Introducción

Sclerotium rolfsii y Sclerotinia sclerotiorum causan pudrición de la raíz y tallo, ambos fitopatógenos polífagos se asocian con pérdidas significativas en cultivos de importancia económica. S. rolfsii se encuentra predominantemente en regiones tropicales y subtropicales (^{Gholami et al., 2019}), mientras que S. sclerotiorum presenta una distribución geográfica más amplia, afectando cultivos en zonas templadas y subtropicales (^{Ordóñez-Valencia et al., 2018}). Las enfermedades producidas por hongos que afectan el rendimiento de cultivos agrícolas son frecuentes, existe una creciente preocupación por la resistencia de las cepas a los fungicidas utilizados para el control químico de hongos, por lo que se buscan nuevos productos para el manejo de estos agentes fitopatógenos. El uso de extractos de plantas como agentes antifúngicos puede ser una alternativa; diferentes especies de Datura han mostrado efecto inhibitorio contra diversos hongos fitopatógenos, pero el efecto varía según la concentración y la parte de la planta de la cual se obtiene el extracto, así como los tipos de solventes utilizados para el proceso (Öz, 2017).

Extractos de D. discolor se han evaluado contra diferentes fitopatógenos; extractos metanólicos y etanólicos de hojas y tallos inhibieron el desarrollo in vitro de Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Penicillium expansum, Fusarium moniliforme y Fusarium poae (^{Tequida-Meneses et al., 2002}). Además, el extracto acuoso de hojas obtenido por infusión afectó el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides (^{Verdugo-Contreras et al., 2023}). Así mismo, extractos acuosos (2, 4 y 6 % p/v) de raíz, semilla y hoja obtenidos mediante procesamiento por alta presión (HPP), mostraron porcentajes variables de inhibición in vitro contra S. rolfsii, S. sclerotiorum y

C. gloeosporioides, siendo el extracto de hoja al 6 % el que mostró mayor efectividad contra los tres hongos (^{Urias-Lugo et al., 2024}). No se ha evaluado el efecto de extractos acuosos de D. discolor obtenidos por infusión contra S. rolfsii y S. sclerotiorum.

La actividad biológica de especies del género Datura ha sido atribuida a la presencia de metabolitos secundarios como compuestos fenólicos, flavonoides y alcaloides, los cuales desempeñan funciones antioxidantes y antimicrobianas (^{Céspedes-Méndez et al., 2021}). Aunque D. discolor se encuentra ampliamente distribuida en México, los reportes sobre caracterización fitoquímica de esta especie son escasos (^{Verdugo-Contreras et al., 2023}), se han reportado withanólidos (^{González et al., 2023}) y la presencia de diversos grupos de metabolitos en extractos crudos de hoja, incluyendo alcaloides, esteroides, terpenoides, glucósidos, saponinas, compuestos fenólicos, taninos y lípidos (^{Ahanotu et al., 2024}), lo cual resalta el potencial bioactivo y biotecnológico de esta especie poco estudiada.

El objetivo del presente trabajo fue identificar los principales grupos de compuestos fitoquímicos presentes en los extractos acuosos de D. discolor obtenidos por infusión y HPP, y evaluar el potencial antifúngico in vitro de los extractos acuosos de D. discolor obtenidos por infusión contra S. rolfsii y S. sclerotiorum.

Obtención de los extractos. Las plantas de D. discolor se recolectaron en etapa de floración y fructificación durante abril de 2024 en el municipio de Ahome, Sinaloa, México (25°54-55’ N y 108-109°02-55’ O). La desinfección y pulverización se realizó conforme a lo descrito por ^{Urias-Lugo et al. (2024}). Los extractos acuosos se prepararon a una relación 1:10 p/v. Para la extracción por infusión se siguió el procedimiento descrito por ^{Bitwell et al. (2023}) y para la extracción por HPP a Urias-Lugo et al. (2024). Tanto para el método de infusión como para el HPP, la mezcla se centrifugó (RC-5C Sorvall, Newtown, CT, USA) a 4000 rpm durante 10 min, los sobrenadantes se recuperaron y almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Tamizaje fitoquímico de Datura discolor. La identificación de los principales grupos de compuestos bioactivos presentes en extractos acuosos de D. discolor se realizó mediante pruebas cualitativas conforme a lo reportado por ^{Khan et al. (2019}). Se emplearon ensayos de cambio de color para fenoles, flavonoides, cumarinas, taninos, terpenoides, antraquinonas, antocianinas y betacianinas; precipitación para alcaloides; y formación de espuma para saponinas. La caracterización se llevó a cabo mediante ensayos colorimétricos y de precipitación, específicos para cada clase de compuesto, y los resultados se expresaron en una escala semicuantitativa de concentración relativa, desde ausencia (-) hasta presencia abundante (++++).

Para la detección de fenoles totales, se empleó cloruro férrico al 1 %, cuya reacción con el extracto produjo coloraciones verde, violeta, azul o negro como indicador positivo. La presencia de flavonoides se confirmó mediante la adición de ácido sulfúrico concentrado, observándose una coloración naranja característica. Las cumarinas se identificaron por la formación de un color amarillo al mezclar el extracto con hidróxido de sodio al 10 %. La prueba de formación de espuma persistente durante 15 a 20 minutos permitió detectar saponinas. Para taninos, la adición de cloruro férrico al 5 % tras calentar el extracto resultó en coloraciones verdes o azules, indicando la presencia de taninos condensados o hidrolizables, respectivamente. Los terpenoides se identificaron mediante la prueba de Salkowski, observando una coloración rojo-marrón tras la mezcla del extracto con cloroformo y ácido sulfúrico concentrado. La detección de antraquinonas se efectuó por el método de Bontrager, observando una coloración rosa por tratamiento ácido, extracción con cloroformo y alcalinización. Las antocianinas y betacianinas se diferenciaron por el cambio de color a azul o amarillo, respectivamente, al someter el extracto a ebullición con NaOH al 0.1 N. Finalmente, los alcaloides se detectaron mediante el reactivo de Wagner, donde la aparición de turbidez o un precipitado marrón- rojizo confirmó su presencia.

Cuantificación de compuestos fitoquímicos. Para la cuantificación de metabolitos totales se utilizaron los extractos líquidos o liofilizados (VirTis 25EL, VirTis Co. EE.UU.).

Fenólicos totales. La determinación se realizó mediante el método colorimétrico de ^{Singleton et al. (1999}). Se colocaron 10 µL de extracto diluido (1:20 v/v) en una microplaca de 96 pozos, seguido de la oxidación de los fenoles con 100 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu (1:10 v/v en agua). Tras 2 min, la reacción se neutralizó con 90 µL de Na2CO3 al 10 %. Posteriormente, se incubó la muestra a 40 °C durante 30 min en ausencia de luz y se midió la absorbancia a 765 nm con un lector de microplacas (Synergy HT, Winooski, VT, USA). Se empleó ácido gálico como estándar (0-0.4 mg mL^-1), expresándose los resultados en µg equivalentes de ácido gálico por mL de extracto (µg EAG mL^-1).

Flavonoides totales. El contenido de flavonoles se determinó mediante el método colorimétrico de Quettier et al. (2000). Se depositaron 50 µL de extracto diluido (1:10) en una microplaca de 96 pozos y se añadieron 100 µL de AlCl₃ al 1.5 %. Tras una incubación de 10 min a 25 °C, se midió la absorbancia a 403 nm utilizando un lector de microplacas (Synergy HT, Winooski, VT, USA). La quercetina se empleó como estándar (0-0.15 mg mL^-1), los resultados se expresaron en µg equivalentes de quercetina por mL de extracto (µg EQ mL^-1).

Saponinas. La cuantificación se realizó mediante el método colorimétrico de ^{Hiai et al. (1976}), basado en la formación de grupos cromóforos con vainillina y ácido sulfúrico. Se disolvieron 20 mg de extracto liofilizado de D. discolor en 1 mL de metanol al 80 %, se centrifugó a 4000 rpm por 2 min y se recuperó el sobrenadante. En una microplaca de 96 pocillos, se colocaron 20 µL del extracto junto con 20 µL de vainillina al 8 %, manteniendo la microplaca en baño de hielo por 2 min. Posteriormente, se añadieron 200 µL de ácido sulfúrico al 72 % (frío) y se agitó durante 3 min. La muestra se incubó a 60

°C por 10 min, se enfrió por 5 min y la absorbancia se registró a 470 nm (Synergy HT, Winooski, VT, USA). Se empleó diosgenina como estándar (0-0.4 mg mL^-1), los resultados se expresaron en µg equivalentes de diosgenina por mL de extracto (µg ED mL^-1).

Alcaloides totales. La determinación se realizó mediante el método colorimétrico de ^{Shamsa et al. (2008}), con modificaciones. Se desgrasaron 400 mg de extracto acuoso de hoja de D. discolor liofilizado con 5 mL de hexano, seguido de sonicación (30 min) y centrifugación (4500 rpm/2 min), descartando el sobrenadante. Los restos de hexano se eliminaron bajo corriente de nitrógeno y el residuo se resuspendió en 5 mL de metanol, se sometió a sonicación y centrifugación para recuperar el sobrenadante. El metanol se evaporó en un rotavapor a 38 °C y el residuo se resuspendió en 1 mL de HCl 2 N, se lavó dos veces con 5 mL de cloroformo y ajustando a pH neutro con NaOH 1 N. Se añadieron 5 mL de buffer de fosfatos (2 M, pH 4.7) y 5 mL de solución de verde de bromocresol (69.8 mg de VBC en 3 mL de NaOH 2 N y diluir a 1000 mL). El complejo formado se extrajo secuencialmente con 1, 2, 3 y 4 mL de cloroformo, agitando y recuperando la fase inferior y ajustando el volumen a 10 mL con cloroformo. Finalmente, la absorbancia se midió a 470 nm en un lector de microplacas (Synergy HT, Winooski, VT, USA). Se construyó una curva de atropina (0-0.1 mg mL^-1) y los resultados se expresaron como µg equivalentes de atropina por mL de extracto (µg EA mL^-1).

Evaluación antifúngica in vitro . La identidad y la fitopatogenicidad de S. rolfsii y S. sclerotiorum se han descrito previamente, estos patógenos forman parte de la colección de la Unidad de Investigación en Ambiente y Salud de la UAdeO (^{Martínez-Álvarez et al., 2021}; ^{Martínez-Ereva, 2022}). Los experimentos se realizaron con los extractos obtenido por infusión diluido a diferentes concentraciones (2, 4 y 6 %; v/v) en PDA (PDA; Bioxon, Cuautitlán Izcalli, Estado de México, México) en cajas Petri, conforme a lo descrito por ^{Urias-Lugo et al. (2024}). Los experimentos se condujeron dos veces en un arreglo completamente al azar con cuatro repeticiones por tratamiento y una caja Petri como unidad experimental.

Análisis estadístico. Todos los datos se sometieron a pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk. Para el ensayo in vitro contra patógenos se realizó un ANOVA unidireccional y para los datos de compuestos fitoquímicos un ANOVA de dos vías, en ambos casos seguido de la prueba de Tukey (^{Little y Hills 1978}) con un valor de P < 0,05. Para permitir valores de cero en algunos tratamientos los datos se transformaron por √x+1 como lo descrito por Gómez y Gómez (1984). Además, se utilizó la prueba t de Student no pareada (P < 0,05) para comparar las concentraciones de alcaloides. Los análisis estadísticos se realizaron en el software GraphPad Prism, versión 6.00 para Windows (GraphPad Software).

Caracterización fitoquímica. Se detectó por tamizaje fitoquímico compuestos fenólicos, saponinas, flavonoides, alcaloides, taninos, terpenoides, cumarinas y betacianinas, pero no antraquinonas ni antocianinas en ninguno de los extractos (Cuadro 1). Los extractos de raíz y tallo presentaron menor diversidad y contenido de metabolitos. Los extractos de semilla y hoja presentan las mismas familias de metabolitos, pero difieren en concentración. El método de extracción HPP mostró mayor extracción/retención de fenoles y saponinas en hoja, y de alcaloides, saponinas y taninos en semilla; mientras que infusión presentó mayor contenido de flavonoides y cumarinas en semilla. Este análisis permitió establecer un perfil fitoquímico preliminar de D. discolor, con implicaciones potenciales en su actividad biológica.

Con base en la abundancia relativa observada en el tamizaje preliminar y en evidencia previa de su bioactividad, se seleccionaron para cuantificación los compuestos fenólicos, los flavonoides (^{Matías et al., 2020}), las saponinas (^{Barile et al., 2007}) y los alcaloides (^{Singh et al., 2007}), debido a su reconocida implicación en mecanismos de defensa vegetal y su potencial inhibitorio frente a patógenos fúngicos. En general, se observa diferencia en las concentraciones entre los tipos de tejido de la planta y el método de extracción (Figura 1 A-D); el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides es mayor en el extracto de hoja obtenido por HPP (1370 µgEAG mL^-1 y 21.4 µgEQ mL^-1) que por infusión (586 µgEAG mL^-1 y 0.0 µgEQ mL^-1) (Figura 1 A y C), pero el contenido de saponinas y alcaloides es el mismo en extracto de hoja independientemente del método de extracción (Figura 1 B y D).

Figura 1 Cuantificación de compuestos fitoquímicos de extractos acuosos de Datura discolor al 6 % obtenidos mediante procesamiento por alta presión (HPP) e infusión (INF). Equivalentes de ácido gálico (EAG), Equivalentes de diosgenina (ED), Equivalentes de quercetina (EQ), Equivalentes de atropina (EA). 

Los compuestos fenólicos están directamente relacionados con la acción antifúngica, pueden actuar como fungicida o fungistática (^{Matías et al., 2020}), inhiben el crecimiento micelial, además de actuar sobre la emisión del tubo germinativo de los hongos fitopatógenos (^{Díaz-García et al., 2024}). Mientras que los flavonoides actúan directamente sobre la granulación citoplasmática, la desorganización del contenido celular, la ruptura de la membrana plasmática y la inhibición de las enzimas producidas por los hongos en el momento de su penetración al huésped (^{Knaak y Fuiza, 2010}). Compuestos fenólicos, tanto flavonoides como ácidos fenólicos, han mostrado actividad antifúngica contra los fitopatógenos Alternaria alternata, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea y Phytophthora infestans (^{Wianowska et al., 2016}). Matías et al. (2020), relacionaron el potencial antifúngico de extractos etanólicos y acuosos de hoja de D. inoxia contra S. sclerotiorum con la abundancia de alcaloides y compuestos fenólicos, principalmente con los flavonoides totales.

Evaluación antifúngica. La inhibición de los extractos acuosos de D. discolor para S. rolfsii varió de 2 a 46 %, la mayor inhibición se observó con el extracto de hoja al 6 % (Cuadro 2, Figura 2). En cuanto al efecto contra S. sclerotiorum la inhibición presentada por el extracto de hoja (4 y 8 %) no fue significativa (Cuadro 2, Figura 2). En la evaluación in vitro se descartó el extracto de tallo dado el bajo porcentaje de extracción en relación con el de hoja (10 % vs 55 %).

En relación con la actividad antifúngica de especies de Datura contra los patógenos utilizados en este estudio; Jaben et al. (2014) y Jaben et al. (2022), reportaron reducción del crecimiento entre el 69 y 94 % y entre 29 y 88 % de S. rolfsii respectivamente, con extractos metanólicos de fruto y hoja de D. metel, la mayor actividad podría atribuirse a la especie de Datura y al solvente de extracción utilizado. Por otra parte, el extracto acuoso de hoja de D. discolor obtenido por HPP inhibieron hasta el 100 % del crecimiento micelial in vitro de S. rolfsii (^{Urias-Lugo et al., 2024}), posiblemente atribuida al proceso de extracción utilizado.

Respecto a S. sclerotiorum, ^{Urias-Lugo et al. (2024}) reportaron que los extractos acuosos de hoja obtenidos por HPP inhibieron hasta un 56 % de este hongo y ^{Matías et al. (2020}) observaron que el extracto acuoso de hoja de D. inoxia obtenidos mediante maceración estática constante durante siete días inhibió el crecimiento de S. sclerotiorum hasta un 94 %. La efectividad observada contra el patógeno por los extractos acuosos se puede atribuir a diferencias en los procesos de extracción y en el tipo de compuestos bioactivos extraídos en cada una de las especies.

Figura 2 Efecto de extracto acuoso de hoja de Datura discolor obtenido por infusión. Datura discolor (2, 4 y 6 %) y Testigo, respectivamente. A-D Sclerotium rolfsii, E-H Sclerotinia sclerotiorum. 

Los procesos de extracción de compuestos fitoquímicos que se basan en tratamientos térmicos pueden provocar la pérdida y degradación de compuestos termolábiles con actividad biológica (^{Zhang et al., 2018}), mientras que por medio de HPP se tiene un alto impacto en la estructura celular, en la destrucción de las paredes celulares y otras barreras estructurales, lo cual aumenta la recuperación de compuestos bioactivos (^{Le-Tan et al., 2022}). Esto puede explicar la efectividad observada de los extractos acuosos de D. discolor entre los métodos de infusión y HPP, contra S. rolfsii y S. sclerotiorum. Los procesos de extracción utilizados muestran diferencias en los constituyentes fitoquímicos de los extractos acuosos de Datura discolor obtenidos por infusión y HPP, que influyen directamente en la actividad antimicrobiana, ya que la solubilidad, estabilidad y sinergia de los metabolitos secundarios extraídos determinan el grado de inhibición de los patógenos.

Los resultados reportados por ^{Urias-Lugo et al. (2024}) en combinación con los del presente estudio sugieren la participación de flavonoides en la inhibición observada contra S. sclerotiourm y S. rolfsii por los extractos acuosos de hoja de D. discolor obtenidos por HPP. En el presente estudio solo se detectó por el método cuantitativo la presencia de flavonoides en extracto de hoja obtenido por HPP (Figura 1C). Esto pudiera explicar el que no se observara inhibición del extracto acuoso de D. discolor obtenido por infusión contra S. sclerotiorum. Asimismo, los extractos preparados por infusión también demostraron actividad inhibitoria frente a S. rolfsii, pero con menor eficacia que los extractos obtenidos por HPP, lo que indica la posible presencia de otros compuestos bioactivos con efecto antifúngico, pero con menor potencia o diferente mecanismo de acción en comparación con los flavonoides extraídos por HPP.

Los resultados del presente estudio no permiten establecer conclusiones definitivas respecto a los metabolitos secundarios responsables de la actividad antifúngica observada, por lo que no se descarta la posibilidad de que otros compuestos no analizados, presentes en los extractos acuosos de D. discolor, contribuyan de forma individual o sinérgica a la inhibición de S. rolfsii y otros hongos evaluados. Esta complejidad fitoquímica resalta la necesidad de estudios adicionales dirigidos a la identificación y caracterización de los compuestos activos involucrados y sus posibles interacciones.

Se deben realizar nuevos estudios en condiciones de invernadero, con aspersión foliar o aplicación al suelo, para observar la capacidad de control de los extractos acuosos de

D. discolor, obtenidos por HPP y por infusión, para corroborar la reproducibilidad de los resultados observados en condiciones controladas.