Introducción

El cultivo de papa (Solanum tuberosum) constituye el cuarto alimento más sembrado a nivel mundial; en México ocupa el cuarto lugar en superficie sembrada, superado únicamente por los granos básicos maíz (Zea mays), frijol (Phaseolus vulgaris) y trigo (Triticum aestivum) (SADER, 2022). La papa mexicana es altamente valorada en diversos países, por sus propiedades nutritivas y características externas. Además de surtir al mercado interno, los productores mexicanos exportan más de 2,500 toneladas (SADER, 2022). Sin embargo, los plaguicidas químicos (insecticidas, funguicidas, herbicidas) son la forma dominante en el control de plagas, impactando de manera negativa en la biodiversidad de los agro-ecosistemas (^{Chamorro-Anaya et al., 2020}). Actualmente, la investigación se enfoca en el entendimiento de las enfermedades donde eliminar al patógeno no es el objetivo, sino a pesar de su presencia, lograr buenos rendimientos para el agricultor (^{Rocha et al., 2019}); lo que ha incrementado el desarrollo de alternativas ecológicas como la microbiota vegetal, conformada por una gran diversidad de bacterias asociadas a las plantas dentro del tejido foliar, raíz, tallo y semilla sin provocar daño, dichas bacterias son conocidas como endófitas (^{Hallman et al., 1997}; ^{Strobel y Daisy 2003}; ^{Huang et al., 2008}; ^{Santoyo et al., 2016}). Actualmente, existe un gran interés en conocer las actividades benéficas, destacando que la diversidad y densidad de endófitos depende de diversos factores abióticos y bióticos (^{Pérez-Cordero et al., 2010}; Chamorro-Anaya et al., 2020). La interacción bacteria endófita-planta está relacionada en promoción de crecimiento vegetal y biocontrol de fitopatógenos, características importantes para uso agro-biotecnológico (^{Zgadzaj et al., 2015}; ^{Contreras et al., 2016}; Chamorro-Anaya et al., 2020). Los géneros más abundantes reportados como endófitos se encuentran Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Micrococcus, Pantoea y Microbacterium (Hallman et al., 1997; Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006). El Norte del estado de Sinaloa, se mantiene en primer lugar nacional en cuanto a superficie sembrada de papa, donde la principal problemática es la presencia de plagas y enfermedades asociadas a las condiciones climáticas, así como abuso de plaguicidas derivando resistencia por parte de plagas (SADER, 2022). Dado que existen diversas regulaciones internacionales para importar/exportar productos sin agroquímicos, es necesario implementar estrategias que promuevan el crecimiento vegetal y combatan plagas en los cultivos. No obstante, son pocos los trabajos que han reportado la diversidad de bacterias endófitas en planta de papa; en consecuencia, el objetivo de esta investigación fue identificar y caracterizar potenciales bacterias endófitas promotoras de crecimiento vegetal y capacidad antagónica para hongos fitopatógenos, optimizando así la producción de este tubérculo.

Se recolectaron 30 plantas completas de papa de la variedad Atlantic durante el ciclo 2022-2023 en parcela de la comunidad de El Gallo localizado en Guasave, Sinaloa; México, Longitud (dec): 108 Latitud (dec): 25. Las plantas fueron elegidas al azar y trasladadas al laboratorio para su análisis, separando tejido foliar, raíz y tallo, se lavaron en agua de grifo durante 5 min, retirando cuidadosamente las impurezas adheridas a estas. Posteriormente, el tejido vegetal se desinfestó en etanol al 70 % durante un minuto, se realizaron seis lavados en solución de hipoclorito de sodio al 1 % por 10 min y se adicionó Tween-80 al 10 % (v/v) durante 1 min; finalmente se realizaron seis lavados con agua destilada estéril. Se realizó el aislamiento de bacterias en medio de cultivo agar Lb por triplicado, utilizando la técnica de contacto directo con modificaciones, efectuando cortes transversales y longitudinales al tejido en condiciones asépticas, ubicando el corte de cara al medio de cultivo. Como control de esterilización se tomaron 100 µL de agua destilada del último lavado y se sembró bajo las mismas condiciones del tejido para posteriormente incubar a 27 °C durante ocho días (^{Yang et al., 2011}). Se llevó a cabo la purificación de cepas separando colonias que presentaban una morfología distinta y/o coloración hasta obtener cultivos con características morfológicas similares. La densidad poblacional de bacterias por tejido se determinó a través del conteo directo expresado como unidades formadoras de colonias (UFC g-1). La identificación de posibles bacterias promotoras de crecimiento vegetal para cada uno de aislados se realizó por triplicado; de manera cualitativa se evaluó la capacidad de producción de sideróforos en medio de cultivo agar de cromo azurol S (CAS), donde las colonias con zonas amarillo/naranja se consideraron como cepas productoras de sideróforos a partir de los 20 min y hasta las 24 h de acuerdo a la metodología descrita por ^{Schwyn y Neilands (1987}). Se evaluó la producción de quitinasas con el protocolo de ^{Shanmugaiah et al. (2008}), las colonias con halo claro se consideraron positivas. En placas de agar Pikosvkaya, se evaluó la capacidad de solubilización de fosfato considerando aquellas que formaron halos claros alrededor de la colonia como positivas (^{Pikosvkaya, 1948}). Como control positivo se utilizó la cepa (B25) Bacillus cereus (^{Figueroa-López et al., 2016}).

La capacidad antagónica in vitro se realizó, enfrentando las bacterias endófitas aisladas de plantas de papa con hongos fitopatógenos: Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii y Colletotrichum coccodes, aislados de plantas de jitomate (Solanum lycopersicum), y chile jalapeño (Capsicum annuum), reportados como causantes de la pudrición de raíz en plantas de jitomate por ^{FernándezHerrera et al. (2006)}. Los hongos fitopatógenos fueron donados por el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD) en Culiacán, Sinaloa. El ensayo se desarrolló utilizando la técnica de cultivo dual en PDA, tres repeticiones para cada evaluación, como control los aislados de hongos fitopatógenos en cultivo puro. Las cajas Petri inoculadas, se incubaron a 28 °C durante 10 días en cámara de crecimiento (Precision Scientific, Model 6LM, Winchester, EUA); el crecimiento radial de las colonias de hongos se midió cada 24 h en patógenos y antagonistas. El halo de inhibición, entre las colonias en confrontación, se midió al octavo día postincubación (^{Aquino-Martínez et al., 2008}). El antagonismo se evaluó registrando las siguientes variables: crecimiento radial del antagonista (CRA), crecimiento radial del patógeno (CRP) y el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR). El PICR se determinó al sexto día de post-incubación usando la fórmula de ^{Ezziyyani et al. (2004}): PRGI= [(R1R2)/R1] × 100, donde R1= crecimiento radial de la colonia testigo (patógeno) y R2= crecimiento radial de la colonia del patógeno en la confrontación in vitro.

La identificación molecular se realizó con los oligonucleótidos F2C (5’-AGAG-TTTGATCATGGCTC-3’) y C (5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’) (^{Shi et al., 1997}), amplificando el gen que codifica la subunidad 16S del ADNr, la purificación del producto de PCR se realizó con el kit Wizard® _SV Gel y PCR Clean-Up System. Posteriormente se envió al Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) en CINVESTAV-IPN para su secuenciación; las secuencias obtenidas se compararon con las depositadas en el GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica de los Estados Unidos (NCBI) utilizando el programa BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). El alineamiento de las bases se realizó en el programa Clustal W; las inferencias filogenéticas fueron obtenidas por método Neighbor Joining basado en el modelo kimura-2-parámetro con prueba bootstrap en el programa MEGA X.

Del tejido de las plantas de papa se obtuvieron cuatro cepas morfológicamente diferentes (dos aislados de raíz y dos de tallo), todos Gram positivas y de acuerdo a la secuenciación parcial del gen 16S ADNr, permitió identificar especies asociadas dentro de los Firmicutes, las cuatro cepas se identificaron como Bacillus sp. con identidades mayores al 97 %: B. cereus, B. tropicus, B. thuringiensis y B. fungorum (Figura 1). Los resultados obtenidos coinciden con estudios sobre diversidad en comunidades endófitas de raíz en maíz donde las bacterias asociadas son Firmicutes (Bacillus), Gammaproteobacteria (Pseudomonas) y Burkholderia spp. (^{Pereira et al., 2011}; ^{Ikeda et al., 2013}; ^{Sánchez-Bautista et al., 2018}). La capacidad de B. cereus PR2 y B. thuringiensis PR1 de promover crecimiento vegetal in vitro, coincide con lo reportado por ^{Barboza-García et al. (2023}), evaluando la actividad promotora de crecimiento vegetal in vitro de bacterias endófitas aisladas de diferentes tejidos de variedades de arroz, encontrando cepas del género B. cereus y B. thuringiensis, las cuales presentaron capacidad de promover el crecimiento en cultivo

Figura 1 Dendograma de Neighbor-Joining a partir de las secuencias del gen que codifica la subunidad 16S del ADNr de bacterias endófitas. 

de arroz mediante la solubilización de fosfato y producción de sideróforos, coincidiendo con los resultados obtenidos en esta investigación (Cuadro 1). Bacillus, es de gran interés en el ámbito de la investigación debido a su gran diversidad fisiológica; miembros de dicho género han sido aislados de especies silvestres de interés comercial como papa, trigo (Triticum spp.), arroz (Oryza sativa) y caña de azúcar (Saccharum officinarum) (^{Wang et al., 2019}; ^{Hassan, 2017}). La actividad promotora de crecimiento está asociada principalmente al aumento de la movilización de fosfato, con un efecto positivo en la promoción del crecimiento vegetal, actividad antagónica, producción de enzimas y sideróforos, que permiten a estos microorganismos ejercer su capacidad biocontroladora e inhibidora entre otras (^{Kloepper et al., 2004}; ^{Tejera-Hernández et al., 2011}; ^{Chamorro-Anaya et al., 2020}; BarbozaGarcía et al., 2023). Por otra parte, B. thuringiensis ha sido reportada como bacteria endófita con capacidad de solubilizar fosfato y producir sideróforos además de diversos metabolitos como antibióticos y enzimas extracelulares como proteasas y quitinasas, compuestos claves para la supresión de patógenos; coincidiendo con los resultados obtenidos en este trabajo. Adicionalmente, se ha reportado que diversidad de cepas de B. thuringiensis son eficaces como control biológico contra Sclerotinia sclerotiorum, insectos y nematodos que ocasionan graves problemas en

cultivos de interés económico (^{Martínez et al., 2020}; ^{Crickmore et al., 2020}; ^{Wang et al., 2020}; ^{Barboza-García et al., 2023}).

En el presente estudio, el efecto antagónico de los aislados (Cuadro 2); reveló que B. cereus PR2, presentó una capacidad inhibitoria superior al 50 % para P. capsici y S. rolfsii; y B. tropicus PT1 un 83.8 % ante S. rolfsii, de acuerdo con lo reportado por ^{Govin-Sanjudo et al. (2019}), donde evaluaron la actividad antagónica de cepas de Bacillus endófitas de la planta hiperacumuladora de níquel Leucocroton havanensis, frente a los hongos Alternaria alternata y a tres especies del género Fusarium, donde la cepa Bacillus sp. ER11 mostró el mayor porcentaje de inhibición ante los hongos, con valores superiores al 70 % en todos los casos. Existen pocos estudios sobre bacterias endófitas, diversidad, control de fitopatógenos mediante microorganismos antagonistas y su relación con la productividad en cultivo de papa. Este estudio muestra que las bacterias endófitas aisladas inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos, convirtiéndolas en una opción en el manejo integral en este cultivo, por lo que es importante dar continuidad a las investigaciones realizadas en laboratorio para determinar su potencial en campo.