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Introducción
Los hongos fitopatógenos causan pérdidas significativas en cultivos agrícolas en todo el mundo, y las pérdidas económicas en el sector agrícola debidas a enfermedades fúngicas alcanza los 200 mil millones de dólares a nivel mundial (Horbach et al., 2011; Wang et al., 2022). Dentro de la amplia variedad de hongos fitopatógenos, la división Ascomycota incluye alrededor de 75% de las especies fúngicas que causan daños significativos a los cereales, frutas y hortalizas, siendo Alternaria, Fusarium, Diplodia, Monilinia, Penicillium, Botrytis, y Colletotrichum los géneros más importantes (Arroyave-Toro et al., 2017; García-Rico y Fierro, 2017; Hoffmann et al., 2013). Además, la división Mucoromycota también contiene especies patógenas de crecimiento rápido tales como Rhizopus spp., Mucor spp., Choanephora cucurbitarum, y Gilbertella persicaria (Benny, 1991; Hoffmann et al., 2013).
Aunque el control químico es esencial para limitar las enfermedades de plantas causadas por hongos patógenos, el uso indiscriminado de fungicidas químicos ha contribuido a la resistencia antifúngica, así como a la contaminación ambiental y al deterioro de la salud humana. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos alternativos para el control que tengan impactos mínimos en el ambiente y en la salud humana (Ginting et al., 1996; Ragazzo-Sánchez et al., 2011). El control biológico, incluyendo el uso de microorganismos o de ciertos metabolitos microbianos, ha resultado ser una alternativa viable para el control enfermedades fúngicas pre- y postcosecha (Juárez-Becerra et al., 2010; Pérez-García et al., 2011; Ragazzo- Sánchez et al., 2011).
Las bacterias del género Bacillus son actualmente de gran interés porque tienen múltiples mecanismos de acción para el control biológico de microorganismos fitopatógenos. Los mecanismos de biocontrol de las especies de Bacillus incluyen la competencia con el fitopatógeno por el sustrato, la estimulación de la defensa de la planta y la producción de enzimas orgánicas y líticas volátiles, así como compuestos antimicrobianos. Entre los compuestos antimicrobianos producidos por Bacillus spp., los lipopéptidos son de especial importancia, ya que estas moléculas son bioactivas contra una amplia gama de agentes patógenos (bacterias, hongos y oomicetos). Los lipopéptidos consisten de un péptido cíclico unido a una cadena de ácidos grasos que, con base en su estructura, se clasifican principalmente en tres grupos o familias: surfactina, iturina y fengicina (Bonmatin et al.,2003; Cawoy et al., 2014; Fira et al., 2018; Pedraza-Herrera et al., 2020).
La producción de lipopéptidos está influenciada por varios factores, como el tipo de cepa, la composición del medio y las condiciones de fermentación. El tiempo de fermentación puede influir en el tipo y la concentración de lipopéptido producido (Inès y Dhouha, 2015). Los lipopéptidos con actividad antimicrobiana, tales como las surfactinas, son producidos durante la fase exponencial del crecimiento bacteriano, mientras que los lipopéptidos con actividad antifúngica, tales como las iturinas y las fengicinas, son producidas durante la fase estacionaria (Abushady et al., 2005; Wang et al., 2008; Xu et al., 2020). Aunque la biosíntesis de lipopéptidos puede llevarse a cabo entre los 25 y 45 °C, la temperatura de fermentación también afecta el tipo de lipopéptido producido. En algunos tipos de cepas de Bacillus, se ha reportado que una temperatura de 37 °C favorece la producción de surfactina, mientras que una temperatura de 25 °C beneficia la producción de iturina (Abushady et al., 2005; Inés y Dhouha, 2015; Ohno et al., 1995).
En estudios previos se ha reportado la significativa actividad antimicrobiana de Bacillus amyloliquefaciens B17. Esta cepa, aislada de la rizósfera de las plantas del tomate, ha presentado una significativa actividad oomiceticida, aunque su actividad antifúngica aún no ha sido reportada (Ley-López et al., 2022; Ley-López et al., 2018). El objetivo de esta investigación fue optimizar la temperatura y el tiempo de fermentación para la producción de un extracto antifúngico de Bacillus amyloliquefaciens y determinar el efecto del extracto en el crecimiento micelial y la germinación de esporas de los hongos fitopatógenos Gilbertella persicaria, Choanephora cucurbitarum, Colletotrichum asianum y Botrytis cinerea.
Materiales y Métodos
Microorganismos y condiciones de cultivo. Los microorganismos usados en este estudio fueron suministrados por el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (Coordinación Regional de Culiacán). Bacillus amyloliquefaciens B17 (número de accesión del GenBank: KX953161), aislado de la rizósfera de cultivos de tomate en diferentes ubicaciones geográficas en Sinaloa, se mantuvo en un agar nutritivo (NA, BD Bioxon) a 27 °C. Gilbertella persicaria HP15 (números de accesión: KR076758 y KR076761), Choanephora cucurbitarum CCCFMX01 (números de accesión: OQ269823 y OQ269827) y Colletotrichum asianum UACH299 (número de accesión: MK016315) se cultivaron en Papa-Dextrosa-Agar (PDA, BD Bioxon) a 27 °C. Botrytis cinerea HF02 (números de accesión: OQ191231, OQ286120 y OQ286119) se mantuvo en placas con PDA a 22 °C.
Preparación del inóculo. Bacillus amyloliquefaciens, cultivado en un medio LB, se usó como inóculo. Las células bacterianas se obtuvieron mediante raspado de una placa NA y se agregaron a un matraz de 250 mL con 120 mL de caldo LB. Después de incubar a 27 °C y agitar a 150 rpm por 24 h, la concentración de las células bacterianas fue de 1.2 x 109 UFC/mL (según la escala de McFarland) (Ley- López et al., 2022).
Obtención de extractos crudos. Se agregaron ocho mililitros de inóculo en un matraz de 1 L con 200 mL de medio Landy (glucosa, 20 g/L; ácido L-glutámico, 5g/L; extracto de levadura, 1g/L; K2HPO4, 1g/L; MgSO4·7H2O, 0.5 g/L; KCl, 0.5 g/L; CuSO4·5H2O, 1.6 mg/L; Fe2(SO4)3 ·7H2O, 0.4 mg/L; MnSO4·H2O, 1.2 mg/L)
previamente ajustado a un pH inicial de 7. El medio Landy, un medio de cultivo habitual para la producción de lipopéptidos por Bacillus spp., se usó para llevar a cabo la fermentación en matraces agitados (230 rpm). Una vez transcurrido el tiempo de fermentación, las células bacterianas en el medio Landy se removieron por centrifugación a 10,000 rpm por 12 min a 4 °C, y se recolectó el sobrenadante libre de células. El sobrenadante se acidificó con 6N HCl a un pH de 2 y se almacenó toda la noche a 4 °C para precipitar los compuestos péptidicos. El precipitado se recuperó por centrifugación (10,000 rpm, 20 min a 4 °C) y se disolvió en 10 ml de agua destilada. El pH de la solución se ajustó a 8 con 0.5 M NaOH. Después, esta solución se filtró con membranas de nylon para obtener el extracto crudo del Bacillus. Debido a que un solo método es insuficiente para purificar los compuestos péptidicos, es común incluir múltiples pasos en la purificación de estos compuestos. Por lo tanto, para este estudio, se usó para la extracción una combinación de precipitación ácida, solubilización alcalina y filtración. Para la precipitación ácida, se redujo el pH del medio de fermentación (~2) con ácido clorhídrico concentrado. Así, las cargas negativas sobre las moléculas de los péptidos fueron neutralizadas, lo que reduce su solubilidad en la fase acuosa y facilita su separación por precipitación. Posteriormente, los compuestos que precipitaron se solubilizaron nuevamente en la fase acuosa al alcalinizar el medio (pH=8) y los compuestos peptídicos que no se solubilizaron fueron eliminados por filtración (Ley-López et al., 2022; Motta Dos Santos et al., 2016; Torres et al., 2016).
Optimización de la temperatura y tiempo de fermentación por RSM. Para determinar la temperatura y el tiempo de fermentación óptimos para la producción de un extracto crudo de Bacillus amyloliquefaciens B17 con la mayor actividad antifúngica, se usó un diseño compuesto central (DCC) con dos factores y cinco
niveles (temperatura de fermentación: 23.7, 25, 28, 31, y 32.2 °C, y tiempo de
fermentación: 25, 46, 95, 144 y 164.3 h). Trece combinaciones (incluidas 5 réplicas del punto central) de la temperatura y el tiempo de fermentación fueron llevadas a cabo de forma aleatoria (Cuadro 1). La variable de respuesta fue el diámetro de los halos de inhibición generados al colocar alícuotas (5 mL) de los diferentes extractos crudos, aplicados directamente como gotas sobre el medio (PDA) ya inoculado con 100 mL de la suspensión de esporas de G. persicaria (1 x 106 esporangiosporas/ mL).
Cuadro 1 Resultados experimentales de los halos de inhibición generadas por los extractos crudos de B. amyloliquefaciens obtenidos bajo diferentes condiciones de fermentación.
| Variables de proceso | Variable de respuesta | ||
|---|---|---|---|
| Corridas experimentales | Temperatura de fermentación (°C) | Tiempo de fermentación (h) | Diámetro del halo de inhibición (mm) |
| 1 | 28 | 95 | 8.9 |
| 2 | 31 | 46 | 0 |
| 3 | 25 | 144 | 11.8 |
| 4 | 25 | 46 | 0 |
| 5 | 28 | 25.7 | 0 |
| 6 | 32.2 | 95 | 0.9 |
| 7 | 28 | 164.3 | 13.0 |
| 8 | 28 | 95 | 7.7 |
| 9 | 28 | 95 | 10.0 |
| 10 | 28 | 95 | 11.1 |
| 11 | 23.7 | 95 | 9.1 |
| 12 | 31 | 144 | 7.6 |
| 13 | 28 | 95 | 10.8 |
Rendimiento del extracto crudo optimizado. Después de validarse las condiciones óptimas de temperatura y tiempo de fermentación, el extracto crudo optimizado se liofilizó (FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer, LABCONCO) y se pesó para determinar el rendimiento del proceso de fermentación. El extracto optimizado y liofilizado se almacenó a 4 °C para mayores análisis posteriores.
Determinación de la concentración efectiva media (CE50). Para determinar la concentración del extracto crudo optimizado que inhibe 50 % del crecimiento micelial (CE50), se agregaron diferentes concentraciones de extracto liofilizado (3.75, 7.5, 15, 30, 45, 60 μg/mL) a un medio PDA estéril (45 °C) antes de ser vertido en placas Petri. Como control se usó medio PDA sin extracto. Se dejó a las placas gelificar a temperatura ambiente durante 24 h, después de lo cual se
colocaron discos miceliales (6 mm de diámetro) de G. persicaria, C. cucurbitarum, C. asianum, y B. cinerea (después de 7 días de crecimiento) en el centro de las placas. Las placas con G. persicaria, C. cucurbitarum y C. asianum se incubaron a 27 °C, mientras que las placas con B. cinerea se incubaron a 22 °C hasta que el crecimiento micelial cubriera cada una de las respectivas placas control. El porcentaje de inhibición del crecimiento se determinó usando la siguiente fórmula (Ramírez-Benítez et al., 2019).
Por medio de los resultados del porcentaje de inhibición de crecimiento, se generó una curva dosis-respuesta y se determinó la CE50.
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI). La CMI se determinó de acuerdo a la metodología de Toral et al. (2018) con algunas modificaciones. Se agregaron cien microlitros de suspensión de esporas (1 x 106 esporas/mL) de cada hongo (G. persicaria, C. cucurbitarum, C. asianum y B. cinerea) en cada pozo de las microplacas con 900 μL del caldo papa-dextrosa (CPD, Difco) y diferentes concentraciones del extracto (0, 0.75, 1.5, 2.25, 3, 3.75, 4.5,
5.25, 6, 6.75, 7.5, 9, 10.5, 12, 13.5, and 15 mg/mL). CPD sin extracto crudo se usó como control. Las microplacas con G. persicaria y C. cucurbitarum se incubaron a 27 °C durante 48 h, mientras que C. asianum se incubó a 27 °C durante 96 h y las microplacas con B. cinerea se incubaron a 22 °C por 96 h. El experimento se llevó a cabo por triplicado y la CMI se determinó de forma visual como la concentración más baja del extracto optimizado que inhibió el crecimiento fúngico por completo.
Determinación de la concentración mínima fungicida (CMF). La CMF se determinó después de evaluar la CMI correspondiente. Se transfirieron alícuotas de 5 µL de cada pozo de las microplacas que no presentaron crecimiento de los hongos a placas PDA por triplicado. Las placas inoculadas se incubaron a 27 °C por 96 h para G. persicaria y C. cucurbitarum; 27 °C por 144 h para C. asianum y 22 °C por 144 h para B. cinerea. La CMF se determine como la concentración más baja de extracto que mata a cada uno de los hongos (Cortés et al., 2020).
Efecto del extracto crudo optimizado. Después de evaluar la CMI, se colocaron alícuotas de 10 µL de cada pozo de las microplacas con CPD, esporas fúngicas y diferentes concentraciones de extracto en portaobjetos y se observó el crecimiento
micelial y la germinación de esporas por triplicado usando un microscopio Imager A2 (Zeiss, Alemania).
Análisis de datos. Se analizaron los diámetros de los halos de inhibición por medio de regresión múltiple para determinar el modelo matemático que explica la variación en la variable de respuesta de manera adecuada. Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) para examinar la significancia estadística de los términos del modelo obtenido por regresión. Una vez obtenido el modelo ajustado de predicción para la variable de respuesta estudiada (diámetro de los halos de inhibición), se usó el método de deseabilidad numérica (D) para determinar la temperatura y el tiempo de fermentación que maximizó los diámetros de los halos de inhibición. El objetivo de la optimización fue encontrar los valores más altos posibles de D que estuvieran asociados con las condiciones óptimas de temperatura y tiempo de fermentación. Se usó el software estadístico Minitab (versión 18) para el diseño experimental y el análisis de regresión de los datos experimentales.
Resultados
Optimización de RSM. El diseño experimental (DCC) y los resultados de la variable de respuesta (diámetro de los halos de inhibición) generados por los 13 extractos de crudo se muestran en el Cuadro 1. El diámetro de los halos de inhibición varió entre 0 y 13 mm. Las variables de respuesta obtenidas de los 13 extractos crudos se analizaron por regresión múltiple y se creó un modelo matemático que explicara adecuadamente la variación en las variables de respuesta.
Los resultados del ANDEVA y el análisis de regresión para el modelo cuadrático del halo de inhibición aparecen en el Cuadro 2. El modelo de regresión explicó
94.23 % de la variabilidad total en los diámetros de los halos de inhibición, con un nivel de significancia de 0.05. El ANDEVA reveló que el valor p del modelo fue de 0.000, lo que implica que el modelo fue significativo (P < 0.05).
El modelo de regresión con variables codificadas obtenidas para predecir el diámetro de inhibición fue el siguiente:
donde Y corresponde al diámetro del halo de inhibición estimado y X1 y X2 son los valores codificados de temperatura y tiempo de fermentación, respectivamente. Los términos que tuvieron efectos significativos (p< 0.05) sobre el diámetro de los halos de inhibición fueron los términos lineales (X1, X2) y cuadráticos (X12, X22) de temperatura y tiempo de fermentación. La falta de ajuste de datos no fue significativa porque el valor p fue mayor a 0.05 para le prueba de falta de ajuste.
Cuadro 2 ANDEVA y análisis de regresión para la variable de respuesta (diámetro del halo de inhibición) generado por los extractos crudos de B. amyloliquefaciens obtenidos bajo diferentes condiciones de fermentación.
| Fuente | Coeficientes del modelo | Suma de cuadrados | GL | Media de cuadrados | Valor F | Valor p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Modelo | 275.94 | 5 | 55.19 | 22.88 | 0.000* | |
| Intercepto | 9.702 | |||||
| X1: Temperatura | -1.983 | 31.47 | 1 | 31.47 | 13.05 | 0.009* |
| X2: Tiempo | 4.720 | 178.25 | 1 | 178.25 | 73.91 | 0.000* |
| X1X2 | -1.05 | 4.41 | 1 | 4.41 | 1.83 | 0.218 |
| X 2 1 | -2.571 | 38.49 | 1 | 45.98 | 19.07 | 0.003* |
| X 2 2 | -1.831 | 23.32 | 1 | 23.32 | 9.67 | 0.017* |
| Residual | 16.88 | 7 | 2.41 | |||
| Falta de ajuste | 8.70 | 3 | 2.9 | 1.42 | 0.330 | |
| Error puro | 8.18 | 4 | 2.05 |
*Significativo (para un valor p <0.05); GL = grados de libertad; R2 = 0.9423; R2 ajustada = 0.9012.
Considerando solo los términos significativos, el modelo para el diámetro de los halos de inhibición (Y) se pueden reescribir de la siguiente manera:
La Figura 1 muestra la gráfica de superficie de respuesta obtenida con los datos estimados con el modelo de predicción matemático. Debido a que los valores deseados para el diámetro del halo de inhibición fueron los más altos, estos valores se encontraron en el área donde había valores intermedios de temperatura (T) y valores altos de tiempo de fermentación (t).
Figura 1 Gráfico de superficie de respuesta para el diámetro del halo de inhibición en función del tiempo y temperatura de fermentación.
La optimización se llevó a cabo usando el método de deseabilidad numérica
(D) para encontrar los valores más altos posibles de D (valores cercanos a 1), que están asociados con las mejores condiciones de fermentación. La temperatura y tiempo de fermentación óptimos fueron de 26.8 °C y 158.6 h, respectivamente. Estas condiciones óptimas corresponden a un valor de D = 1 (Figura 2).
Figura 2 Gráfico de optimización que muestra el efecto de cada factor (temperatura y tiempo) sobre la respuesta (halo de inhibición). Las líneas verticales y los números rojos representan la configuración óptima de los factores. La línea horizontal y el número azul representan la respuesta para el nivel óptimo de los factores.
Determinación de CE50, CMI y CMF. Para calcular la CE50 del extracto sobre G. persicaria, C. cucurbitarum, C. asianum y B. cinerea, los porcentajes de inhibición del crecimiento radial del hongo en medios sólidos se determinaron a diferentes concentraciones del extracto crudo. Estos resultados revelaron una reducción en el crecimiento radial en todos los hongos estudiados en todas las concentraciones (Figura 3). Las concentraciones de extracto crudo optimizados que inhibieron 50% del crecimiento radial (CE50) de los hongos G. persicaria, C. cucurbitarum, C. asianum y B. cinerea fueron 3.7, 22.6, 34.5 y 36.3 μg/mL, respectivamente. La CMI y CMF del extracto crudo optimizado se estimaron en 1.2 y 1.5 μg/mL para
G. persicaria; 5.25 y 6 μg/mL para C. cucurbitarum; 3 y 4.5 para C. asianum y para B. cinerea, se estimó que el CMI y el CMF tuvieron el mismo valor de 3 mg/ mL (Cuadro 3).
Figura 3 Efecto del extracto crudo de Bacillus amyloliquefaciens B17 sobre el crecimiento micelial. La inhibición del crecimiento fúngico radial en un medio sólido (PDA) se determinó a diferentes concentraciones del extracto crudo (0, 3.75, 7.5, 15 y 30 μg/mL). Esta serie de imágenes revelan una reducción en el crecimiento radial de todos los hongos evaluados: Botrytis cinerea (22 °C, 96 h), Colletotrichum asianum (27 °C, 168 h), Choanephora cucurbitarum (27 °C, 48 h) y Gilbertella persicaria (27 °C, 48 h). Estas observaciones corresponden a 3 repeticiones de cada serie.
Efecto del extracto crudo optimizado. El extracto crudo optimizado de B. amyloliquefaciens B17 tuvo efectos adversos sobre la germinación de esporas de los cuatro hongos (G. persicaria, C. cucurbitarum, C. asianum, and B. cinerea). A una baja concentración del extracto (1.5 mg/mL) en el medio de cultivo, se observó una reducción en la velocidad de germinación de las esporas (Figuras 4C, 5C, 6C y 7C), además del hecho de que las esporas germinadas presentan múltiples tubos germinativos (Figura 4C y Figura 5B) o las hifas generadas presentan abultamientos anormales (Figuras 4C, 6B y 7B). Se observó la presencia de células gigantes en G. persicaria y C. cucurbitarum (Figuras 4D y 5C), las cuales corresponden a esporas
Cuadro 3 CMI y CMF del extracto optimizado contra Gilbertella persicaria, Choanephora cucurbitarum, Colletotrichum asianum y Botrytis cinerea.
| Extracto crudo optimizado (mg/mL) | G. persicaria | C. cucurbitarum | C. asianum | B. cinerea | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CMI | CMF | CMI | CMF | CMI | CMF | CMI | CMF | |
| 0.75 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 1.5 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 2.25 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 3 | + | + | + | + | - | + | - | - |
| 3.75 | + | + | + | + | - | + | - | - |
| 4.5 | + | + | + | + | - | - | - | - |
| 5.25 | + | + | - | + | - | - | - | - |
| 6 | + | + | - | - | - | - | - | - |
| 6.75 | + | + | - | - | - | - | - | - |
| 7.5 | + | + | - | - | - | - | - | - |
| 9 | + | + | - | - | - | - | - | - |
| 10.5 | + | + | - | - | - | - | - | - |
| 12 | - | + | - | - | - | - | - | - |
| 13.5 | - | + | - | - | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - | - | - | - | - |
“+” = Presencia de crecimiento micelial; “-” = Ausencia de crecimiento micelial.
(B) esporangiosporas de Gilbertella expuestas a una dosis de extracto de 0.75 mg/mL; (C) esporangiosporas de Gilbertella expuestas a una dosis de extracto de 1.5 mg/mL; (D) esporangiosporas de Gilbertella expuestas a una dosis de extracto de 6 mg/mL; (E) esporangiosporas de Gilbertella expuestas a una dosis de extracto de 15 mg/mL. Cada imagen representa un consenso de 3 observaciones.
Figura 5 Efecto del extracto crudo de Bacillus amyloliquefaciens B17 sobre la germinación de esporangiosporas (27 °C, 48 h) de Choanephora cucurbitarum. (A) Control: esporangiosporas de Choanephora en un medio de CPD sin extracto; (B) esporangiosporas de Choanephora expuestas a una dosis de extracto de 0.75 mg/mL; (C) esporangiosporas de Choanephora expuestas a una dosis de extracto de 1.5 mg/mL; (D) esporangiosporas de Choanephora expuestas a una dosis de extracto de 2.25 mg/mL; (E) esporangiosporas de Choanephora expuestas a una dosis de extracto de 4.5 mg/mL. Cada imagen representa un consenso de 3 observaciones.
Figura 6 Efecto del extracto crudo de Bacillus amyloliquefaciens B17 sobre la germinación de conidios (27 °C, 96 h) de Colletotrichum asianum. (A) Control: conidios de Colletotrichum en un medio CPD sin extracto; (B) conidios de Colletotrichum expuestos a una dosis de extracto de 0.75 mg/mL; (C) conidios de Colletotrichum expuestos a una dosis de extracto de 1.5 mg/mL; (D) conidios de Colletotrichum expuestos a una dosis de extracto de 2.25 mg/mL. Cada imagen representa un consenso de 3 observaciones.
Figura 7 Efecto del extracto crudo de Bacillus amyloliquefaciens B17 sobre la germinación de conidios (27 °C, 48 h) de Botrytis cinerea. (A) Control: conidios de Botrytis en un medio de CPD sin extracto; (B) conidios de Botrytis expuestos a una dosis de extracto de 0.75 mg/mL; (C) conidios de Botrytis expuestos a una dosis de extracto de 1.5 mg/mL. Cada imagen representa un consenso de tres observaciones.
que solo presentan crecimiento esférico sin el desarrollo del tubo germinativo. Por otro lado, las esporas que germinaron en CPD sin agregar extracto (controles) presentaron una germinación normal, ya que las esporas germinaron y los tubos germinativos se elongaron para formar micelios sin abultamientos ni deformidades (Figuras 4A, 5A, 6A y 7A).
Discusión
En el presente estudio, se recalcó la importancia de la temperatura y el tiempo de fermentación para que Bacillus amyloliquefaciens produzca metabolitos secundarios, los cuales tienen el potencial de controlar hongos fitopatógenos. Los lipopéptidos son los metabolitos más ampliamente estudiados en numerosas especies de Bacillus (B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. megaterium, B. mycoides y B. thuringiensis) (Bhusal y Mmbaga, 2020; Ley-López et al., 2022; Li et al., 2020; Meena et al., 2020). En B. amyloliquefaciens B17, las condiciones óptimas para la producción de compuestos con actividad antifúngica fueron 26.8 °C y 158.6 h.
Bajo este esquema de producción y extracción, el rendimiento optimizado de B. amyloliquefaciens B17 fue de 756 mg de precipitado crudo por 1L de medio Landy, fermentado a 26.8 °C por 158.6 h. Este rendimiento fue mayor al reportado para la cepa B. subtilis KLP2015, que produjo un rendimiento de precipitado peptídico (específicamente identificado como lipopéptidos) de 545 mg/L (de caldo Luria Bertani, fermentado a 30 °C por 72 h) (Meena et al., 2020). Las diferencias en rendimiento pueden explicarse por el tipo de cepa usada, así como al tiempo y la composición del medio de fermentación usado (Cozzolino et al., 2020), ya que se ha reportado que los medios de fermentación ricos en sales de cationes divalentes (como el medio Landy) promueven una mayor producción de metabolitos secundarios tales como los lipopéptidos, dado que muchos de estos cationes (Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+) actúan como cofactores de enzimas bacterianas (Abushady et al., 2005; Wang et al., 2008; Xu et al., 2020). En cuanto a la actividad antifúngica, varios estudios han reportado la actividad antifúngica de los lipopéptidos producidos por Bacillus spp. contra varios hongos fitopatógenos (Rhizopus stolonifer, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus, Aspergillus niger y Mucor sp.) (Meena et al., 2020; Moyne et al., 2001; Tao et al., 2011; Toral et al., 2018; Villegas-Escobar et al., 2018; Yan et al., 2020; Yu et al., 2002; Zhu et al., 2020).
En un estudio previo con la misma cepa de B. amyloliquefaciens (B17), pero
con diferentes condiciones de fermentación (31 °C y 144 h), solo se reportó la producción de fengicina y surfactina, siendo estos compuestos responsables de la actividad oomiceticida contra Phytophthora capsici. En nuestra investigación es necesario identificar de antemano si hay lipopéptidos presentes en el extracto crudo y si estos compuestos son responsables por la actividad antifúngica del extracto (Ley-López et al., 2022).
El extracto crudo optimizado de B. amyloliquefaciens fue efectivo contra los cuatro hongos fitopatógenos. B. cinerea y C. asianum fueron los hongos más sensibles (CE =3.7 y 22.6 μg mL-1 respectivamente) y G. persicaria y C. cucurbitarum, los menos sensibles (CE = 36.3 y 34.5 mg mL-1 respectivamente).
En este estudio se demostró la actividad antifúngica del extracto crudo de B.
amyloliquefaciens B17 contra G. persicaria, C. cucurbitarum, C. asianum y B. cinerea, dado que el extracto produjo deformaciones en los tubos germinativos, así como protuberancias anormales en las hifas de los hongos. Se han reportado deformaciones en las hifas o segmentos hifales hinchados, similares a los obtenidos en este estudio, en B. cinerea, C. gloeosporioides, F. oxysporum y Mucor sp. por el efecto de lipopéptidos, principalmente fengicina e iturina A (Meena et al., 2020; Toral et al., 2018; Yan et al., 2020; Zhu et al., 2020).
Conclusiones
La temperatura y el tiempo de fermentación se optimizaron para la producción de extracto antifúngico por B. amyloliquefaciens B17. La actividad antifúngica del extracto optimizado producido por B. amyloliquefaciens B17 fue evaluado contra Gilbertella persicaria, Choanephora cucurbitarum, Colletotrichum asianum y Botrytis cinerea y se observó que el extracto producido bajo condiciones de fermentación óptimas (26.8 °C y 158.6 h) tuvo efectos adversos, no solo en el crecimiento micelial, sino también en la germinación de las esporas de estos cuatro hongos fitopatógenos.
