Introducción

Bocconia frutescens (Papaveraceae) es un árbol de porte pequeño (2 a 3 m de altura), es una especie de corta vida y demandante de luz, se encuentra distribuido naturalmente desde México y Centroamérica, hasta Argentina y en las islas del Ca- ribe. Es una especie invasora, por introducción, en las islas de Hawaii y en la Isla Reunión (^{Sherley 2000}, ^{Tassin et al. 2006}). Se le conoce con diferentes nombres: “llora sangre”, “trompeto”, “cacho venado”, “plume-poppy”, “parrot weed”, “bois codine”, etc. (^{Francis, 2004}). En Costa Rica, se le llama guacamayo, tabaquillo, cola de gallo y tora (^{Soto, 2007}), y se distribuye entre los 100 y 3300 m.s.n.m. en las vertientes del Pacifico y del Atlántico, a lo largo de caminos, vegetación riparia, en campos abiertos y claros de bosque (^{Boucher y Nishida, 2014}). Varios tipos de tejidos de B. frutescenses se emplean en medicina etnobotánica, y evaluaciones in vitro de diferentes extractos de esta especie han mostrado actividad contra diferen- tes microorganismos. Sin embargo, diferentes alcaloides han sido identificados en esta especie (^{Lunagómez et al., 2020}).

Varios árboles de B. frutescens con síntomas sugestivos de infección por fitoplasmas (^{Lee et al., 2000}, ^{Hogenhout et al., 2008}, ^{Maejima et al., 2014}) se observa- ron en áreas de sucesión secundaria, bordes de caminos, orillas de ríos y riachuelos, en varias localidades en la provincia de Cartago, Costa Rica. Los fitoplasmas (clase Mollicutes) pueden inducir diferentes síntomas en las plantas que infectan, incluyendo escobas de bruja (“witches’-broom”), enanismo y amarillamiento. Éstos causan diferentes enfermedades en plantas alrededor del mundo y son los responsables de daños devastadores para muchos cultivos de im- portancia económica y para los ecosistemas naturales. Estos mollicutes fitopato- génicos son procariotes diminutos, desprovistos de pared celular, y que habitan en el floema de las plantas hospederas o infectando diferentes tejidos de las espe- cies de insectos responsables de su transmisión entre plantas, incluidos algunos en las familias Cicadellidae, Cixiidae, Delphacidae, Derbidae y Psyllidae (Lee et al., 2000, ^{Weintraub y Beanland, 2006}, Hogenhout et al., 2008, Maejima et al., 2014, ^{Trivellone y Dietrich, 2021}). El objetivo de este estudio fue detectar e identificar potenciales fitoplasmas asociados con los síntomas de hoja pequeña observados en

B. frutescens.

Muestras de árboles sintomáticos de B. frutescens de localidades en la provincia de Cartago, Costa Rica (Cuadro 1) y de árboles sanos se recolectaron y evaluaron mediante microscopia electrónica de transmisión (MET), y estudios moleculares

(PCR anidada y semianidada, clonaje y secuenciamiento, RFLPs in silico y análisis filogenéticos).

Muestras foliares de 18 árboles de B. frutescens con síntomas de hoja pequeña se recolectaron y evaluaron en dos diferentes ocasiones en época lluviosa, en las localidades de Capellades (n=9), Cervantes (n=6) y Pacayas (n=3), y de dos árbo- les sanos de B. frutescens en San Pedro de Montes de Oca (provincia de San José, 9°56’27.11”N/ 84°02’34.73”O, 1236 m.s.n.m.). Secciones de vena media (1-2 mm largo) de un árbol sintomático de Pacayas y otro de Cervantes, y uno sano (San Pe- dro) se fijaron y procesaron para MET. La fijación (toda la noche a 15 °C) se realizó con solución de Karnovsky (amortiguado con cacodilato al 0.05 M), posterior a la- vados (amortiguador de cacodilato 0.05 M) se postfijó con tetraóxido de osmio (1 %). La deshidratación se hizo empleando una serie de etanol / oxido de propi- leno, y para la embebida se empleó este óxido y resina epóxica (dureza media de Spurr), finalmente se polimerizó con calor. Las secciones ultrafinas se obtuvieron de tres diferentes bloques por cada árbol muestreado. Las secciones con doble tin- ción se observaron a 100kV en un microscopio electrónico Hitachi TEM H-7100.

El ADN se extrajo de las venas medias usando el Mini Kit DNeasy Plant (Qia-gen, Valencia, CA, USA) de las muestras de dos árboles de Bocconia sanos, de 18 con los síntomas hoja pequeña, y de un control positivo de Sechium edule infectado con fitoplasmas del 16SrI-B (^{Villalobos et al., 2002}). Las reacciones de PCR ani- dada se hicieron con los pares de iniciadores universales para fitoplasmas P1/P7 (^{Deng y Hiruki, 1991}; ^{Schneider et al., 1995}) en la primera ronda, y los iniciadores específicos R16F2n/ R16R2 (^{Gundersen y Lee, 1996}) para la segunda ronda. La mezcla de reacción de 25 µL para la PCR contenía DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), 0.4 uM de cada iniciador y 2 µL del ADN. El producto de la primera ronda se diluyó 1/40 para emplearse en la segunda.

Los perfiles empleados se muestran en el Cuadro 2 y éstos se corrieron empleando un termociclador “PCR Gradient Palm Cycler” (Corbett Research Model CG1-96, Australia). Los productos de las PCR anidadas se evaluaron mediante electrofore- sis (agarosa 1 % y tinción con GelRed).

Seis amplicones de la PCR anidada seleccionados aleatoriamente, dos por lo- calidad de recolección de las muestras, se purificaron y secuenciaron (Macrogen Inc., Korea) directamente en ambas direcciones empleando los iniciadores R16F2n / R16R2. La secuencia ensamblada (“contig”) para cada muestra se obtuvo usando BioEdit v7.2.5 (^{Hall, 1999}) y se compararon e identificaron mediante el algoritmo BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Una muestra de la localidad de Cervantes (código 16.1266) se seleccionó para la posterior caracterización de los fitoplasmas asociados con los síntomas de hoja pequeña. Un segundo producto de amplificación, con mayor tamaño, del gen ARNr 16S se obtuvo mediante una PCR semianidada usando los pares de iniciadores

P1/16S-SR y P1A/16S-SR (^{Deng y Hiruki, 1991}; ^{Lee et al., 2004}). La mezcla de reacción empleada fue la mencionada previamente. El producto de la primera ronda de PCR se diluyó 1/40 previo al uso en la PCR semianidada. Los perfiles térmicos usados se muestran en el Cuadro 2. El amplicón se clonó (sistema TA) y tres co- lonias bacterianas se secuenciaron en ambas direcciones (Macrogen Inc., Korea). La herramienta VecScreen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) se usó para identificar y remover las secuencias del vector de clonación. Se ensambló una secuencia por clon (total=3), todas las secuencias ensambladas mostraron 100 % de identidad entre ellas. La secuencia final de 1.5 Kpb (disponible en el GenBank PP353584) se empleó para la búsqueda de similitud (BLASTn) y también se analizó mediante RFLPs virtuales en la plataforma iPhyClassifier (^{Zhao et al., 2009}) dispo- nible en https://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi.

Adicionalmente, esta secuencia del 16Sr del fitoplasma asociado a los síntomas de hoja pequeña se alineó (ClustalW) con 29 razas del grupo 16SrIII, siete espe- cies de ´Ca. Phytoplasma´, y una de Acholeplasma laidlawi (M23932); los análisis evolutivos se realizaron con MEGA X (^{Kumar et al., 2018}), usando el método de Máxima Parsimonia y un “bootstrap” de 1000 repeticiones. Además, las 13 regio- nes únicas de secuencias de oligonucleótidos (UOSRs, por sus siglas en inglés) en la secuencia del 16Sr de ´Ca. Phytoplasma pruni´ (JQ044393) se compararon usan- do ClustalW (^{Thompson et al., 1994}), con la secuencia parcial del 16Sr obtenida (PP353584).

Una secuencia parcial para el gen no ribosomal secA también se obtuvo para la muestra 16.1266, como un segundo código de barras de ADN (“DNA barcode”) para la identificación del fitoplasma asociado a los síntomas mencionados. La PCR semianidada se hizo empleando los pares de iniciadores SecAfor1/SecArev3 y Se- cAfor2/SecArev3, de acuerdo a Hodgets et al. (2008). La mezcla de la reacción usada fue la mencionada previamente, pero el producto de la primera ronda se diluyó 1/20 antes de usarse en la PCR semianidada. Los perfiles térmicos emplea- dos se muestran en el Cuadro 2. El amplicón se envió a Macrogen Inc. (Korea), se secuenció directamente y en ambos sentidos con el par de iniciadores usados en la ronda semianidada. La secuencia parcial obtenida (457 nt, GenBank No. Acc. PP375806) se comparó con secuencias de otros fitoplasmas usando el algoritmo BLASTn en GenBank. Además, ésta se alineó (ClustalW) con secuencias de secA de diez razas del grupo 16SrIII, siete especies de ‘Ca. Phytoplasma´, y una raza de Bacillus subtilis (D10279) para realizar un análisis evolutivo en MEGA X, usando el método de Máxima Parsimonia y un “bootstrap” de 1000 repeticiones. Árboles de Bocconia frutescens mostraron aglomeraciones (racimos) de hojas pequeñas en ramas (Figura 1A), brotaciones axilares múltiples o “escobas de bru- ja” (“witches’-broom”) con hojas pequeñas en el tronco (Figura 1C), defoliación y muerte descendente (Figura 1B), se observaron en áreas de sucesión secundaria,

Figura 1 Árboles de Bocconia frutescens (Papaveraceae) con síntomas asociados a fitoplasmas observados en la provincia de Cartago, Costa Rica; A) “escobas de bruja” (“witches’-broom”) y racimos de hojas pequeñas observados en algunas ramas; B) “Escoba de bruja”, defoliación y muerte descendente; C) Detalle de la brotación axilar múltiple con hojas de reducido tamaño. bordes de caminos, orillas de ríos y riachuelos, en varias localidades en la provincia de Cartago. Adicionalmente, árboles sintomáticos aislados en bordes de caminos se observaron cerca de la ciudad de Turrialba (Cuadro 1). Los síntomas se presen- tan en algunas ramas de los árboles enfermos. No se detectaron diferencias en los síntomas presentados por los árboles en las diferentes localidades. Para esta sinto- matología proponemos el nombre de hoja pequeña de Bocconia frutescens (BfLL, por su sigla en inglés). Todos los resultados confirmaron la presencia de fitoplasmas asociados a ár- boles de Bocconia con síntomas de hoja pequeña y escoba de bruja. Estructuras pleomórficas, desprovistas de pared celular, semejantes a fitoplasmas se observaron al MET solamente en el tejido del floema de los árboles sintomáticos de Bocconia (Figura 2A). En el tejido del floema de los árboles sanos de Bocconia no se observó ninguna estructura semejante a fitoplasmas u otras bacterias. La electroforesis en gel de las PCR anidadas (P1/P7, R16F2n/R2) mostraron fragmentos cercanos a 1.2 Kb en todas las muestras sintomáticas (n=18) y del control positivo, y ninguna amplificación de los árboles sanos y de la mezcla de control para la PCR (agua sus- tituyendo el ADN). Las secuencias obtenidas del ARNr 16S (ca. 1200 nt) de seis amplicones mostraron 100 % de similitud entre ellas. Las secuencias resultantes in- dicaron que el fitoplasma en B. frutescens se relaciona a diferentes razas del grupo 16SrIII, y por tanto es una raza relacionada a ´Ca. Phytoplasma pruni´ (JQ044393, ^{Davis et al., 2013}). Las secuencias del 16S de BfLL mostraron un alto porcentaje de similitud en el GenBank con “Mexican Xalapa periwinkle virescence phytoplas- ma” (99.67 %, KY778008-09), ´Ca. Phytoplasma pruni´ (99.50 %, MH428959), y “Milkweed yellows phytoplasma” (99.48 %, AF510724). De acuerdo a los resultados del iPhyClassifier, la secuencia parcial del 16Sr de 1.5 Kbp (muestra 16.1266, PP353584) mostró similitud de 98.87 % con el ´Ca. 

Figura 2 A) Cuerpos pleomórficos de fitoplasmas (») encontrados en el floema de árboles de Bocconia frutescens con síntomas de hoja pequeña y “escobas de bruja”, observados en la provincia de Cartago, Costa Rica. CW = pared celular; B y C) Perfiles de los RFLPs virtuales obtenidos en el iPhyClassifier del fragmento 16Sr F2/R2n del fitoplasma asociado a la hoja pequeña en B. frutescens (BfLL, GenBank Acc. No. PP353584) usando BstUI (C) y HpaII. (D). Fragmentos (pb) del marcador de peso molecular (MW): 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72. 

Phytoplasma pruni´ (JQ044393). Por tanto, el fitoplasma infectando B. frutescenses en la provincia de Cartago (Costa Rica) es un miembro de ´Ca. Phytoplasma pruni´ (^{Davis et al., 2013}), esto por el umbral de similitud (“similarity threshold”) para el gen ARNr 16S indicado en la nueva guía para la delimitación de especies de ‘Ca. Phytoplasma’ (^{Bertaccini et al., 2022}, IRPCM 2004). Además, los resultados indi- caron que la secuencia es diferente de los patrones de referencia de los subgrupos para 16SrIII establecidos previamente. El patrón de referencia con mayor similitud fue el 16SrIII-F (AF510724), con un coeficiente de 0.95, sugiriendo que el fitoplas- ma asociado a BfLL podría representar un nuevo subgrupo del 16SrIII. Los RFLPs simulados mostraron patrones virtuales que no corresponden al subgrupo 16SrIII-F empleando las enzimas BstUI y HpaII. El patrón virtual obtenido con BstUI corres- ponde al 16SrIII-D, mientras que el perfil para HpaII corresponde a los subgrupos 16SrIII- A, G, L y S (Figura 2B y 2C).

La secuencia 5’CAAGACTATGATGTGTAGCTGGACT3’, informada como la característica para ´Ca. Phytoplasma pruni´ (posiciones 258-282, JQ044393, ^{Davis et al., 2013}), es idéntica a la cepa encontrada en Bocconia (posiciones 237-261, PP353584). Al comparar las 13 UOSRs de ´Ca. Phytoplasma pruni´, reportadas por Davis et al. (2013), con las de la secuencia parcial 16Sr de BfLL (PP353584), se observa que siete de las 13 UOSRs corresponden a BfLL. Adicionalmente, se pre- sentaron polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) en otros cinco UOSRs, y un dinucleótido polimórfico en el UOSR entre las posiciones 817 y 828 (JQ044393) (Cuadro 3).

El dendrograma resultante del análisis filogenético para las secuencias parciales del gen ARNr 16S de 37 fitoplasmas (Figura 3) mostró que el detectado en B. fru- tescens conglomera con otras del grupo 16SrIII (soporte de 99 %). El fitoplasma del BfLL agrupó con una cepa variante del 16SrIII-F, previamente encontrada infec- tando C. roseus en Costa Rica (MH428959, ^{Villalobos et al. 2019}) y otra de Xalapa (México) (KY778008-09, ^{Pérez-López et al. 2017}). El grupo más cercano a éste, contiene cepas representantes de los subgrupos 16SrIII-F, C, D, M y N (AF510724, FJ376627, FJ376626, FJ376629, FJ226074, respectivamente).

La secuencia parcial obtenida para la secA del fitoplasma asociado a BfLL (PP375806) presenta una similitud de 94.97-97.81 % (valor e = 0) con diferentes razas de la enfermedad X (´Ca. Phytoplasma pruni´) disponibles en el GenBank. Adicionalmente, los análisis filogenéticos usando las secuencias parciales para el gen secA (Figura 4) posicionaron al fitoplasma asociado a BfLL, más relacionado con las secuencias secA de otros representantes de los subgrupos D y F del 16SrIII. ^{Pérez-López et al. (2017}) sugirieron que la raza Xalapa (KY778008) es un lina-

je norteamericano para el subgrupo del 16SrIII-J presente en Sur América. Sin em- bargo, de acuerdo con las relaciones filogenéticas que se obtuvieron (Figura 4), las razas encontradas en Costa Rica (PP353584 y MH428959) y Xalapa (KY778008)

podrían representar un potencial nuevo linaje geográfico y, a la vez, potenciales nuevos subgrupos del 16SrIII, reportados en Centroamérica y México. Adicional- mente, en Costa Rica se reportó una raza del 16SrIII-L asociada a la enfermedad del “cuero de sapo” de la yuca (^{Pardo et al., 2014}). También, otro representante del grupo 16SrIII se reportó infectando Spondias purpurea en El Salvador (^{Parada et al., 2006}). Estos hallazgos sugieren que diferentes razas del grupo 16SrIII pueden estar dispersos en la región de Centroamérica, representando un riesgo para la agri- cultura y los ecosistemas naturales.

El grupo 16SrIII de los fitoplasmas es altamente diverso, tiene una amplia dis- tribución geográfica y gran número de subgrupos asociados a una alta diversidad de especies vegetales hospederas (^{Zhao et al., 2009}, ^{Pérez-López et al., 2017}). De acuerdo con ^{Bertaccini et al. (2022}), 203 razas muestran identidades nucleotídicas de 98.80-100 % al compararse a la raza de referencia descrita para ´Ca. Phytoplas- ma pruni´. Este es el número más alto de razas reportadas para una de las 49 espe- cies de ´Ca. Phytoplasma´ aceptadas oficialmente. Las enfermedades asociadas con este grupo de fitoplasmas han sido informadas en diferentes países en Europa, Asia, América y África (^{Foissac y Wilson, 2009}). En las Américas, el número de reportes para Suramérica es particularmente alto (^{Fiore, 2023}; Pérez-López et al., 2016).

Figura 3 Dendrograma obtenido del análisis filogenético usando el método de Máxima Parsimonia en las secuencias parciales ARNr 16S del fitoplasma asociado a hoja pequeña de Bocconia frutescens (BfLL), 29 secuencias de razas del grupo 16SrIII, siete especies de ‘Ca. Phytoplasma´ y Acholeplasma laidlawii como grupo externo. El “bootstrap” seleccionado para la prueba fue de 1000 repeticiones. Los números de acceso en el GenBank para cada secuencia se muestran en paréntesis. El fitoplasma asociado a BfLL se resalta en negrita. * = nuevos subgrupos tentativamente. 

Para nuestro conocimiento, este el primer informe de la ocurrencia natural de una raza relacionada al ‘Ca. Phytoplasma pruni’ en Bocconia frutescens (Papavera- ceae) en Costa Rica o en el mundo.

Figure 4 Dendrograma obtenido mediante el análisis filogenético con Máxima Parsimonia usando las secuencias parciales del gen secA del fitoplasma asociado a hoja pequeña de la Bocconia frutescens, diez secuencias de secA de diferentes subgrupos 16SrIII, ‘Ca. Phytoplasma trifolii´ y Bacilus subtilis (grupo externo). El “bootstrap” seleccionado fue de 1000 repeticiones. Los números de registro en GenBank para cada secuen- cia se muestran entre paréntesis. * = tentativamente nuevo subgrupo.