad relativa (Michel et al., 2009). Esto se realizó para cada producto/cepa de Trichoderma.

Para estimar la sensibilidad de S. rolfsii a fungicidas y a extractos vegetales se utilizó medio PDA estéril adicionado independientemente con las dosis de fungicidas y extractos vegetales comerciales indicados en Cuadro 2. La adición al medio se realizó directamente en el matraz de preparación PDA previo a solidificación a 40 °C. La mezcla se vació en cajas Petri de 90 mm de diámetro y se dejaron reposar en oscuridad por 24 h antes de su uso. Las cajas preparadas se sembraron con un disco de 5 mm diámetro de PDA con crecimiento activo de micelio tomado de la periferia de colonias S. rolfsii de cinco días de edad. Las cajas Petri una vez sembradas se incubaron por cinco días en condiciones previamente descritas.

El diámetro de crecimiento de la colonia se midió con un vernier digital (Truper®, México) cada 24 h durante tres días para estimar la actividad antibiótica de Trichoderma spp. y cada cuatro días para la sensibilidad de S. rolfsii a extractos vegetales y fungicidas hasta que el micelio del hongo testigo (cajas PDA sin metabolitos y sin adición) llenara la caja Petri en dos direcciones perpendiculares. Estas mediciones se emplearon para general el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial estimado por tratamiento respecto al testigo.

El diseño experimental para ambos experimentos fue un completamente al azar. Para la actividad antibiótica de Trichoderma spp. fueron ocho tratamientos, cinco repeticiones y 40 unidades experimentales. Para la sensibilidad de extractos vegetales y fungicidas, fueron 11 tratamientos, cinco repeticiones y 55 unidades experimentales, cada unidad experimental consistió en una caja Petri de 90 × 15 mm. Se realizaron dos repeticiones del experimento.

Los datos obtenidos se sometieron a pruebas de normalidad con la prueba de Shapiro- Wilk. Para homogeneidad de varianza se utilizó la prueba de Levene con significancia de p = 0.05. Se realizó análisis de varianza y prueba de Tukey con la variable porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de S. rolfsii con p = 0.05. Los análisis se ejecutaron en SAS V.9.1 para Windows.

Los resultados de esta investigación permitieron confirmar la asociación del S. rolfsii con los tres chiles criollos estudiados. Se obtuvieron un total de 20 aislamientos con el morfotipo del hongo a partir de raíces de plantas con síntomas putativos a tizón sureño. El micelio fúngico fue abundante y algodonoso con presencia de esclerocios amarillento- oscuros redondos menores a 2 mm típicos de Sclerotium.

En las pruebas de patogenicidad, los síntomas de podredumbre blanda aparecieron a los cuatro d.d.i. Se observó al principio pérdida de turgencia en hojas y tallo, detrimento del vigor de plántulas, clorosis y marchitez generalizada. Se detectó abundante micelio aéreo blanco algodonoso de consistencia acuosa en la base de plantas con eventual formación de esclerocios. Los síntomas y signos fueron similares a los observados en campo. En las plántulas testigo no se observaron síntomas o signos del hongo. El hongo re- aislado mostró las mismas características culturales y morfológicas que el inoculado inicialmente. Estos resultados son análogos con otros trabajos con rangos en la aparición de síntomas de 5 - 7 d.d.i. (^{Remesal et al., 2010}; ^{Sun et al. (2019}). La variación en la aparición de síntomas, aunque baja, puede deberse a variabilidad patogénica, condiciones experimentales, o efecto de hospedero (^{Gopalakrishnan et al., 2005}).

Las características culturales y morfológicas permitieron identificar a Agroathelia rolfsii (Sacc.) Redhead & Mullineux (Syn: Sclerotium rolfsii Sacc). La tasa de crecimiento radial del micelio del hongo fue rápida (3 cm dia-1). Colonias de micelio blanco aéreo, algodonoso y denso. Produjo hifas septadas, hialinas, ramificadas en ángulo de 65° con paredes delgadas, con conexiones de pinza en cada septo del micelio (fíbulas); al madurar presentó abundantes esclerocios, esféricos, de color blanco al inicio y oscuro al madurar con superficie lisa, brillante y compacta que median de 1.2 a 1.9 mm de diámetro (n=100) después de 10 días; el número de esclerocios producidos por caja Petri osciló de 83 a 431 (n=50). Estos resultados concuerdan con reportes previos para S. rolfsii (Le et al., 2019; ^{Mahadevakumar et al., 2015}; ^{Sun et al., 2019}; ^{Tang et al., 2010}; ^{Terrones et al., 2023}; ^{You et al., 2015}). Basado en la similitud de caracteres morfológicos y culturales, todos los aislamientos fúngicos correspondieron a un solo grupo, de los cuales se seleccionó un aislamiento para la identificación molecular.

La secuencia del aislamiento CEP-ChSr7 se depositó en el GenBank con el número de acceso PV569903. El análisis BLAST de la secuencia parcial ITS (674 pb) mostró una similitud del 100 % con aislamientos de Agroathelia rolfsii (Sclerotium rolfsii) (GenBank: OM647806, OM729592) (^{Balamurugan et al., 2022}; ^{Sun et al., 2023}). El análisis diagnóstico/filogenético se muestra en Figura 1. El aislamiento seleccionado a partir de esta investigación identificado como Agroathelia rolfsii CEP-ChSr7 se indica con un círculo negro y está agrupado en el clado A. rolfsii. S. cepivorum se utilizó como grupo externo.

En la evaluación de actividad antibiótica in vitro de Trichoderma spp. contra Sclerotium rolfsii, en las dos primeras evaluación del crecimiento de la colonia de S. rolfsii, los valores mostraron diferencias altamente significativas (P <0,0001). En la primera fecha de evaluación, los tratamientos Trichoderma sp. (FITHAN^?), T. virens (PHC^?ROOTMATE), T. asperellum (Nativa de Cocula), T. asperellum (Nativa de Santa Teresa) inhibieron completamente (100 %) el crecimiento de S. rolfsii (Cuadro 1). En la segunda y tercera, T. asperellum (Nativa de Cocula) inhibió el crecimiento micelial de S. rolfsii en 94.45 % y 65.88 % respectivamente (Cuadro 1). Al final del experimento, T. asperellum (Nativa de Cocula), Trichoderma sp. (Nativa de Iguala) y T. virens (PHC^? ROOTMATE) fueron las que inhibieron exitosamente el crecimiento de S. rolfsii. En general, Trichoderma sp. (FHITAN^?), T. virens (PHC^? ROOTMATE), T. asperellum (Nativa de Cocula) y T. asperellum (Nativa de Santa Teresa) mostraron efecto fungistático, ya que, en la primera evaluación, controlaron el 100 % del crecimiento del hongo. Sin embargo, en evaluaciones posteriores se observó reactivación del crecimiento de micelio de S. rolfsii.

Figura 1 Árbol filogenético construido con fines de diagnóstico a partir de secuencias de la región del espacio transcrito interno (ITS) de aislamientos de Agroathelia spp. del NCBI y el aislamiento encontrado en chile criollo en Guerrero CEP-ChSr7 (en circulo negro). Algoritmo máxima verosimilitud en MEGA 11, con Bootstrap a1000 simulaciones. 

La capacidad de Trichoderma spp. para inhibir el crecimiento de hongos es por antibiosis, la cual depende de la producción de moléculas toxicas, volátiles y de enzimas hidrolíticas (^{Shoresh y Harman, 2008}). Al respecto, ^{Hirpara y colaboradores (2017}) reportaron que enzimas hidrolíticas como quitinasas, proteasas, ligasas y glucanasas, son producidas por Trichoderma cuando detecta a un hongo, idealmente antagónico, para degradar la pared celular de éste para facilitar la penetración de las hifas y absorción del contenido citoplasmático micelial.

Al finalizar las evaluaciones, tres días después de la siembra, el máximo porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de S. rolfsii, fue de 65.9 %, el cual se obtuvo con T. asperellum (cepa nativa de Cocula). Este valor coincide con otros reportes in vitro (^{Rasu et al., 2013}). Niveles de inhibición ligeramente más bajos se han consignado para T. harzianum (57.5 %, 55.8 %) y T. viridae (53.63 %) (^{Bindu et al., 2011}).

T. asperellum (Nativa de Cocula), Trichoderma sp. (Nativa de Iguala) y T. virens (PHC^? ROOTMATE), aunque tuvieron el menor crecimiento de micelio, mostraron el mayor porcentaje de inhibición de S. rolfssi. ^{Hirpara et al. (2017}) registraron inhibición en el rango de 89.33 % - 91.13 % con T. virens. Sin embargo, ^{Parmar et al. (2015}), documentaron solo 50 % de inhibición. Las cepas de Trichoderma nativas de Cocula y de Iguala Guerrero, presentaron el mayor porcentaje de inhibición de S. rolfsii. Estas cepas podrían ser una importante opción para el manejo de S. rolfsii. No obstante, deben evaluarse en diferentes condiciones de campo para su eventual integración a un plan de manejo sostenible (^{Michel et al., 2009}; 2013; ^{Díaz et al., 2014}; 2015).

La sensibilidad de S. rolfsii a fungicidas y extractos vegetales también se encontraron diferencias significativas en los cuatro periodos de evaluación (P <0.0001). Los fungicidas y extractos vegetales inhibieron el crecimiento micelial de S. rolfsii de manera diferenciada según al tipo de extracto, fungicida y dosis. Todos los tratamientos evaluados suprimieron totalmente el crecimiento micelial de S. rolfsii, con excepción de CERCOBIN® M (tiofanato de metilo) (Cuadro 2). Diferentes estudios han evaluado la sensibilidad de S. rolfsii a diferentes fungicidas; por ejemplo, ^{Amule et al. (2014}) evaluaron el fungicida piraclostrobin contra S. rolfsii, aislado de garbanzo (Cicer arietinum), con inhibición completa (100 %) del crecimiento del hongo, análogo al presente estudio. Este fungicida pertenece la clase que afecta principalmente la respiración mitocondrial y producción de energía con efectos letales en hongos (^{Fillinger y Walker, 2016}). También se ha comprobado el efecto fungicida del clorotalonil, cymoxanil, clorotalonil + benomil en S. cepivorum aislado de ajo (Allium sativum) (^{Pérez et al., 2015})

En este estudio, el tiofanato de metilo fue el único fungicida que no inhibió el 100 % del crecimiento del patógeno, aunque difirió estadísticamente con el testigo en las primeras 48 h. Esto posiblemente se debe a la baja dosis empleada. Este hallazgo, coincide con lo reportado por ^{Suryawanshi et al. (2015}), quienes reportan una inhibición del 63.81 % mientras que ^{Díaz et al. (2018}) reportaron inhibición del 4.17 % de S. rolfsii aislado de calabaza (Cucurbita argyrosperma). Por el contrario, quintozeno controló al 100 % el crecimiento de S. rolfsii, similar a resultados de Díaz et al. (2018). El quintozeno interfiere con la síntesis de lípidos y membranas celulares, lo que afecta directamente el crecimiento micelial de hongos (^{Fillinger y Walker, 2016}).

La mayoría de los extractos vegetales inhibieron el 100 % de crecimiento micelial de

S. rolfsii. Estos niveles están bien documentados in vitro con extractos de ajo (Allium sativum), yuquilla (Schefflera gleasonii), matarrata (Gliricidia sepium) y orégano (Origanum vulgare) (^{Flores et al., 2017}). Niveles moderados (71.4 %) se han observado con extractos etanólicos de orégano silvestre Lippia origanoides (^{Alvarado et al., 2011}). El producto NEEMIX 4.5 % CE, elaborado a base de Azadirachta indica, con aparente acción fungistática (^{Jebaraj et al., 2016}), no inhibió exitosamente a S. rolfsii ya que presentó el porcentaje de inhibición más bajo, coincidente con estudios de Alvarado et al. (2011), aunque en las cuatro evaluaciones contrastó significativamente con el testigo. Interesantemente, Flores et al. (2017), documentaron 100 % de efectividad el extracto de neem in vitro del agente causal de la marchitez sureña del chile.

Se ha documentado ampliamente el efecto inhibitorio de diversos extractos in vitro contra S. rolfsii, como Lupinus rotundiflorus y L. exaltatus (^{Bernal et al., 2005}), higuerilla (Ricinus communis), albahaca (Ocimum basilicum), mastuerzo (Lepidium virginicum), ajo (Allium sativum) (^{Marcano et al., 2005}) Coronopus didymus (^{Drakshan y Javaid, 2011}), ajo (A. sativum) y jengibre (Zingiber officinale) (^{Yasmin, 2016}), ajo y cebolla (^{Banakar et al., 2017}). Aunque el empleo de extractos parece una alternativa promisoria (^{Zapata et al., 2020}), es necesario realizar estudios en campo para evaluar el efecto sobre el inóculo primario constituido por el esclerocio para incidir en el manejo S. rolfsii y otros hongos, con un enfoque preventivo.

En conclusión, con base en la caracterización patogénica, cultural, morfológica y molecular (PV569903, número de accesión NCBI), el agente causal del tizón sureño aislado de plantas de chile criollo en Cocula, Guerrero, se identificó como Agroathelia rolfsii (Sclerotium rolfsii). Trichoderma asperellum (nativa de Cocula), Trichoderma sp. (nativa de Iguala) y T. virens (PHC® ROOTMATE) inhibieron el crecimiento in vitro de S. rolfsii. El hongo también exhibió alta sensibilidad in vitro a los fungicidas sulfato de cobre, clorotalonil, quintozeno, benomilo y piraclostrobin y a los extractos vegetales comerciales a base de Reynoutria sachalinensis, Lippia graveolens + L. berlanderi, A. indica + Cinnamomum verum. Se postula que estas cepas de Trichoderma, fungicidas y extractos vegetales pueden ser una alternativa viable para su validación en campo y posible integración en un programa de manejo sostenible del tizón sureño del chile criollo causado por S. rolfsii en Guerrero.