Introducción

Fusarium oxysporum es un hongo del suelo cuyas especies incluyen una amplia diversidad de cepas responsables de marchitamientos o pudriciones en muchas especies vegetales, como plátanos y algodón (^{Khan et al., 2021}; ^{Mon et al., 2021}). En contraste, varias especies de Fusarium participan en el biocontrol de otros fitopatógenos como Botrytis cinerea (ascomiceto) y el oomycete Phytophthora capsici (^{Veloso y Díaz, 2012}). Los endófitos fúngicos confieren un biocontrol directo, ya sea por medio de la interacción con patógenos mediante el micoparasitismo y la antibiosis o de la competencia por nutrientes o nichos de raíces. El micoparasitismo es considerado uno de los principales mecanismos del antagonismo hongo-hongo; además, la actividad antagónica de los micoparásitos necrotróficos se atribuye a la producción de antibióticos, toxinas y enzimas hidrolíticas, tales como glucanasa, celulasa y quitinasa (^{De Silva et al., 2019}). Estas enzimas hidrolíticas producidas por F. oxysporum (en especial la pectinasa y la celulasa) pueden usarse para descomponer compuestos orgánicos naturales, así como para biodegradar diferentes sustratos orgánicos como bagazo de caña (^{de Almeida et al., 2019}), paja de arroz (^{Indira et al., 2016}), paja de moringa (^{Vázquez-Montoya et al., 2020}), utilizando fermentaciones sumergidas o en estado sólido (^{Hemansi et al., 2019}). Algunas cepas de Fusarium participan en formas beneficiosas para el ambiente, no sólo como un antagonista para fitopatógenos sino también como un productor de enzimas de interés industrial para favorecer la biodegradación de sustratos complejos (^{Xiros et al., 2009}). Dada la capacidad de algunas especies de Fusarium para secretar enzimas extracelulares de importancia industrial, es necesario estudiar la capacidad de especies de Fusarium para biodegradar sustratos complejos como fuentes de carbono, con el propósito de reducir los costos de producción de estas enzimas. Por ello, el presente estudio evaluó la producción potencial de enzimas (celulasa y quitinasa) por cinco cepas de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1 (FocR1) sembradas en cultivos sumergidos con diferentes fuentes de carbono.

Se utilizaron cinco cepas de FocR1. Estos hongos, relacionados con el plátano

(^{Florencio-Anastasio et al., 2022}) se obtuvieron de la colección fúngica del Laboratorio de Micologia del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), perteneciente al Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA, México). Estas cepas fúngicas están codificadas como CNRFMIC17188, CNRF-MIC17189, CNRF-MIC17190, CNRF-MIC17191 y CNRF-

MIC17192. La tasa de crecimiento radial (TCR) de las cinco cepas de FocR1 se estimó de acuerdo con ^{García-Espejo et al. (2016}). La cinética de degradación de los tres sustratos complejos [papel de filtro, papel periódico y quitina coloidal (Sigma®)] se determinaron por medio de la siembra de las cepas fúngicas en cultivos sumergidos, por 14 días a 25 ± 2 °C y 200 rpm. Cada ensayo se llevó a cabo por triplicado con el sustrato correspondiente y con la cepa fúngica estudiada. En resumen, se usaron tubos 50 mL-Falcon, cada uno de los cuales contenía 35 mL de un medio mínimo basal (BMM) [Na2HPO4 6 g L-1, KH2PO4 3 g L-1, (NH4)2SO4 2.64 g L-1, MgSO4•7H2O 0.5 g L-1, CaCl2 0.015 g L-1, MnSO4 3 g L-1, ZnSO4 3 g L-1], con un pH de 4.8, ajustado con un buffer de citrato de 0.05 M (García-Espejo et al., 2016). Luego se agregó el sustrato respectivo para degradar: a) 1% p/v de quitina, b) una tira (1x11cm) de papel de filtro, y c) una tira (1x11cm) de papel periódico. Cada tubo se inoculó con una concentración de suspensión de esporas (1x106 esporas mL-1) de la cepa fúngica correspondiente. Después de 7 y de 14 días, se tomaron alícuotas de 1.5 mL para determinar la actividad enzimática correspondiente. La actividad total de la celulasa se evaluó a partir del bioensayo con papel de filtro (FPase), y con la actividad de la endoglucanasa (CMCase) realizada por medio de la técnica DNS (^{Miller, 1959}; ^{Ghose, 1987}), y como D-Glucosa como blanco. La actividad de la quitinasa se realizó por medio del método descrito por ^{Vargas-Hoyos y Gilchrist-Ramelli (2015}). La producción de azúcares se determinó con el método de Miller (1959) usando N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) como blanco. El procedimiento para realizar las actividades enzimáticas fue descrito por ^{Hernández-Melchor et al. (2022}) y la medición se llevó a cabo a 540 nm con un lector de microplacas (Synergy 2, Biotek®). Cada unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 μmol min-1 de azúcar reductora y se expresó como equivalentes de glucosa bajo nuestras condiciones experimentales. Las actividades se expresaron en unidades internacionales por litro (IU L-1).

El experimento consisitió en un diseño completamente al azar, con cuatro tratamientos con tres repeticiones para cada cepa de Fusarium. La normalidad de los datos se verificó por medio de la prueba Shapiro-Wilks (P≤0.05). Luego, se realizó el análisis de varianza (ANDEVA) y la prueba de comparación de medias (Tukey, P≤0.05) mediante el programa estadístico SAS (Windows versión 6.2.9200) para evaluar las diferencias significativas entre parámetros (TCR y la capacidad de cada cepa de FocR1 para degradar tres sustratos complejos) y se expresaron como medias ± error estándar.

La TCR estimada para las cinco cepas de FocR1 se muestra en la Figura 1. La cepa CNRF-MIC17190 presentó diferencias significativas (Tukey, α=0.05) para la TCR (0.051 cm h-1) en comparación con las cepas restantes de FocR1. La TCR de CNRF-MIC17190 fue 1.2 mayor a la reportada por ^{Pal et al. (2019}) para F. oxysporum f. sp. lini (0.0399 cm h-1) sembrado a 25±2 °C y entre 21 y 23 veces mayor a lo reportado por ^{Scott et al. (2010}) para F. oxysporum f.sp lactucae (0.0022-0.0024 cm h-1) sembrado a temperaturas de entre 10 y 25 °C. La TCR de hongos filamentosos ayuda a conocer su crecimiento con el tiempo bajo ciertas condiciones de

Figura 1 Tasa de crecimiento radial (TCR) de cepas de Fusarium oxysporum f.sp. cubense Raza 1 (FocR1) en un medio PDA, a las 192 h. Letras diferentes en las barras son significativamente diferentes (Tukey; p≤0.05). Medias ± error estándar, n=3. 

cultivo, tales como la temperatura, el sustrato, pH y otras. Además, este parámetro permitió establecer el tiempo para operar bioreactores por lotes sumergidos específicos basados en el uso de microorganismos (^{Moore et al., 2020}; ^{Valle et al., 2022}). Las Figuras 2 a 4 muestran las actividades enzimáticas cuantificadas obtenidas para las cinco cepas de FocR1, a los 7 y 14 días mediante el uso de papel periódico, papel de filtro y quitina coloidal como fuentes de carbono. Al usar papel periódico, la producción de enzimas resultó en diferencias significativas (Tukey, α=0.05) entre cepas de FocR1; las actividades de celulasa más altas (FPasa y CMCasa) se registraron para las cepas CNRF-MIC17191 y CNRFMIC17192 a los 7 y 14 días (Figuras 2A y B), y la mayor actividad de quitinase se obtuvo para CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17189, a los 7 días (Figura 2C). Sin embargo, al usar papel de filtro como fuente de carbono, las cepas CNRF-MIC17191, CNRFMIC17192 y CNRF-MIC17190 a a los 7 y 14 días, respectivamente, presentaron diferencias significativas (Tukey, α=0.05) en la actividad celulasa, en comparación con el resto de las cepas de FocR1 (Figuras 3A y B). En el día 14, las cepas CNRF-MIC17189 y CNRF-MIC17192 presentaron la mayor actividad quitinasa (Figura 3C). Finalmente, cuando se aplicó la quitina como fuente de carbono, las

Figura 2 Actividad enzimática cuantitativa de cinco cepas de Fusarium oxysporum f.sp. cubense Raza 1 (FocR1) usando papel periódico como sustrato, a los 7 y 14 días. A) Actividad celulasa (FPase). B) Carboximetil celulasa (CMCasa), y C) Actividad quitinasa. Letras diferentes sobre las barras en las tres gráficas, son significativamente diferentes (Tukey; p≤0.05). Medias ± error estándar, n=3. 

Figura 3 Actividad enzimática cuantitativa como cinco cepas de Fusarium oxysporum f.sp. cubense Raza 1 (FocR1) usando papel de filtro como sustrato, a los 7 y 14 days. A) Actividad celulasa (FPase). B) Carboximetil celulasa (CMCase), y C) Actividad de quitinasa. Letras diferentes sobre las barras en las tres gráficas, son significativamente diferentes (Tukey; p≤0.05). Medias ± error estándar, n=3. 

Figura 4 Actividad enzimática cuantitativa de cinco cepas de Fusarium oxysporum f.sp. cubense Raza 1 (FocR1) usando quitina como sustrato, a los 7 y 14 días. A) Actividad celulasa (FPase). B) Carboximetil celulasa (CMCase), y C) Actividad quitinasa. Letras diferentes sobre las barras en las tres gráficas, son significativamente diferentes (Tukey; p≤0.05). Medias ± error estándar, n=3. 

cepas fúngicas presentaron diferencias significativas (Tukey, α=0.05) en la actividad enzimática. Las cepas CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17190, en el día 7, y las cepas CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17189 en el día 14, presentaron FPasa alta, respectivamente (Figura 4A). En el caso de la CMCasa, la cepa CNRF-MIC17192 presentó la mayor actividad enzimática, tanto a los 7 como a los 14 días (Figura 4B). Además, las cepas CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17192, a los 7 y 14 días, respectivamente, presentó una alta actividad de quitinasa (Figura 4C). En términos generales, la actividad enzimática varió, dependiendo de la fuente de carbono y la cepa fúngica. ^{Martinez-Pacheco et al. (2020}) mencionaron que los requerimientos nutrimentales de cada especie de Fusarium son específicos para la producción de diferentes actividades enzimáticas, debido a la abundancia o limitaciones de los macroo micronutrientes a lo largo del proceso de fermentación que altera la fisiología fúngica; además, la naturaleza de los residuos orgánicos podría influir sobre la expresión de los mecanismos enzimáticos que intervienen en su despolimerización con el tiempo.

Las actividades más altas de CMCasa regstradas para las cepas CNRF-

MIC17191 y CNRF-MIC17192 se obtuvieron a los 14 días, mediante el uso de papael periódico (1859 IU L-1) o quitina (1045 IU L-1) como fuentes de carbono, respectivamente. Dichos valores son comparables con los reportados por ^{Yuan et al. (2012}), quienes evaluaron la actividad de la celulasa de una cepa de F. oxysporum al usar carboximetilcelulosa como fuente de carbono en un cultivo sumergido (1430 IU L-1). En cambio, los valores de CMCasa mencionados por Yuan et al. (2012) fueron 2.8 veces más bajos que los registrados en el presente estudio por la cepa CNRF-MIC17192 (4063 IU L-1), cuando se usó papel de filtro como fuente de carbono. Por otro lado, los mejores resultados para la actividad de FPasa se obtuvieron para las cepas CNRF-MIC17191 y CNRF-MIC17192 en el día 7, al usar papel periódico (754 IU L-1 and 906 IU L-1, respectively) y papel de filtro (930 IU L-1 y 1011 IU L-1, respectivamente) como fuentes de carbono. Para las cepas CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17190, la mayor actividad de FPasa se detectó en el día 7, al usar quitina como fuente de carbono (2259 IU L-1 and 1859 IU L-1). Estos resultados son comparables a los reportados por ^{Ramanathan et al. (2010}), quienes estudiaron la capacidad enzimática de F. oxysporum usando 1 % de carboximetilcelulosa como fuente de carbono a 50 °C y un pH de 6 durante 12 d. Además, ^{Xiros et al. (2009}) obtuvieron valores similares de actividad de FPasa de F. oxysporum aislados de comino, que alcanzó valores máximos de 850 IU L-1 después de 70 h en un cultivo basado en mazorcas de maíz sin granos y en granos usados por cerveceros como fuentes de carbono. Asimismo, los resultados de FPasa usando quitina como sustrato son similares a los reportados por ^{da Rosa-Garzon et al. (2019}), quienes realizaron un cultivo sumergido con F. oxysporum en el cual la FPasa (~ 2000 IU L-1) se produjo a niveles similares en cultivos de caseína y harina de plumas. Con respecto a la actividad de la quitinasa, los resultados más significativos se consiguieron para las cepas CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17189 con el uso de papel periódico, para las cepas CNRF-MIC17189 y CNRF-MIC17192 con el papel de filtro, y para las cepas CNRF-MIC17188 y CNRF-MIC17192 con quitina como fuente de carbono. Existen algunos reportes científicos acerca de la capacidad de especies de Fusarium para producir quitinasas en cultivos sumergidos (^{Mathivanan et al., 1998}), aunque algunas especies pueden liberar quitinasas involucradas en el biocontrol de hongos fitopatógenos como Puccinia arachidis (^{Patil et al., 2000}). En este sentido, varios autores demostraron la capacidad de varias especies de Fusarium para usar sustratos complejos como fuentes de carbono para producir complejos multienzimáticos bajo un proceso controlado de fermentación en un bioreactor. Por ejemplo, F. verticillioides puede producir enzimas de celulosa por medio de carboximetilcelulosa o residuos de pasto (Andropogon gayanus) como fuente de carbono en cultivos sumergidos (^{de Almeida et al., 2019}; ^{Vázquez-Montoya et al., 2020}). ^{Indira et al. (2016}) estudiaron la capacidad de F. subglutinans para producir celulasas por medio de paja de arroz pretratado y preparado con agua dulce o de mar (277.5 U mL-1 and 126.72 U mL-1, respectivamente). ^{Martínez-Pacheco et al. (2020}) optimizaron la capacidad de F. solani para producir xilanasas extracelulares por medio del diseño Box-Wilson. Estas enzimas son relevantes para los procesos biotecnológicos (industria alimenticia, de papel y pulpa de celulosa, y química). Si bien muchas enzimas fúngicas han sido seleccionadas por su eficiencia para degradar sustratos complejos, su producción a gran escala es dependiente de varios factores como variaciones en pH, temperatura y concentración de sustratos para las enzimas (^{Hemansi et al., 2019}), los cuales deben ser estudiados y estandarizados para llevar a cabo la optimización de dicho bioproceso. Esto último resalta la importancia de nuestra investigación, para que, a pesar de que algunas cepas de Fusarium son conocidas por ser fitopatógenos, estos hongos también puedan producir complejos extracelulares multi-enzimáticos (enzimas celulasas y quitinasas, por ejemplo) que puedan ser caracterizados y purificados, ya que poseen características únicas en comparación con enzimas producidas por otros géneros fúngicos. Adicionalmente, algunas especies saprofitas de Fusarium tienen la capacidad de degradar diferentes sustratos (desechos agroindustriales) bajo cultivos sumergidos controlados en bioreactores, por lo que estas especies fúngicas pueden reducir los costos de producción de enzimas y permitir la separación de la biomasa fúngica del sobrenadante que contiene el producto objetivo a lo largo de un bioproceso, a diferentes escalas de producción. No obstante lo anterior, el uso adicional de especies o cepas de Fusarium debe ser cuidadosamente valorado para evitar implicaciones negativas al usar agentes fitopatógenos, así como para cumplir con ciertas evaluaciones de bioseguridad y riesgos ecológicos.

En conclusion, este trabajo demostró que algunas fuentes de carbono, tales como papel periódico, papel de filtro o la quitina, pueden ser inductores eficientes para la producción de celulasa y quitinasa por parte de Fusarium oxysporum f.sp. cubense Raza 1 (FocR1) en cultivos sumergidos. Estas cepas de FocR1 son especies fúngicas prometedoras, para futuras aplicaciones biotecnológicas, ya que crecen rápidamente bajo condiciones sumergidas controladas con la adición de sustratos de bajo costo, secretando y produciendo enzimas extracelulares importantes.