Introducción

El espárrago (Asparagus officinalis) es una hortaliza que tiene su centro de origen desde Europa Del Este, Cáucaso y Siberia (^{Faostat, 2019}). Sin embargo, en México, es una hortaliza captadora de divisas, ya que casi el 90 % de la producción se exporta a Estados Unidos de Norteamérica y Europa. El valor económico de la producción nacional en el 2018 ascendió a 7,723 millones de pesos, al producirse 206,225 t (SIAP, 2020). Sonora (129,808 t), Guanajuato (27,146 t), Baja California (27,070 t), Baja California Sur (16,917 t) y Querétaro (5,284 t) son los principales productores de esta hortaliza y concentran el 99% de la oferta de exportación nacional (^{SIAP, 2022}).

El espárrago es una planta perenne, diploide monocotiledónea, cuya parte comercial son los turiones que se desarrollan de yemas situadas en la parte apical del rizoma (^{Moreno-Pinel et al., 2021}). Una vez que los turiones alcanzan una longitud comercial se cortan con una cuchilla, haciendo una incisión entre la base del turión y el rizoma generando heridas en la planta con vulnerabilidad de entrada de patógenos (Moreno-Pinel et al., 2021). Dentro del género Asparagus sólo esta especie es de importancia económica (^{Faostat, 2019}).

A pesar de su importancia, el cultivo es afectado en todas sus etapas fenológicas por la pudrición del rizoma causado por especies del género Fusarium. La incidencia de este patógeno se refleja en el desarrollo de turiones (^{Quilambaqui et al., 2004}). Fusarium proliferatum es la especie de mayor importancia que se ha reportado como patógeno de presencia mundial y su importancia radica en la severidad con la que ataca el rizoma de genotipos susceptibles (^{Elmer, 1996}; ^{Moreno-Pinel et al., 2021}). Adicionalmente, Fusarium spp. se ha reportado como productor de toxinas presentes en turiones comercializables de espárrago. La presencia de estas toxinas de tipo Fumonisinas B1, B2 y B3 suponen un riesgo para la salud humana presente en turiones producidos en plantas enfermas (^{Seefelder et al., 2002}; ^{Liu et al., 2007}).

En el núcleo ejidal del municipio de Atenco, Edo. de México, el cultivo de espárrago ha tomado gran auge debido a su rentabilidad y adaptación a las condiciones edafoclimáticas de la zona. Actualmente, el cultivo se distribuye en 20 hectáreas, todas ellas con diferentes edades de plantación, niveles tecnológicos y manejo; sin embargo, en todas las zonas productoras se han presentado problemas de pudrición del rizoma derivando en pérdidas económicas directas a los productores. Atenco es una región con posibilidad de expandir el cultivo de espárrago y debido al incremento de la incidencia de esta enfermedad, se planteó el presente trabajo con el objetivo de identificar el agente causal de la pudrición del rizoma del espárrago, evaluar la patogenicidad con distintos métodos de inoculación y evaluar la severidad de los aislados obtenidos.

Colecta de tejido vegetal. Se realizó un muestreo dirigido a cinco plantas por parcela (cinco parcelas) que presentaban síntomas de declinamiento, marchitez y amarillamiento en etapa fenológica de floración-fructificación ubicadas en el municipio de Atenco, Edo. de México. La colecta se realizó con una pala desinfestada con alcohol al 70%, desenterrando parcialmente el rizoma y cortando de 5 a 10 cm de diámetro aproximadamente. Todos los sitios de muestreo tuvieron las mismas variables genotípicas y tecnificación baja. Se utilizó un navegador GPS portátil de la marca Garmin en Reach Explorer®, para georreferenciar cada punto de muestreo. Las muestras fueron etiquetadas, registradas con un I.D. (Cuadro 1), empacadas en bolsas de polipapel y transportadas en hielera para su procesamiento en un laboratorio de Fitosanidad Fitopatología, del Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, Edo. de México.

Aislamiento y purificación. Los tejidos de rizoma se lavaron con agua desmineralizada estéril para eliminar exceso de suelo. Cada muestra de rizoma se cortó en trozos de 1 × 1 cm con un bisturí previamente desinfestado con la ayuda de un microscopio de la marca Iroscope® YZ-6. Posteriormente el tejido se desinfestó con hipoclorito de sodio al 1% durante 2 min; se lavó con agua desmineralizada estéril tres veces y se transfirió a cajas Petri con Papa-Dextrosa-Agar (PDA) Difco Laboratories®. Por cada planta (cinco plantas por parcela), se sembraron seis trozos de rizoma por caja. Las cajas Petri se incubaron durante dos días a 28 °C en una estufa de cultivo Riossa® Serie-33. Cuando se observó crecimiento micelial se procedió a purificarlos por el método de punta de hifa a cajas Petri nuevas con medio PDA. Del crecimiento micelial por punta de hifa se procedió a obtener cultivos monospóricos. Mediante el raspado con una aguja de disección curva se transfirió el crecimiento micelial de punta de hifa a un tubo Falcon de 50 mL con agua desmineralizada estéril, se agitó con Vortex WiseMix® y se contabilizaron los conidios con un hematocitómetro Neubauer. Posteriormente se realizaron diluciones hasta 1 × 106 conidios mL-1. De la última suspensión se tomaron 100 μL, los cuales se vertieron en una caja Petri con PDA y se distribuyó con un asa Digralsky estéril, se incubó a 28 °C, hasta observar crecimiento micelial individual para obtener crecimientos monospóricos.

Identificación morfológica. La identificación morfológica se realizó con ayuda de claves taxonómicas reportadas por Leslie y Summerell (2006) y ^{Booth (1988}). Los aislados se sembraron en medio de cultivo Clavel-Agar para la producción de macroconidios. Posteriormente, se realizaron preparaciones fijas para observarlas bajo el microscopio compuesto (Velab VE-B2 de 10x y 40x) integrado al Programa Motic Images Plus v2.0. Se determinó coloración micelial, así como la morfología y morfometría conidial en 60 conidios por aislado con edad de 7 días después de siembra.

Pruebas de patogenicidad. Las inoculaciones se realizaron en plántulas de espárrago del genotipo Sulken de tres meses de edad. Se inocularon cinco aislados de Fusarium spp. a una concentración de 1x106 conidios mL-1 con tres repeticiones por tratamiento. De cada aislado se tuvieron rizomas sin inocular (testigos). Se establecieron tres métodos de inoculación:

Inmersión en tubos de ensayo 1. Se sumergió la zona radical de las plántulas en tubos de ensayo con 50 mL de 1 × 106 de suspensión conidial durante 30 min. (Modificado de ^{Farahani-Kofoet et al., 2020}).

Inmersión en tubos de ensayo 2. Se realizó la misma metodología previamente mencionada, pero en un volumen de 10 mL de suspensión conidial y se introdujo el rizoma durante 12 h.

Inoculación mediante papel absorbente. Círculos de 5 mm de diámetro de papel filtro Whatman No. 4 se embebieron en una suspensión de conidios de 1 x 106 durante 2 min. Posteriormente, se procedió a colocar los círculos de papel filtro sobre la zona apical del rizoma sin herida.

Los rizomas se evaluaron a los 7 días después de la inoculación. Posteriormente, se observó la colonización en microscopio estereoscópico y se reaislaron solo tres aislados que por sus características de colonización se evaluaron para determinar severidad.

Evaluación de severidad. Se siguió la misma metodología de inoculación previamente mencionado, con 10 repeticiones por tratamiento y testigo. Se realizó un registro fotográfico de la zona más afectada de cada repetición. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Canon® (Réflex EOS REBEL T7 de 20.2 mp). Un total de 120 fotografías se procesaron en GIMP® v2.10, para cuantificar área total en pixeles (At) y área dañada (Ad) para determinar severidad. El porcentaje de severidad se obtuvo con la fórmula:

Los datos se analizaron mediante un ANOVA en el programa SAS 9.4 para determinar el aislado más severo y el método de inoculación más efectivo de acuerdo al análisis de medias por el método de LSD de Fisher (^{Abramoff et al., 2004}).

Identificación molecular y análisis filogenético. Se realizó la extracción de ADN de tres aislados mediante la técnica de CTAB al 2% (^{Minas et al., 2011}). Se determinó la concentración y pureza de los ácidos nucleicos por espectrofotometría con NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific 2000, EE. UU.). La confirmación de la especie se realizó molecularmente por PCR con los iniciadores ITS 4/ITS5, EF688/ EF1521 y TUB T1/BT2B (Cuadro 2) en un termociclador T-100 (BioRad) con un

volumen final de muestra de 15 µL integrada por: 7.86 µL de agua HPLC, 3 µL de 5X de buffer PCR, 0.6 µL de dNTP´s, 0.18 µL de los iniciadores (10 µM) (SigmaAldrich, EE. UU.), 3 µL de DNA genómico (20 ng) y 0.18 µL (2U) de GoTaq® ADN polimerasa (Promega, EE. UU.) (Cuadro 2). Los fragmentos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % teñidos con bromuro de etidio y se visualizaron con luz UV en un fotodocumentador (UVP, Biolmaging Systems, Epi Chemi II Darkroom). Los productos de PCR se enviaron a secuenciar Macrogen®, Corea. Las secuencias se limpiaron y editaron con el programa BIOEDIT® para compararlos en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

Para el análisis filogenético se realizó una clasificación con el método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic) utilizando los parámetros estándares de MEGA 1. Las secuencias de F. verticillioides (EU364864.1) y F. fujikuroi (CP023090.1) se seleccionaron como especies de referencia para la construcción del árbol filogenético.

Identificación morfológica. Los síntomas observados en campo fue una marchitez y amarillamiento generalizado (Figura 1 A-B). Al realizar un corte transversal de la parte basal del tallo se observó necrosis y taponamiento de haces vasculares (Figura 1 D-F). En todas las siembras de tejido del rizoma de las cinco parcelas, se observaron crecimiento similar, por lo que se seleccionó un aislado por predio. En medio PDA, los aislados P1SIR y P5DR fueron de crecimiento radial con tonalidades blanco amarillo en el anverso y tonalidades amarillo café en reverso. El aislado P3DR se observó micelio de tonalidad blanco con características algodonosas y crecimiento radial. A los 10 días después de la siembra en todos los aislados se visualizó la presencia de monofiálides y polifiálides, así como falsas cabezas o agregados de microconidios con base aplanada, de igual manera se observaron cadenas de microconidios y sin presencia de clamidosporas. Los macroconidios proliferaron en medio Clavel-Agar donde la morfometría fue de 26.47 µm x 4.43 µm (P1SIR), 25.97 x 4.92 µm (P3DR) y 26.21 µm x 4.76 µm de largo y ancho (P5DR). Todos los macroconidios presentaron célula apical curva y célula basal en forma de pie, con tres a cinco septos. De acuerdo con Leslie y Summerell (2006) y ^{Booth (1988}), este hongo cumple con las características de Fusarium proliferatum, reportándose como parásito facultativo ocasionando síntomas similares a los reportados por ^{Seefelder et al. (2002}) y ^{Liu et al. (2007}).

Identificación molecular. Los productos resultantes de la extracción de ADN obtuvieron umbrales de concentración de 186.8 544 ng μL-1 y pureza 1.38 2.22 nm. El alineamiento de las tres secuencias en el banco de genes (GenBank) del NCBI confirmó la identificación de F. proliferatum con un 99 100% de homología

Figura 1 Síntomas de marchitez en cultivo de esparrago de 6 años de edad. A) Parcela de espárrago con síntomas de declinamiento generalizado; B) Planta con síntomas de marchitez generalizada; C) Planta con síntomas de marchitez inicial; D) Pudrición de rizoma causada por Fusarium proliferatum; E) Parte basal del tallo con síntomas de ahogamiento; F) Parte basal del tallo con taponamiento de haces vasculares. 

. Los aislados se registraron en el GenBank con las accesiones ON738483 (P1SIR), ON738484 (P3DR) y ON973801 (P5DR). La presencia y prevalencia de F. proliferatum como principal patógeno en espárrago se ha reportado en los principales estados productores de esta hortaliza (^{Quilambaqui et al., 2004}; CamachoAguiñiga et al., 2016). La incidencia de este patógeno en el rizoma, así como su prevalencia en áreas de producción en el municipio de Atenco, puede deberse a la movilización de material propagativo para el establecimiento de nuevas parcelas productoras de espárrago.

Por otra parte, la construcción del árbol filogenético permitió agrupar las tres secuencias en un grupo de acuerdo con la homología en ellas, y dejó como cla do externo la secuencia de F. verticillioides (EU364864.1). Esta especie estuvo distante del nodo principal de F. proliferatum de modo contrario que F. fujiku roi (CP023090.1), el cual se presentó en el mismo clado (Figura 2). La distancia y organización entre clados coincide con lo propuesto por ^{Aoki et al. (2014}) y ^{Mendoza-Ramos et al. (2021}); ya que, en el árbol filogenético que estos autores presentaron, F. proliferatum pertenece al complejo F. fujikuroi. Sin embargo, es necesario remarcar que F. proliferatum conforma un grupo evolutivo diverso, por lo que podrían requerirse estudios complementarios (Leslie y Summerell, 2006).

Figura 2 Aislados de F. proliferatum utilizados para las pruebas de patogenicidad por diferentes métodos de inoculación. A) Árbol filogenético concatenado de los aislados ON738483 (PISIR), ON738484 (P3DR) y ON973801 (P5DR) con los iniciadores ITS 4-ITS5, EF688-EF1521, TUB T1-BT2B. B) Colonización del rizoma por el aislado P1SIR, C) crecimiento micelial de Fusarium en anverso y reverso en medio PDA con 7 días de crecimiento, D) macro y microconidios a 40X. E) Colonización del rizoma por el aislado P3DR, F) crecimiento micelial de Fusarium en anverso y reverso en medio PDA con 7 días de crecimiento, G) macro y microconidios a 40X. H) Colonización del rizoma por el aislado P5DR, I) crecimiento micelial de Fusarium en anverso y reverso en medio PDA con 7 días de crecimiento, J) macro y microconidios a 40X. 

Pruebas de patogenicidad. Con el método de inoculación mediante papel absorbente, se evidenció distribución del inóculo únicamente en la parte de contacto del rizoma con papel filtro (Figura 3 B). Resultado coincidente con lo reportado por

Figura 3 Métodos de inoculación con aislados de Fusarium en rizomas de esparrago. A) Inmersión de rizoma por 12 h; B) Inoculación con papel filtro; C) Inmersión de rizoma por 30 min, mostrando el rizoma suspendido por malla desinfestada y papel absorbente húmedo dentro de una caja cuadrada estéril; D) Rizoma por el método inmersión por 12 h E) Rizoma por el método inoculación con papel filtro F) Rizoma por el método de inmersión por 30 min. 

^{Cardona-Piedrahita y Castaño-Zapata (2019}) los cuales utilizaron discos de agar con crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en contacto con la raíz de Solanum lycopersicum. El método de inoculación por inmersión por 30 min mostró crecimiento micelial uniforme de tonalidades blancas concentrado en el rizoma, debido a que este tejido es un reservorio importante de fuentes de carbono con alto contenido de carbohidratos, esto explica la colonización de F. proliferatum concentrada en el rizoma, ya que, si bien es cierto que en la raíz hay contenido de nutrientes, en el rizoma por ser un sitio de organogénesis hay niveles más altos de carbohidratos y aminoácidos (^{Farahani-Kofoet et al., 2020}).

En el método de inmersión en tubos de ensayo por 12 h ocurrió la misma colonización centrada en el rizoma; sin embargo, presentó una actividad fermentativa derivada de la ausencia de oxígeno y por lo tanto una pérdida en la estructura de pared celular del rizoma por efecto de hidrólisis (^{Corrales et al., 2015}), mostrando una maceración de la epidermis por este efecto. En este método, la maceración interfirió con la colonización de los aislados de F. proliferatum (Figura 3 D).

Determinación de severidad. La comparación de medias de los diferentes métodos de inoculación, mostraron que la presencia de necrosis y colonización del rizoma se expresó en el método de inoculación por 12 h (17.5%), seguido del método de inmersión por 30 min (16.1%), papel filtro (6.5%) y testigo (0.3%). Este último presentó oxidación natural del rizoma por ausencia del medio edáfico (Figura 4).

Figura 4 Porcentaje de severidad de tres aislados de F. proliferatum en espárrago bajo tres métodos de inoculación y un testigo sin inocular. 

Los resultados indicaron que el aislado P3DR fue el más severo (7.6% en papel filtro y 18.9% por el método de inmersión por 12 h) en todos los métodos evaluados, superando en promedio por 3.0 y 0.7 % al aislado P5DR y P1SIR (Figura 4). ^{Ángel-García et al. (2018}), evaluaron diferentes métodos de inoculación de Fusarium solani f. sp. passiflorae en plántulas de maracuyá (Passiflora edulis), donde obtuvieron un 100% de severidad de la secadera del maracuyá a los 6 días de la inoculación con el método de inmersión. En esta investigación, se obtuvo una severidad inferior al 19%; no obstante, se confirma el potencial de los aislados para inocular y causar síntomas, confirmando la patogenicidad de los tres aislados de F. proliferatum colectados en parcelas productoras de esparrago en Atenco, Edo. de México. La colonización en los rizomas de espárrago en este experimento correspondió a lo reportado por ^{Stephens y Elmer (1988}) y ^{Farahani-Kofoet et al. (2020}). De acuerdo con en el análisis de medias por el método de LSD de Fisher, se agruparon los tratamientos de inmersión (30 min y 12 h) en un bloque y el tratamiento por papel filtro y testigo en otro grupo. Por otro lado, entre los aislados de F. proliferatum se agruparon un grupo a P5DR y P1SIR, mientras que P3DR en otro grupo. Esto se confirma en la figura 4, donde se observa menor severidad de este último aislado en comparación con los aislados P5DR y P1SIR. La variación de severidad se ha reportado como factor de patogénesis, mencionando que este componente está estrechamente relacionado con la producción de enzimas degradadoras de la pared celular de la planta como factor de patogénesis para tener contacto con las fuentes de carbono del rizoma (Farahani-Kofoet et al., 2020).

Se determinó que el aislado P3DR fue el más severo de acuerdo con la colonización y determinación de pixeles observados en los experimentos de métodos de inoculación. Aunque los métodos de inoculación empleados en este estudio indujeron colonización de F. proliferatum en los rizomas, el método de inmersión de rizomas por 30 min fue el más efectivo.

Los aislados colectados en esta investigación se registraron con los I.D. de accesiones ON738484 (P3DR), ON973801 (P5DR) y ON738483 (P1SIR) en el banco de genes del NCBI.

Aplicando criterios morfológicos, genómicos y patogénicos se identificó Fusarium proliferatum como el agente causal de la pudrición del rizoma del espárrago (Asparagus officinalis) en el genotipo Sulken en el municipio de Atenco, Edo. de México. Este es el primer reporte de este hongo en el Edo. de México. Esta información permitirá operar bajo el principio de prevención y establecer medidas de manejo en parcelas productoras de espárrago en la zona.