Introducción

Uno de los enfoques principales de la biotecnología moderna es el uso del control biológico de fitopatógenos en la agricultura, que se define como la acción de agentes naturales efectivos para combatir enfermedades en cultivos, los cuales representan una alternativa para reducir el uso de productos químicos potencialmente dañinos para el medio ambiente y para la salud humana (^{Thambugala et al., 2020}). De los distintos tipos de agentes de control biológico, los agentes microbianos y en particular, bacterias del género Pseudomonas son una excelente opción para aplicarse en la agricultura (Santoyo et al., 2012).

El biocontrol mediado por cepas de Pseudomonas se realiza a través de mecanismos como la antibiosis directa, la competencia por nutrientes y por el espacio, la promoción del crecimiento vegetal y la inducción de resistencia sistémica en las plantas (^{Dimkić et al., 2022}). Diversos productos comerciales se han elaborado a partir de biomasa de Pseudomonas, por ejemplo: BioJect Spot-Less™, Bio-Save® 10LP, AtEze™, Cedemon, entre otros (^{Mark et al., 2006}). La producción de biomasa microbiana y metabolitos en medios de cultivo líquidos, es indispensable para el desarrollo de productos a base de cepas bacterianas como Pseudomonas; sin embargo, el uso de medios de cultivo comerciales en la multiplicación de los microorganismos representa un alto costo; por lo tanto, el uso de subproductos o desechos de la industria alimentaria representa una opción para reducir los costos asociados a la producción y recuperación de agentes de control biológico, al mismo tiempo que se logra la gestión y conversión de residuos en productos utilizables mediante la aplicación de tecnologías biotecnológicas. (^{Khalil et al., 2016}; ^{Sivakumar et al., 2022}; ^{Suryanti et al., 2015}).

Uno de los principales desechos de la industria alimentaria proviene del proce-

samiento del maíz (Zea mays), el cual está íntimamente relacionado con la cultura mexicana. La tortilla representa el principal alimento derivado del procesamiento del maíz (^{Hellin et al., 2010}); al respecto, se estima que en México el consumo anual actual de tortillas per cápita es de 120 kg (FAOSTAT, 2023). Para la producción de tortillas, los granos de maíz se someten a un proceso térmico alcalino llamado nixtamalización que consiste en la cocción de granos de maíz maduros con cal, los cuales son molidos para obtener una masa y finalmente son procesados (^{Serna-Saldivar, 2021}). La nixtamalización produce cambios químicos y nutricionales en el maíz y el principal subproducto del proceso de nixtamalización es el ‘nejayote’, considerado el agua alcalina de cocción del maíz; se estima que por cada kilogramo de maíz procesado se obtienen entre 7-8 litros de nejayote (DíazMontes et al., 2020).

El nejayote es considerado uno de los efluentes más contaminantes de la industria alimentaria. Este líquido contiene altas concentraciones de materia orgánica

disuelta, correspondiente a las estructuras del grano de maíz que se desprenden durante la cocción (principalmente endospermo y el pericarpio) y a la cal usada en el proceso (DQO > 28450 mg L-1). Además, el nejayote se caracteriza por tener un pH alcalino con un valor superior a 10 (^{Meraz et al., 2015}). El nejayote representa una fuente importante de azúcares fermentables y compuestos como proteínas, fibras, grasas, etc. Por lo anterior, la utilización del nejayote en otros procesos o purificación de componentes, lo vuelven potencialmente aplicable en la industria biotecnológica (^{Xu et al., 2021}).

Se ha demostrado que el nejayote puede usarse como un medio de cultivo alternativo para desarrollo de distintos microorganismos como Arthrospira maxima, Aspergillus oryzae, Bacillus thuringiensis, Chlorella vulgaris, Lactobacillus casei,

L. helveticus L. rhamnosus, así como para la producción de distintos metabolitos secundarios como enzimas, pigmentos o antibióticos (^{Bacame-Valenzuela et al., 2020}; ^{López-Pacheco et al., 2019}; ^{Ramírez-Romero et al., 2013}; Salazar-Magallon et al., 2015).

El objetivo de este trabajo fue evaluar el uso del nejayote como medio de cultivo alternativo para el crecimiento de Pseudomonas fluorescens NR113647 y para la producción de metabolitos secundarios con actividad antifúngica.

Materiales y Métodos

Material biológico. Se usó la cepa de Pseudomonas fluorescens NR113647 identificada previamente con base a las características morfológicas, culturales y bioquímicas del organismo, la identificación molecular se realizó por amplificación y secuenciación del rARN 16s y alineación con las bases de datos del Banco de Genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (^{Rodríguez-Romero et al., 2019}). La bacteria se cultivó en Agar ^{King B (KB) (King et al., 1954}) durante 7 días e incubó a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) para los ensayos posteriores. Las cepas de Aspergillus niger, Botrytis cinerea y Fusarium solani, utilizadas fueron aisladas y proporcionados por el Laboratorio de Tecnología Postcosecha del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional de México (CEPROBI-IPN). Se realizó la identificación molecular (^{Harwood, 1996}) en el Laboratorio de Diagnóstico Integral Fitosanitario (LADIFIT) del Colegio de Postgraduados. Los hongos se cultivaron de forma individual en medio Papa Dextrosa Agar (PDA, BD Bioxon, México) durante 4-7 días e incubaron a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) para los ensayos posteriores.

Obtención, acondicionamiento de nejayote y formulación del medio de cultivo.

El nejayote utilizado fue colectado de dos negocios procesadores de maíz ubicados

en la localidad de La Laguna Ticomán, Ciudad de México (19° 31’ 12” N, 99° 07’ 45” W y altitud de 2248 msnm) y posteriormente se mezclaron. Para eliminar materia orgánica sedimentable, el nejayote se centrifugó (Centrífuga Beckman Coulter® J2-MC, California, EE.UU.) a 10000 rpm durante 15 min a una temperatura de 4 °C, se recuperó el sobrenadante y se midió el pH por electrodo de inmersión (HANNA pHep5®, Romania). Para la elaboración de los medios de cultivo, se realizó un diseño de tratamientos completamente al azar en arreglo factorial que resultó en un total de cuatro tratamientos; 1) Nejayote a pH 6 (N6), 2) Nejayote a pH 12 (N12), 3) Nejayote a pH 6 con 10 g L-1 de glicerol (Ngly 6) y 4) Nejayote a pH 12 con 10 g L-1 de glicerol (Ngly12). El pH del nejayote se ajustó con NaOH o HCl 1 N según fuera necesario. Se usó caldo de cultivo King B (KB) pH 6 como testigo.

pH y evaluación de la producción de biomasa de P. fluorescens. El cultivo se realizó en matraces Erlenmeyer de 250 mL, con 100 mL de cada uno de los diferentes tratamientos, se realizaron tres repeticiones independientes por cada tratamiento. Los matraces se esterilizaron (Autoclave Yamato Scientific co. Ltd, SM510, Japón) durante 15 min a 121 °C, se inocularon con 10 mL de Pseudomonas fluorescens NR113647 (106 UFC mL-1) y se incubaron a 25 ± 2 °C durante 72 h en agitación constante (120 rpm). Al finalizar el cultivo, el pH de los medios de cultivo se determinó por electrodo de inmersión (HANNA pHep5®, Romania) y se evaluó el desarrollo de biomasa de P. fluorescens NR113647 por el método de extensión en placa; para ello, se realizaron diluciones seriadas a partir de cada uno de los medios de cultivo, se sembraron en placas con agar cuenta estándar (ACS, BD Bioxon, México) y se incubaron a 25 °C durante 48 h.

Evaluación de la actividad antifúngica in vitro de los extractos de P. fluorescens. Para la obtención de los extractos antifúngicos, después de la incubación, cada uno de los tratamientos se centrifugaron (Centrífuga Beckman Coulter® J2-MC, California, EE.UU.) 15 min a 10015 xg a 4°C, se recuperó el sobrenadante, se filtró con membranas estériles (Cole Palmer, EUA) de 0.22 μm. El efecto antifúngico de los extractos se determinó con la técnica del medio de cultivo envenenado (Erhonyota et al., 2023); para ello, se preparó Agar Papa Dextrosa (PDA, BD Bioxon, México) al doble de la concentración recomendada por el fabricante (78 g L-1), el cual se esterilizó (Autoclave Yamato Scientific co. Ltd, SM510, Japón) durante 15 min a 121 °C. Posteriormente, el medio PDA (BD Bioxon, México) se enfrió a una temperatura de 45 °C, se mezcló con el sobrenadante filtrado de cada uno de los tratamientos en proporción 1:1, se depositaron en cajas Petri (90 x 15 mm) y se dejaron solidificar. Se usó medio PDA (BD Bioxon, México) a la concentración recomendada por el fabricante (39 g L-1) como testigo, se realizaron cinco repeticiones independientes por tratamiento. En el centro de las cajas Petri, se sembraron discos

de 5 mm de diámetro con micelio de cada uno de los hongos. El ensayo terminó una vez que el crecimiento de los hongos en el testigo negativo alcanzó el borde de la caja. El porcentaje de inhibición se calculó mediante la medición del diámetro de la colonia de cada unidad experimental, después se usó la fórmula: Inhibición (%) = [(Da-Db) / Da] x 100, donde Da (mm) es el diámetro de crecimiento de los hongos en la placa usada como testigo negativo y Db (mm) es el diámetro de crecimiento de los hongos en las placas del ensayo (^{Al‐Hetar et al., 2011}).

Identificación de los metabolitos antifúngicos de P. fluorescens. Para la identificación de los metabolitos se utilizó el extracto de medio de nejayote con mayor actividad antifúngica in vitro; el tratamiento se mezcló con acetato de etilo en una relación 1:1 y se agitó durante 2 h a 120 rpm. La fracción acuosa se desechó y la fracción orgánica se evaporó a presión reducida, para obtener extracto crudo seco. El extracto seco se suspendió en acetato de etilo a una concentración de 1 mg mL-1. Los estándares de fluoroglucinol y fenazina (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) se suspendieron en acetato de etilo a una concentración de 0.5 mg mL-1, se tomaron alícuotas de 50 µL y se sometieron a cromatografía de capa fina (TLC; silica gel. 60 F254, 20 X 20, 0.5 mm, Merck and Co, Inc) con un sistema solvente hexano:acetona 3:2. La placa se secó completamente y los compuestos se recuperaron y se detectaron a 254 nm (^{Suleimana et al., 2010}).

Para la identificación de cianuro de hidrógeno (HCN), se utilizó el método descrito por ^{Verma et al. (2007}). Se inocularon cajas Petri con agar de soya tripticaseína (AST, BD Bioxon, México) con 100 𝜇L del extracto del medio de nejayote con mayor actividad antifúngica, extracto de medio KB (testigo positivo) y agua destilada (testigo negativo); en la parte superior de la caja, se colocaron discos de papel filtro (Whatman no. 1) impregnados de ácido pícrico 0.5 % y carbonato de sodio 2 %, las cajas se sellaron y se incubaron a 30 °C durante 24 h. Después de la incubación, un cambio de color en el papel filtro indica producción de HCN positiva.

Para la identificación de sideróforos se usó el método de ensayo en placa CASagar (^{Schwyn y Neilands, 1987}). Se usó el complejo de cromo azurol S (CAS)/ Fe3+/ Hexadeciltrimetilamonio bromuro (HDTMA) como indicador. Para preparar 1 L de agar azul, se disolvieron 60.5 mg de CAS en 50 mL de agua mezclada con

10 mL de Fe III (1 mM FeCl3·6H2O en 50 mL de 10 mM HCl), después se mezcló con 900 mL de agar bacteriológico (15 g L-1) a pH 7. Las placas se inocularon con 1 mL del extracto de nejayote con mayor actividad antifúngica, 1 mL de extracto

de KB (testigo positivo) y 1 mL de agua destilada (testigo negativo). Las placas se incubaron durante 6 días. La producción de sideróforos se clasificó visualmente en el medio de cultivo en cuatro categorías: 1. Sin producción, 2. Baja producción (amarillo claro), 3. Alta producción (amarillo moderado) 4. Muy alta producción (amarillo).

Análisis estadístico. Los datos experimentales fueron analizados con el software SAS® Studio 3.82 (SAS Institute, Cary, NC), se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (*=p ≤ 0.05) para la comparación de medias de los tratamientos.

Resultados y Discusión

pH y evaluación de la producción de biomasa de P. fluorescens. Se recolectaron aproximadamente 40 L de nejayote, el pH después de la centrifugación fue 12.21, por lo que se ajustó a los valores correspondientes para cada tratamiento. P. fluorescens NR113647 fue capaz de crecer en todos los medios de cultivo de este estudio. La concentración de biomasa producida en los diferentes medios de cultivo fue variable, donde el mayor desarrollo celular se obtuvo en el medio KB (testigo) y no hubo diferencias estadísticas con relación a los medios 3 y 4; los tres medios fueron suplementados con glicerol en su formulación inicial. Los medios 1 y 2 (sin adición de glicerol) presentaron una menor concentración de biomasa con respecto al testigo y a los medios con nejayote que se les adicionó glicerol (Cuadro 1). Pseudomonas tiene requerimientos nutricionales simples debido a su capacidad para degradar una gran variedad de sustratos orgánicos, desde compuestos aromáticos hasta derivados halogenados y otros residuos orgánicos (^{Sah et al., 2021}). En este sentido, se ha demostrado la capacidad del nejayote para ser usado como medio de cultivo, ya que contiene azúcares fermentables a una concentración aproximada de

148.6 mg L-1 (^{García-Depraect et al., 2017}). Por otra parte, Pseudomonas es capaz

de utilizar el glicerol como fuente de carbono para la producción de biomasa (Poblete-Castro et al., 2020), además, se ha observado que Pseudomonas produce una mayor concentración de biomasa en los medios que contienen glicerol como fuente

de carbono, con respecto a los que tienen otras fuentes de carbono como glucosa o succinato (^{Nikel et al., 2014}).

Los valores de pH variaron durante el cultivo en todos los medios de cultivo utilizados. En los tratamientos que iniciaron con un pH 6.0 se observó un incremento del valor pH, mientras que en los cultivos que iniciaron con un pH 12 se observó un decremento de este (Cuadro 1). En los medios 1 y 2, donde había únicamente nejayote, no se observaron diferencias estadísticas (*=p ≤ 0.05). El valor de pH entre los tratamientos 3 y 4 tampoco mostró diferencias estadísticas (*=p ≤ 0.05). Por otra parte, el medio de cultivo utilizado como testigo, mantuvo un valor de pH bajo y significativamente diferente con respeto a los demás tratamientos (Cuadro 1).

P. fluorescens, y en general las células bacterianas, dependen de manera crucial del pH del medio en el que se desarrollan. Valores de pH cercanos a 7 son los adecuados para la mayoría de las bacterias. La autorregulación del pH que incluye la detección y adaptación al pH exterior es un mecanismo importante para el desarrollo microbiano. Al respecto, se han identificado numerosas adaptaciones que contribuyen a la homeostasis en un pH alcalino (Sánchez-Clemente, 2018). Cuando las bacterias se encuentran en condiciones alcalinas (pH<10), el transporte activo de protones o fuerza motriz de protones es fundamental para su adaptación a su nicho ecológico; el mecanismo incluye niveles elevados de transportadores y enzimas que promueven la captura y retención de protones (ATP sintasa y antiportadores de protones/catión monovalente). Además, se presentan cambios metabólicos, que conducen a una mayor producción de ácido y cambios en las capas de la superficie celular que contribuyen a la retención de protones en el citoplasma (^{Krulwich et al., 2011}; ^{Padan et al., 2005}). La tolerancia al medio alcalino y disminución del pH inicial (de 12 a 8 aproximadamente), resulta importante considerando que en México se establece que el intervalo permisible de pH para aguas residuales que se descargan a los sistemas de alcantarillado urbano o municipal es de entre 5.5 y

10.0 (NOM-002-ECOL-1996). Por lo anterior, el nejayote no debe de depositarse

en el alcantarillado municipal; por el contrario, podría en efecto ser utilizado como medio de cultivo para el desarrollo de biomasa y producción de metabolitos, considerando que el caldo de cultivo final usado tendría un valor de pH acorde a las normas de México y podría desecharse.

Evaluación in vitro de la actividad antifúngica de los extractos de P. fluorescens. El periodo de incubación, hasta que los hongos en el testigo negativo (PDA, BD Bioxon, México) alcanzaron el borde de la placa Petri, fue de 9 días para Aspergillus niger y Botrytis cinerea, mientras que para Fusarium solani fue de 14 días. El Cuadro 2 muestra los valores de crecimiento (mm) e inhibición (%) que generaron los distintos tratamientos en los hongos.

Los hongos utilizados en este estudio y cultivados en medio PDA tuvieron un crecimiento radial. Los extractos obtenidos del medio KB6 (testigo positivo) produjeron los mayores niveles y porcentajes de inhibición in vitro de todos los tratamientos. Botrytis cinerea fue el más sensible, ya que su crecimiento se inhibió en un 100 %. En otros estudios se ha observado distintos valores de inhibición que van desde 60 % hasta un 75-99 %, con extractos obtenidos de caldo nutritivo (^{Mikani et al., 2008}; ^{Wallace et al., 2019}).

En los tratamientos del testigo positivo para la cepa de Fusarium solani se obtuvo una inhibición de 66%, en comparación con otros estudios donde cepas de

P. fluorescens mostraron una inhibición que va desde 43 % hasta una completa inhibición (100 %) del crecimiento micelial de Fusarium spp. (^{Al-Fadhal, 2019}; ^{Trejo-Raya et al., 2021}). La cepa de Aspergillus niger fue la que desarrolló un mayor crecimiento, con una inhibición del 45 %; sin embargo, se ha reportado en otros estudios que P. fluorescens mostró una inhibición entre un 20-30 % en comparación con el control (^{Akocak et al., 2015}) y hasta un 78.77% del crecimiento micelial (^{Deshmukh, 2015}).

Los extractos obtenidos del medio N6 no inhibieron el crecimiento de ninguno de los hongos evaluados in vitro en este estudio; este comportamiento fue similar para los extractos obtenidos del medio Ngly6 que no inhibieron el crecimiento de Aspergillus niger y Fusarium solani, aunque para Botrytis cinerea se registró inhibición de 32 % aproximadamente. En contraparte, los extractos obtenidos de Ngly12 generaron valores de inhibición entre 14 y 25 % para Aspergillu niger y Fusarium solani, sin embargo, se observó una inhibición de casi 70 % en Botrytis cinerea. Los extractos obtenidos de N12 para los hongos Botrytis cinerea y

Aspergillus niger, generaron valores de inhibición numéricamente similares, pero significativamente diferentes a los obtenidos con los extractos del testigo positivo (KB6); para el hongo Fusarium solani no hubo diferencia estadística entre el medio KB6 y N12.

Debido a que la composición de los medios de nejayote es básicamente la misma en todos los tratamientos, los resultados de este estudio podrían sugerir que las diferencias en el efecto de inhibición está ligada a los valores iniciales de pH y a la adición de glicerol a los medios de cultivo; Saleh-Lakha et al. (2009) determinaron que los niveles de expresión génica para la producción de metabolitos por Pseudomonas mandelii fueron entre 539 y 6190 veces más bajos en medio con un pH de 5, que para valores de pH 8. Por otra parte, ^{Zhou et al. (2012}) observaron que para que una cepa de Pseudomonas exprese actividad antifúngica, el valor del pH del medio de cultivo debe ser al menos de 10. Los genes implicados en la producción de metabolitos se relacionan de forma directa con la transcripción de genes involucrados en la protección contra el estrés, así como daños en la membrana y pared celular; estos genes forman parte del sistema regulador global para la activación de la síntesis de antibióticos y cianuro (GaC) y el sistema represor de metabolitos secundarios (RsM), los cuales se ven influenciados de forma positiva por señales ambientales donde destacan valores de pH 8 (^{Anderson et al., 2017}; ^{Xue et al., 2013}). Con respecto a la adición de glicerol al medio, ^{Nikel et al. (2014}) concluyeron que el crecimiento de Pseudomonas en presencia de glicerol, altera la transcripción de alrededor de 104 genes que codifican actividades metabólicas y no metabólicas, las cuales podrían estar involucradas en la producción de metabolitos antifúngicos. En el caso del presente estudio, es probable que el cultivo de P. fluorescens NR113647 a pH 12 podría incrementar la expresión de la producción de metabolitos relacionados con el biocontrol.

Identificación de los metabolitos involucrados en la actividad antifúngi ca. La cromatografía en capa fina de los extractos crudos secos de P. fluorescens NR113647 cultivada en el medio de cultivo N12, mostró la presencia de al menos cinco compuestos, los cuales se compararon con los estándares de fenazina y fluoroglucinol (Cuadro 3). Los recorridos de los componentes eluidos podrían indicar que el extracto crudo seco contiene al menos un compuesto antifúngico que puede ser derivado del fluoroglucinol y que corresponde a la mancha 1. El fluoroglucinol es un metabolito con numerosos derivados y ampliamente reconocido por su capacidad antifúngica, algunas cepas de Pseudomonas producen 2,4-diacetilfluoroglucinol y sus intermedios monoacetilfluoroglucinol y fluoroglucinol (^{Biessy y Filion, 2021}). Por otro lado, la mancha 5 es la más próxima al estándar de fenazina lo que podría indicar la presencia de algún derivado de este componente, ya que se conoce que el género Pseudomonas produce ácido fenazina-1-carboxílico y 2-hi-

droxifenazina, los cuales son metabolitos con actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos (^{Castaldi et al., 2021}). A pesar de que no se pudieron identificar todos los metabolitos presentes en el extracto crudo seco, ^{Zhang et al., (2020}), observaron que Pseudomonas alberga genes involucrados en la producción de más de diez metabolitos como el diacetilfluoroglucinol, pioverdinas, pioquelinas, pirrolnitrina, HCN, etc., los cuales podrían corresponder al resto de los componentes eluidos en el ensayo de cromatografía de capa fina. Sin embargo, los resultados podrían no ser extrapolables en su totalidad y se requieren estudios profundos para la determinación de metabolitos en este estudio.

Para la identificación de la producción de HCN (Figura 1), en la placa testigo

(A) no se observó cambio de coloración. Los extractos obtenidos del medio KB6 (testigo) mostraron un color naranja en la periferia que indica que P. fluorescens NR113647 produce HCN en este medio de cultivo. La placa del extracto del medio N12 mostró un ligero color naranja-amarillo, por lo que se puede asumir que también hay una presencia de HCN, pero en cantidades menores con respecto a KB6. La producción de HCN por microorganismos juega un papel importante en la inhibición del crecimiento de diversos hongos y otros agentes bióticos fitopatógenos que incluyen malezas, insectos y nematodos, tiene un amplio espectro ya que interfiere directamente con la respiración celular en patógenos eucariotas, por lo que puede ser usada ampliamente como metabolito de biocontrol (^{Sehrawat et al., 2022}).

Con relación a la producción de sideróforos, según el ensayo en placa CASagar, descrito en la metodología (Figura 2), no se observó cambio de coloración en la placa de Petri con agua destilada estéril. En el medio KB6 se observó una coloración amarilla intensa que evidencia una gran proporción de estos metabolitos. Para

Figura 1 Identificación de la producción de cianuro de hidrógeno en placa de Petri. Testigo negativo de agua destilada (A), extractos libres de células de P. fluorescens NR113647 en medio KB6 (B) y extractos libres de células de P. fluorescens NR113647 en medio N12 (C). 

Figura 2 Identificación de sideróforos, placa de Petri con agua destilada estéril como testigo (A) y extractos libres de células de P. fluorescens NR113647 (B) (^{Trejo-Raya et al., 2021}) y extractos libres de células de P. fluorescens NR113647 en medio N12 (C). 

el caso del medio N12, se apreció una coloración amarilla pálida que evidencia una producción limitada de sideróforos. Estos metabolitos se reportan como uno de los principales compuestos de control biológico con efecto antifúngico por parte de P. fluorescens, los cuales permiten la adquisición de Fe del medio o sitio de colonización y así mantener el crecimiento normal de la bacteria (^{Rizzi et al., 2019}). Sin embargo, en el presente estudio, se observó que las condiciones del medio N12 no favorece la producción de sideróforos debido a la baja producción con respecto al testigo y por lo tanto no fueron los principales metabolitos de biocontrol.

El complejo de Pseudomonas fluorescens incluye a más de cincuenta especies diferentes de cepas asignadas taxonómicamente, la mayoría de ellas con aplica-

ciones potenciales en el biocontrol. Una alta proporción de estas cepas no se han secuenciado completamente y presentan una alta homología molecular, además se describen nuevas especies de forma frecuente (^{Garrido-Sanz et al., 2016}), por lo tanto, los resultados de esta investigación no se pueden correlacionar de forma directa para todas las poblaciones de P. fluorescens, sin embargo el uso de P. fluorescens NR113647 y este medio de cultivo propuestos, podría ser útil para la valoración del metabolismo de otras cepas y/o poblaciones genéticas del complejo P. fluorescens.

Conclusiones

En este estudio se investigó el uso potencial del nejayote como un medio de cultivo alternativo de Pseudomonas fluorescens NR113647. La cepa fue capaz de crecer en todos los tratamientos conteniendo nejayote; entre los extractos evaluados, el extracto de Nejayote pH 12 mostró los mejores resultados, ya que inhibió el crecimiento micelial in vitro de los hongos Botrytis cinérea, Fusarium solani y Aspergillus niger en 76.66, 64.55 y 26.56%, respectivamente. En el análisis de metabolitos antifúngicos del extracto de Nejayote de pH 12, se identificó la producción de cianuro de hidrógeno y sideróforos, así como la posible producción de compuestos derivados de fenazina y fluoroglucinol. La valorización del nejayote y uso a pH 12 sin adición de glicerol, representa una alternativa viable y amigable con el medio ambiente para su utilización como medio de cultivo de P. fluorescens NR113647, en la producción de biomasa y de extractos que contengan metabolitos secundarios de interés en la industria agrícola para el control de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos.