Introducción

México es el principal productor mundial de nopal verdura (Opuntia spp.) con 13 mil hectáreas de tierra cultivada, alcanzando una producción de 869,956 t y generando ganancias de 2,962 millones de pesos en 2021. Los estados de Morelos, Ciudad de México y Estado de México contribuyen aproximadamente con el 75.6% a la producción nacional (SIAP, 2022). Esta verdura tiene un consumo per cápita anual de 6.3 kg y sirve como una fuente rica de carbohidratos (3-7%), fibra (1-2%), lípidos (0.2%), vitamina C (10-15 mg/100 g), proteínas (0.5-1%) y minerales (1-2%) (^{Martins et al., 2023}). Las plantaciones de nopal enfrentan desafíos originados por enfermedades causadas por diversos hongos, siendo la Mancha Negra (MN) una de las más comunes (^{Hernández-Sánchez et al., 2014}). La MN genera la pérdida total de la cosecha y se caracteriza por síntomas que se manifiestan de dos maneras: manchas circulares y patrones como mapas. La primera comienza con la aparición de pequeñas manchas verdes, que, después de una semana, se tornan verdosas rojizas a marrón oscuro y aumentan de tamaño, formando manchas circulares de 3 a 4 cm de diámetro. Posteriormente, estas manchas circulares se tornan negras con márgenes amarillos, atravesando el cladodio del nopal y causando desecación en las áreas afectadas (^{Quezada-Salinas et al., 2006}). Por otro lado, la expresión de síntomas en forma de mapa se caracteriza por la invasión parcial o total del cladodio con manchas de formas irregulares, exhibiendo síntomas similares a los de la forma circular (Quezada-Salinas et al., 2013). Varios hongos han sido reportados como agentes causales de MN en diferentes especies de la familia Cactaceae. Por ejemplo, Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium lunatum, Alternaria alternata y Curvularia lunata en plantaciones de Opuntia en Tlalnepantla, Morelos, México (^{Flores-Flores et al., 2013}); Pseudocercospora opuntiae en plantaciones en el estado de Jalisco, México (^{Ochoa et al., 2015}); Alternaria longipes, Colletrotrichum fructicola, Lasiodiplodia euphorbicola, L. iraniensis, L. jatrophicola, Neofusicoccum batangarum, N. hyalinum, N. batangarum, Neopestalotiopsis sp., y Nigrospora en Nopalea cochenillifera en Brasil (^{Conforto et al., 2019}; ^{Feijo et al., 2019}). En este contexto, la identificación de hongos causantes de enfermedades en cultivos de importancia económica, incluidas las plantaciones de Opuntia, es crucial para desarrollar estrategias efectivas de manejo y control, mejorando así la productividad y sostenibilidad del cultivo. En Colima, México, la MN sigue siendo un desafío importante para el cultivo de nopal verdura, sin embargo, los agentes fúngicos causales permanecen sin identificar. Esta brecha en el conocimiento específico impide la optimización del rendimiento y la creación de estrategias efectivas de manejo de patógenos. Consecuentemente, este estudio tiene como objetivo aislar, evaluar e identificar las especies fúngicas responsables de MN en plantaciones de nopal.

En abril y mayo de 2021, se llevó a cabo la recolección de cladodios de nopal en plantaciones comerciales de nopal verdura (O. ficus-indica) ubicadas en cinco comunidades del estado de Colima: Agua Dulce (19°17’85.2’’N, 103°52’10.7’’W), Juluapan (19°18’41.2’’N, 103°49’94.2’’W), La Limonera (19°18’50.0’’N, 103°49’17.2’’W), El Espinal (10°16’17.9’’N, 103°47’51.1’’W) y Las Guásimas (19°07’83.8’’N, 103°43’27.4’’W). La incidencia de la enfermedad se determinó visualmente en cada plantación calculando el porcentaje de plantas sintomáticas del total analizado. Para esta evaluación, se seleccionaron 10 plantas que mostraban síntomas de MN, recolectando un cladodio sintomático de cada una para el análisis. Estos cladodios se colocaron individualmente en bolsas de plástico y se transportaron al laboratorio en una nevera dentro de las primeras 24 h después de la recolección. Los cladodios se lavaron con agua de la llave y se secaron con toallas de papel. Posteriormente, se cortaron de cinco a seis fragmentos (0.5 cm2) de tejido sintomático, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1.5% (v/v) durante 1.5 min, se enjuagaron tres veces por un minuto cada una con agua destilada estéril y se secaron con toallas de papel estériles en una campana de flujo laminar (Labconco Inc., EE.UU.). Para evaluar la eficacia de la desinfección, se tomaron 100 µL del último lavado, se colocaron en agar dextrosa de papa (PDA, MCD Lab, México) y se incubaron durante siete días. De los fragmentos desinfectados, se obtuvieron otros seis fragmentos y se distribuyeron en una placa de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol (500 mg L-1) (^{Quezada-Salinas et al., 2006}; ^{Alonso-Díaz et al., 2007}); estos últimos se incubaron a 25 °C en la oscuridad de cinco a siete días y se observaron a intervalos de 24 h. De cada colonia fúngica emergente, se tomó una muestra, se colocó en el centro de una placa de Petri con PDA y se incubó bajo las mismas condiciones. Se realizó una prueba de patogenicidad con cada cepa fúngica aislada para confirmar si eran agentes causales de la MN en nopal. Para esto, se recolectaron cladodios sin síntomas de la enfermedad de plantaciones comerciales y se desinfectaron siguiendo el procedimiento reportado por Quezada-Salinas et al. (2006). Se hicieron incisiones (cinco por cladodio) en las superficies de los cladodios con un bisturí estéril, y se inocularon discos de micelio de 5 mm de cada cepa fúngica con siete días de crecimiento en estas heridas. Como tratamiento de control, el disco de micelio se reemplazó con un disco de PDA. Cada disco se cubrió con algodón humedecido con agua estéril durante 24 h, los cladodios se colocaron dentro de una bolsa de plástico para retener la humedad y se mantuvieron a 25 °C con observaciones realizadas a intervalos de 24 h. De los cladodios que mostraban síntomas de MN, se realizó el reaislamiento de la cepa fúngica para verificar los postulados de Koch (^{Volcy, 2008}; ^{Flores-Flores et al., 2013}). Las pruebas de patogenicidad se realizaron por triplicado. La identificación molecular de los hongos causantes de los síntomas más severos de la enfermedad se llevó a cabo utilizando los cebadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) para amplificar un fragmento de 500 bp de la región ITS del rDNA. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: una desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, seguida de 25 ciclos a 58 °C por 30 s (hibridación), 72 °C por 2 min (extensión), 95 °C por 30 s (desnaturalización) y una extensión final a 72 °C por 10 min (^{White et al., 1990}). Los productos PCR amplificados fueron secuenciados utilizando el método de secuenciación de Sanger en el Analizador Genético 3130 (Applied Biosystems) en el Laboratorio de Diagnóstico Integral de Sanidad Vegetal (LADIFIT) (https://www.colpos.mx/posgrado/ fitosanidad/ladifit.php) en el Estado de México, México. Para la identificación, las secuencias fúngicas se compararon con la base de datos depositada en GenBank NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica).

Entre las plantaciones analizadas, El Espinal mostró la incidencia más alta de MN con el 60% de las plantas afectadas, seguido por Agua Dulce (40%), La Limonera (35%), Las Guásimas (20%) y Juluapan (10%) (Figura 1). De los cladodios recolectados, se aislaron 35 hongos, 20 de los cuales exhibieron características

Figura 1 Plantas y cladodios con síntomas de Mancha Negra en cultivos de nopal verdura (O. ficusindica) en diversas plantaciones en el estado de Colima, México. A) El Espinal, B) Agua Dulce, C) Las Guásimas, D) Juluapan. 

morfológicas distintas en términos de color, textura y presencia de anillos. La mayoría de los aislados mostraron un crecimiento circular, márgenes completos, textura algodonosa y elevación plana (Figura 2). También hubo variación en el tiempo de crecimiento de la colonia; 14 hongos cubrieron la superficie de la placa de Petri dentro de los primeros cinco días, mientras que los restantes lo hicieron después de 10 días. En las pruebas de patogenicidad, solo seis de los 20 aislados indujeron síntomas asociados con MN, y tres de estos causaron síntomas severos de la enfermedad en los cladodios de nopal. Esto incluyó el ablandamiento de los cladodios y el desarrollo de manchas negras circulares e irregulares a lo largo del tejido de la planta. En general, los cladodios exhibieron lesiones de hasta 5 cm de longitud 10 días después de la infección fúngica. Los hongos que indujeron síntomas más severos de MN fueron identificados como Alternaria alternata (ID de GenBank: OP038904), Corynespora cassiicola (OP038906) y Neoscytalidium dimidiatum (OP038907) (Figura 3).

La MN en el nopal es una enfermedad causada por diversos hongos, lo que hace que la identificación del agente causal sea un paso crucial para implementar estrategias de control apropiadas. Este es el primer informe sobre hongos causantes de MN en plantaciones comerciales de nopal en Colima. Las especies fúngicas A. alternata, C. cassiicola y N. dimidiatum fueron identificadas como las que causan el daño más severo a los cladodios de nopal. En este estudio, se recolectaron 50 cladodios con síntomas aparentes de MN y se aislaron 20 hongos, mostrando diferencias en color, textura y presencia de anillos. Este número es menor que el reportado por ^{Conforto et al. (2019}), quienes obtuvieron 50 aislamientos de 180 cladodios. La discrepancia en el número de cladodios analizados puede explicar la diferencia en el número de hongos aislados en ambos estudios. Respecto a los hongos identificados en cladodios con MN, ^{Oliveira et al. (2018}) reportaron diversas especies de Colletotrichum (C. siamense, C. fructicola y C. karstii) en N. cochenillifera en Brasil; sin embargo, estos autores no evaluaron la patogenicidad de los hongos. ^{Quezada-Salinas et al. (2006}) aislaron e identificaron a C. gloeosporioides en cladodios de O. ficus-indica con síntomas de la MN en México; no obstante, este hongo no indujo la enfermedad en plantas sanas de nopal. Por otro lado, los hongos C. gloeosporioides, A. alternata, F. lunatum, C. lunata (^{Flores-Flores et al., 2013}) y Pseudocercospora sp. aislados de cladodios sintomáticos sí indujeron la enfermedad en plantas sanas (Quezada-Salinas et al., 2006; ^{Ochoa et al., 2015}), lo que significa que son agentes causales de la MN. De estas especies, solo A. alternata coincide con uno de los hongos aislados en las plantaciones de Colima, mientras que C. cassiicola y N. dimidiatum no han sido reportados como agentes causales de la MN en plantaciones de nopal. ^{Souza et al. (2010}) analizaron la diversidad de hongos causantes de enfermedades en palma forrajera (O. ficus-indica) cultivada en regiones áridas del noreste de Brasil. Basados en la caracterización morfológica,

Figura 2 Hongos aislados de los cladodios de nopal verdura con síntomas de Mancha Negra. Los aislamientos se encuentran depositados en la colección micológica de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima para una caracterización morfológica y molecular posterior. 

Figura 3 Hongos aislados de cladodios con síntomas de Mancha Negra que indujeron lesiones severas en la prueba de patogenicidad. Crecimiento en PDA de Alternaria alternata (anverso, A; reverso, B) y síntomas inducidos en el cladodio (E), Corynespora cassiicola (D, E, F), y Neoscytalidium dimidiatum (G, H, I). 

estos autores encontraron que Scytalidium lignicola, Alternaria tenuis, Macrophomina phaseolina, Cladosporium cladosporioides, Lasiodiplodia theobromae, Fusarium oxysporum f. sp. opuntiarum, C. lunata, Aspergillus niger, Nigrospora sphaerica, C. gloeosporioides, Exserohilum turcicum, Pestalotia pitospora, Rhizopus stolonifer, Rhizoctonia solani y Sphaceloma protearum son los hongos más comunes en plantas con síntomas de enfermedad. Recientemente, ^{Conforto et al. (2019}) identificaron a Alternaria tenuissima, A. longipes, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. siamense, F. lunatum, F. verticillioides, F. incarnatum, F. iraniensis, L. euphorbicola, L. pseutheobromae, L. theobromae, N. batangarum, Neopestalotiopsis australis, N. protearum, N. sphaerica y N. hainanensis como agentes causales de la MN en N. cochenillifera. Entre estos hongos, los del género Alternaria fueron los más comunes en cladodios con síntomas de enfermedad, mientras que L. iraniensis y F. lunatum causaron el daño más severo. A diferencia de hallazgos previos, la investigación actual identifica a A. alternata, C. cassiicola y N. dimidiatum como los hongos responsables de los síntomas más severos en cladodios de nopal. Estas diferencias pueden deberse a la especie de planta estudiada. Además, la diversidad de especies fúngicas identificadas como agentes causales de la MN puede atribuirse a diferentes factores como (i) diferencias ambientales en el área de estudio, (ii) actividades implementadas en cada zona para el rendimiento de la plantación, y (iii) la aplicación de fertilizantes y agroquímicos (^{Rodríguez, 2001}; ^{Pacasa-Quisbert et al., 2017}). Asimismo, el grado de patogenicidad de los agentes causales puede atribuirse a la producción de una variedad de proteínas, ácidos orgánicos y metabolitos secundarios con actividad citotóxica y fitotóxica. Por ejemplo, las especies de Alternaria producen toxinas específicas del huésped (es decir, AK, AAL y AF), que determinan la patogenicidad de estos hongos (^{Castaldi et al., 2023}). Específicamente, las toxinas AK y AF tienen como objetivo la membrana plasmática, lo que lleva a la pérdida de electrolitos y daño de la membrana en plantas susceptibles (^{Nakashima et al., 1985}; ^{Otani et al., 1995}). También se ha informado que C. cassiicola produce fitotoxinas conocidas como cassiicolinas, terpenoides, poliquétidos y metabolitos nitrogenados que son relevantes para la patogénesis del hongo (^{Yang et al., 2022}). En conclusión, este estudio identifica a A. alternata, C. cassiicola y N. dimidiatum como los principales hongos responsables de la enfermedad MN en plantaciones comerciales de nopal en Colima, siendo el primer informe de C. cassiicola y N. dimidiatum en este contexto. A pesar de hallazgos previos de diversos hongos asociados con MN en diferentes regiones y especies de plantas, estos tres hongos causaron los síntomas más severos en las plantaciones estudiadas. Esta discrepancia destaca el impacto de distintos factores en la prevalencia y severidad de la enfermedad. La identificación de estos agentes causales es crucial para desarrollar estrategias de manejo dirigidas a mitigar la MN en nopales.