Germoplasma evaluado

Se realizó una colecta de 14 razas de maíz, de noviembre a diciembre del 2020 en ocho municipios del estado de Puebla (Tabla 1). Las razas se identificaron de forma visual por el equipo experto del banco de germoplasma del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) del Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX), ubicado en Coatlinchán-Texcoco, Estado de México. En cada raza de maíz, se muestrearon 10 mazorcas representativas y típicas (con características particulares) de las razas en cuestión. En el laboratorio de calidad de grano, masa y tortilla del INIFAP en el CEVAMEX, se elaboraron tortillas de maíz de manera tradicional (maíz-masa-tortilla) (^{Salinas y Vázquez 2006}) por cada una de las razas. Primero se obtuvo la nixtamalización (100 g de maíz, 100 mL de agua destilada y 1 g de óxido de calcio a 105 °C sin fuga de vapor), el cual facilita el desprendimiento del pericarpio (proceso previo para la obtención de masa, la cual se fracciona en forma de bola para ser prensada), para luego elaborar la tortilla, y exponer a cocción (^{Rodríguez et al. 2017}).

Elaboración de la tortilla

Antes de la elaboración de tortilla se determinó el índice de flotación (IF) para conocer la dureza del grano (^{Vázquez et al. 2011}), para luego determinar los tiempos de cocción del grano, los cuales dependiendo de la dureza determinar el tiempo de cocción de acuerdo con lo siguiente: de 88 a 100% de IF se consideran muy suaves por lo que recibieron 25 min de cocción; maíces con valores de 63 a 87% de IF se consideran como suaves recibiendo 30 min de cocción; maíces de 38 a 62% de IF se consideran intermedios por lo que tuvieron 35 min de cocción; maíces de 13 a 37% de IF se consideran duros por lo que tuvieron 40 min de cocción; y maíces de 0 a 12% de IF se consideran muy duros recibiendo 45 min de cocción. El proceso de nixtamalización se realizó con 100 g de maíz, 100 ml de agua destilada y 1 g de óxido de calcio, todo se deposita en un vaso de precipitado de 200 ml, y se colocó en una parrilla a 105°C sin fuga de vapor, con el tiempo de cocción establecido por el IF de cada raza de maíz, donde recircule el vapor de agua para evitar pérdidas. Se obtuvo la masa, pasando por un molino de piedra el nixtamal donde se obtuvieron cristales de 20 g de masa y cada cristal se colocó en una prensa metálica para obtener el disco de la tortilla de maíz, con lo que se tendrá ya listo un comal de metal a 105°C para el cocimiento de las tortillas. Se determinó el porcentaje de la humedad del nixtamal (HN) y la masa (HM) por el método 44-15.02 de la ^{AACC 2000}. En el proceso de la elaboración de la tortilla, las tortillas tuvieron un diámetro promedio de 12 cm, en las tortillas frías se obtuvo la humedad de tortillas a las 24 y 48 h (HT24 y HT48). Con el texturómetro Brookfield^® modelo CT3 (Middleboro, MA, USA), se determinó la fuerza requerida para romper la tortilla a las 24 y 48 h (FR24 y FR48), se reportó en gramos-fuerza (g_f), las tortillas frías se empacaron en bolsas de plástico con sellado ziploc^®, y se almacenaron a 4 °C (^{López-Morales et al. 2021}).

Obtención del complejo de hongos en la descomposición de las tortillas

De cada raza de maíz se tomaron 10 tortillas las cuales fueron sometidas a humedad relativa de 80 ± 10%, y temperatura ambiente para su descomposición, en un espacio con condiciones de limpieza y desinfección, escasa ventilación y sin luz natural directa para la producción del complejo (^{Aragón et al. 2016}). El complejo de hongos fue cultivado en bolsas de plástico biodegradable de 33.5 x 20.5 cm, en las que se colocó una tortilla; para luego con un atomizador asperjar 1 mL de agua purificada, en ambas caras de la tortilla, y cerrar doblando la parte superior de la bolsa, para después colgarla en un tendedero de cuerda de rafia y mantenerlas a temperatura de 26 ± 2 °C en un cuarto cerrado y designado para este fin. Cada una de las 10 tortillas de cada raza se consideró una repetición.

Se registró la temperatura y humedad relativa cada seis horas durante el crecimiento del micelio del hongo que duro un mes y medio. Una vez desarrollado el complejo de hongos en cada tortilla, se retiraron de las bolsas, y se colocaron sobre papel filtro para su secado a temperatura ambiente. Seca la tortilla, se removió el micelio y las esporas con una brocha de una pulgada, el micelio obtenido se tamizó con un tamiz de 20 mm, se registró el pesó del complejo de hongos (PCH) y se colocó en bolsas de plástico de 6 x 10 cm, para luego guardar en un lugar seco a temperatura ambiente hasta su uso (^{Aragón et al. 2016}, ^{Serratos et al. 2017}).

Identificación de los hongos en la tortilla

La purificación del complejo de hongos consistió en el aislamiento de los hongos encontrados en las tortillas de cada una de las 14 razas de maíz, en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA, BIOXON^®) en cajas Petri de 90 x 15 mm de SYM Laboratorios. En las esporas del complejo de hongos, se realizaron diluciones de 1:10 a 1:1 000 000, las cuales se sembraron con dos repeticiones, y se incubaron a 30 °C, y revisar cada tercer día, con la finalidad de obtener la concentración a la cual crecieron las colonias por unidades formadoras de colonias (UFC) de los respectivos géneros de hongos. Una vez conociendo la concentración óptima de las diluciones probadas se obtuvieron un promedio de 70 UFC/ml (en la dilución 1:1000), se seleccionaron las cepas para hacer resiembras de las respectivas colonias que crecieron aisladas, este proceso se repitió hasta obtener un cultivo puro de cada especie. Posteriormente, se realizó el microcultivo de cada cepa, para lo cual se tomaron muestras directas de cada especie de hongo purificado, para después teñirlas con azul de algodón bajo la metodología de ^{Bonifaz (2015)}, que consiste en poner en laminillas una gota de 30 μL de azul de algodón y observar en el microscopio de fluorescencia OLYMPUS Bx5^®, las características morfológicas para obtener la caracterización microscópica correspondiente. A las cepas purificadas, se les realizó un sembrado masivo para obtener la caracterización macroscópica e identificar cada uno de los hongos (^{Aragón et al. 2016}, ^{Serratos et al. 2017}).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza por cada una de las variables reportadas bajo el diseño experimental completamente al azar, con su respectiva comparación de medias con la prueba de Tukey (α = 0.05); así mismo, se llevó a cabo un análisis de correlación de Pearson con todas las variables evaluadas. Todos los cálculos y pruebas estadísticas se realizarán con el programa estadístico SAS^® versión 9.0 (^{SAS Institute 2002}), con un nivel de confianza del 95%.

Peso del complejo de hongos (PCH)

En PCH los promedios mayores estadísticamente fueron para las razas Naltel de altura (0.69 g) y Arrocillo amarillo (0.68 g), mientras que las razas Coscomatepec (0.31 g), Ancho (0.30 g), Bolita (0.26 g) y Charqueño (0.24 g) tuvieron el promedio más bajo estadísticamente. En tanto, entre los promedios intermedios estadísticos fueron para las razas Elotes cónicos (0.54 g el mayor valor) y Cónico (0.43 g el menor valor) de la prueba Tukey (α = 0.05) del PCH de tortilla (Tabla 2).

Características de calidad

De acuerdo con los índices de flotación los granos de las diferentes razas tuvieron diferente dureza de grano y tiempo de nixtamalización. La raza Arrocillo blanco tuvo granos muy duro y tiempo de nixtamalización de 45 minutos; mientras que las razas Arrocillo amarillo y Bolita tienen grano duro, con tiempo de nixtamalización de 40 minutos; en tanto, que las razas Naltel de altura, Tablilla de ocho, Chalqueño y Tuxpeño tuvieron grano de dureza intermedio, con tiempo de nixtamalización de 35 minutos. En lo que corresponde a las razas Celaya y Pepitilla tuvieron un grano suave, con tiempo de nixtamalización de 30 minutos, mientras que las razas Ancho, Cónico, Cacahuacintle, Elotes cónicos y Coscomatepec tuvieron grano muy suave, con tiempo de nixtamalización de 25 minutos. Al respecto, se sabe que, en granos duros (menor IF) tienen mayor cantidad de amilosa, lo que causa una descomposición más fácil y rápida que en granos suaves (mayor IF). Esto se vio reflejado en la raza Arrocillo blanco (con IF = 7.5, grano muy duro), que tuvo un promedio de PCH de 0.43 g por tortilla, mientas que la raza Ancho (con IF = 100, grano muy suave), tuvo un promedio de PCH 0.30 g por tortilla.

Para la humedad del nixtamal (HN), los valores extremos máximos y mínimos los tuvieron las razas Pepitilla (49.7%) y Chalqueño (44.1%); en tanto, que la mayor humedad de la masa (HM) la tuvieron las razas Pepitilla (60.9%) y Tablilla de ocho (51.5%); mientras que para la humedad de tortillas a las 24 y 48 horas (HT24 y HT48) los valores contrastantes los tuvieron las razas Tuxpeño (42.7 y 45.9%) y Tablilla de ocho (34.9 y 31.3%) a las 24 y 48 h, respectivamente.

Se encontraron correlaciones significativas entre la humedad del nixtamal con el IF (r = 0.41*), también se detectaron correlaciones para la humedad de masa y humedad de nixtamal (r = 0.46**), también para humedad de tortilla a las 24 h con humedad de masa (r = 0.41*). Para la humedad de tortilla a las 48 h se detectaron correlaciones para humedad de nixtamal (r = 0.58**), humedad de masa (r = 0.67**), y humedad de tortilla a las 24 h (r = 0.57**).

Para la fuerza de rompimiento a las 24 (FR24) y 48 (FR48) horas, los resultados indican que las razas de maíz con mayores valores para la FR24, fueron para Chalqueño (590 g_f) y Cónico (570 g_f), mientras que el menor valor lo tuvo la raza Cacahuacintle con 266 g_f. En tanto, para la FR48, los mayores valores fueron para la raza Cónico (573 g_f) y Celaya (564 g_f), mientras que la raza Arrocillo blanco (262 g_f) y Naltel de altura (305 g_f), tuvieron los menores valores. La FR24 tuvo correlación con la FR48 (r = 0.52**), y la FR48 se correlacionó con la IF (r = 0.50**) y la HT (r = -0.42**).

Hongos en las tortillas de maíz de las 14 razas

Los resultados indican que las razas Celaya y Coscomatepec comparten las mismas especies de hongos (A. flavus y Acremonium sp.), mientras que el resto de razas tuvieron diferentes combinaciones de dos o más hongos. En tanto que la raza Pepitilla solo tuvo el género Acremonium sp. (Tabla 3). El hongo A. flavus se encontró en la mayoría de las razas, excepto en Arrocillo amarillo, Naltel de altura, Ancho y Pepitilla. A pesar de que Penicillium sp. tiene una enorme capacidad para adaptarse, solo se presentó en las razas Arrocillo blanco y Chalqueño. La especie Mucor circinelloides, estuvo presente en las razas Arrocillo amarillo, Tablilla de ocho, Cónico, Cacahuacintle, Elotes cónicos y Bolita. Mientras que Mucor sp., solo se observó en la raza Chalqueño. El género Chrysonilia sp., se encontró en las razas Arrocillo amarillo, Ancho, Tuxpeño y Elotes cónicos. En tanto que Rhizopus oryzae y Alternaría sp., solo estuvieron presente en las razas Cónico y Chalqueño; mientras que Paecilomyces lilacinum, sólo se encontró en la raza Cacahuacintle.

Peso del complejo de hongos (PCH)

Los valores menores y mayores del PCH coinciden con los valores reportados por ^{Aragón et al. (2016)}, pero las diferencias de valores encontrados se pueden deber a la diversidad genética de las razas de maíz evaluadas en el presente estudio. Hasta este momento, el promedio del PCH por tortilla, no se ha reportado para ninguna de las 65 razas identificadas en México. Además, se tienen pocos estudios que identifiquen las especies o géneros que se producen en el peso del complejo de hongos por razas, en el estado de Puebla solo se tiene el reporte de ^{Serratos et al. (2017)} quienes evaluaron el complejo de hongos en tortillas, sin identificar las razas de maíz de donde se obtuvo tal complejo, ni los hongos pertenecientes a cada una de las razas.

Características de calidad

El índice de flotación (IF) es una medida indirecta de la dureza del grano, sirve para determinar el tiempo de cocción del nixtamal, por lo que a los granos más duros se les deja mayor tiempo de cocción, mientras que los más suaves menor tiempo, para estandarizar el proceso de nixtamalización (^{SE 2002}). La de dureza de los granos de las diferentes razas es similar a los encontrados por ^{Vázquez et al. (2010)} en las mismas razas de maíz proveniente de los estados de México e Hidalgo.

De acuerdo con ^{Salinas et al. (2003)} y ^{Vázquez-Carrillo et al. (2014)} existe una relación estrecha entre los dos tipos de polisacáridos (amilosa y amilopectina) con los que cuenta la tortilla y el IF, ya que en granos contrastantes de IF disminuyen o aumentan los porcentajes de amilosa y amilopectina. La amilosa es una molécula que posee pocas ramificaciones con tendencia a retrogradar por lo que es considerada la principal causa de deterioro a corto plazo, que se ve reflejado en cambios de textura durante el almacenamiento, mientras que la amilopectina cuenta con demasiadas ramificaciones (^{Vázquez-Carrillo et al. 2014}).

La HN se correlacionó con el IF lo que coincide con ^{Vázquez et al. (2003)} y con ^{Guzmán-Maldonado et al. (2015)}, pero se difiere con ^{Vázquez et al. (2010)}, quienes reportan para las razas Pepitilla y Chalqueño valores ligeramente superiores a las de este estudio. La diferencia se puede deber a que las colectas se realizaron en diferentes estados, con distinto tipo de clima, así como, un contraste entre las altitudes de las recolectas de tales razas. De acuerdo con los resultados de ^{Vázquez et al. (1990)}, la HN y HM tuvieron valores similares en la raza Pepitilla; al respecto ^{Antuna et al. (2008)} y ^{Vázquez et al. (2010)}, reportan promedios mayores en la misma raza, estas diferencias pueden deberse a las condiciones climáticas, edáficas y del genotipo colectado respecto a las del presente estudio. Para las variables HT24 y HT48 los valores encontrados se encuentran dentro de los valores reportados por ^{Vázquez et al. (2010)} y ^{Guzmán-Maldonado et al. (2015)} para tortillas elaboradas de la raza Tuxpeño.

Las diferencias estadísticas de rompimiento (FR24 y FR48) de tensión al corte de las tortillas coinciden con los reportado por ^{Vázquez et al. (2010)}. Al respecto se entiende que una tortilla con mayor pericarpio retenido, menor HN y HT24, tiene mayor valor de FR24, ya que la tortilla es más rígida porque sus células se compactan y se endurecen, lo cual sucedió con la raza Chalqueño y Cónico; mientras que la raza Cacahucintle tuvo el valor más bajo de FR24, lo que puede deberse a que fue uno de los granos más suaves (IF = 100), lo cual hizo que las tortillas tuvieran poca resistencia como lo indica ^{Gaytán-Martínez et al. (2013)}. Valores contrarios fueron reportados por ^{Vázquez et al. (2010)} en las mismas razas de este estudio, lo cual se puede deber a las condiciones climáticas donde los autores colectaron (templado subhúmedo y semifrío subhúmedo con lluvias en verano), ya que se realizó en el estado de Hidalgo, mientras que el presente estudio en Puebla. La FR48 se correlacionó de forma negativa con la HT24, por lo que tortillas con reducida humedad a las 24 horas tienden a ser más rígidas como lo indica ^{Vázquez-Carrillo et al. (2014)}.

Hongos encontrados en las tortillas de maíz de las 14 razas

En el género Acremonium la mayoría de especies son saprofitas, es decir, son los que se encargan de descomponer la materia orgánica y las colonias son de aspecto aterciopelado o polvoso cuando son cultivos viejos, de color gris, rosado, anaranjado o blanco (^{López et al. 2012}, ^{Bonifaz 2015}); este hongo estuvo presente en las razas Ancho, Cónico, Chalqueño, Elotes cónicos, Celaya, Coscomatepec y Pepitilla (fue el único hongo presente para esta raza). El hongo A. flavus es traslúcido y de crecimiento rápido, se ha encontrado en frutos secos, cereales, semillas como el maíz, legumbres, así como en quesos y carnes ahumadas; las colonias son filamentosas de color verde olivo o verde amarillento (^{Bonifaz 2015}, ^{Castillo et al. 2018}); el hongo no estuvo presente en las razas: Arrocillo amarillo, Naltel de atura, Ancho y Pepitilla. En la raza Natel de altura se encontró A. fumigatus, que es un hongo filamentoso hialino, saprófito, sus colonias son de aspecto polvoso de color turquesa o verde obscuro (^{Castillo et al. 2018}). Mientras que A. terreus solo se encontró en la raza Ancho, se encuentra en el suelo de todo el mundo, también en alimentos deteriorados produciendo toxinas, mientras que las colonias presentan un aspecto aterciopelado de color marrón (^{Nadumane et al. 2016}, ^{Posch et al. 2018}).

Penicillium sp., tiene una distribución cosmopolita, se han aislado comúnmente en el suelo, plantas, textiles, polvo de casas, frutos, aire, entre otros. Se caracteriza por su color verde y blanco, así mismo, su aspecto es plano o polvoso, pero también aterciopelado (^{Bonifaz 2015}, ^{Castillo-Hernández et al. 2015}). Penicillium sp. solo se presentó en las razas Arrocillo blanco y Chalqueño. El hongo Mucor circinelloides pertenece al orden de los mucorales, que se encuentran frecuentemente en el ambiente, suelo y sustratos orgánicos en descomposición; los hongos son de color blanco y se torna a color grisáceo, aspecto algodonosa o vellosa, sin pigmento (^{López et al. 2012}, ^{Arenas y Torres 2019}). Este hongo estuvo presente en las razas Arrocillo amarillo, Tablilla de ocho, Cónico, Cacahuacintle, Elotes cónicos y Bolita. Mientras que en las razas Arrocillo amarillo, Ancho, Tuxpeño y Elotes cónicos, se encontró el género Chrysonilia sp., llamado moho rojo, que se ha aislado del pan y polvo, además de contar con una amplia distribución en el ambiente; las colonias son de aspecto velloso o polvosas, presentando colores amarillo, rojo o anaranjado (^{López et al. 2012}, ^{Bonifaz 2015}).

El hongo Rhizopus oryzae se encontró en las razas Cónico, Chalquecho y Bolita, el cual se considera un hongo fitopatógeno que presenta colonias blancas al inicio, posteriormente se torna a gris, tiene abundante micelio aéreo y esporangios negro, el hongo se ha reportado que ocasiona la pudrición de frutas y hortalizas en climas tropicales y semitropicales (^{López et al. 2012}, ^{Cruz-Lachica et al. 2017}). Mientras Alternaria sp. es un hongo dematiáceo cosmopolita, el cual, es un fitopatógeno, la enfermedad obtenida por este hongo es conocida como “tizón”; daña hojas, tallos, tubérculos, frutos y semillas en plantas de interés agrícola, las colonias son de crecimiento rápido de color cafés, grises o negras que presentan una textura lanosa (^{Bonifaz 2015}, ^{Rodríguez-Guzmán et al. 2019}), el hongo se encontró solo en las razas Cónico y Chalqueño. El hongo P. lilacinum se ha aislado de la materia orgánica o suelos agrícolas, principalmente en zonas tropicales y subtropicales, es considerado agente de control biológico contra nemátodos (fitoparásitos) e incluso se ha aislado en insectos como chinches y mosquita blanca; presentan colonias aterciopeladas de color violeta claro y de rápido crecimiento (^{López et al. 2012}, ^{Senthilkumar et al. 2020}), este hongo solo estuvo presente en la raza Cacahuacintle.

En la Tabla 3 se presenta la diversidad de hongos que conforman el complejo de la tortilla, de las 14 razas de maíz. En comparación con el trabajo de ^{Aragón et al. (2016)}, se superó el doble del número de hongos encontrados en las tortillas, coincidiendo en los géneros y/o especies siguientes: Penicillium purpurogenum, A. flavus, Monilia sp., o Chrysonilia sp., Mucor sp., y Rhizopus sp.; siendo los géneros y/o especies nuevos los siguientes: Acremonium sp., A. fumigatus, Alternaria sp., A. terreus y P. lilacinum. La duplicación de hongos encontrados en el complejo de hongos puede deberse a la diversidad de razas de maíz colectara en todo el estado de Puebla. Estos dos últimos hongos, estuvieron presentes en una sola raza de tortilla, por lo que se puede inferir, con base en los resultados que la raza utilizada por ^{Aragón et al. (2016)}, en mayor o menor medida fue Chalqueño, esto tuvo influencia por su cercanía que existe entre el municipio de San Pedro Cholula (de donde pertenece esta raza) y la ciudad de Puebla.