Introducción

Listeria monocytogenes es el patógeno responsable de la listeriosis, enfermedad que afecta al hombre, y considerada un problema de salud pública debido a la severidad de los padecimientos y la alta tasa de mortalidad (20-30 %) que genera en la población vulnerable (^{Zunabovic et al., 2011}). Meningitis, septicemia y aborto son formas clínicas invasivas de la listeriosis, y la gastroenteritis no invasiva, ambos tipos difieren en términos de sintomatología, población, dosis infecciosa y tiempo de incubación (^{Posfay-Barbe & Wald, 2009}; ^{Camejo et al., 2011}). La principal vía de infección del patógeno es por consumo de productos lácteos con o sin pasteurización, embutidos, y hortalizas contaminados, lo que da lugar a brotes de listeriosis (^{CDC, 2017}; ^{Raheem, 2016}).

Dada la importancia clínica y epidemiológica de L. monocytogenes, se han implementado diversos métodos para su detección y tipificación con la intención de definir con precisión las cepas involucradas en brotes (^{CDC, 2017}), y localizar los puntos de contaminación en la cadena alimentaria. El Centro de Prevención y Control de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos de América, basado en la detección y tipificación de L. monocytogenes, permite reportar anualmente los casos de listeriosis (≈1500) asociados al consumo de alimentos con una tasa de mortalidad de 17 % (^{Scallan et al., 2011}). En general, los países en desarrollo no consideran obligatorio el reporte de listeriosis, hecho que probablemente repercute en la baja incidencia del padecimiento (^{Tod & Notermans, 2011}).

Existen numerosos estudios que refieren la presencia de L. monocytogenes en los alimentos, y señalan el riesgo que estos representan en la listeriosis de origen alimentario (^{Adzitey & Huda, 2010}). La supervivencia, transmisión y patogénesis de L. monocytogenes está condicionada por la capacidad de adaptación de la bacteria (^{Zunabovic et al., 2011}; ^{Roberts & Wiedmann, 2003}), la naturaleza del alimento (^{Midelet-Bourdin et al., 2006}), y la diversidad entre los serotipos de la especie (^{Jaradat & Bhunia, 2003}). Se asume que los 13 serotipos de L. monocytogenes son potencialmente virulentos debido a que poseen un locus cromosomal de virulencia (prfA, plcA, plcB, hlyA, mpl, acta) denominado isla de patogenicidad-1, y genes de invasión (Internalinas) necesarios para establecer el ciclo infectivo basado en adherencia, invasión, sobrevivencia y multiplicación dentro de células fagocíticas y no-fagocíticas del hospedero (^{Camejo et al., 2011}; ^{Vázquez-Boland et al., 2001}). Sin embargo, los serotipos 1/2a, 1/2b, y 4b se han identificado en la mayoría de los casos de listeriosis (^{Orsi et al., 2011}), por lo que es importante evaluar si las cepas de origen alimentario independientemente del serotipo presentan ciertas propiedades de virulencia.

Aunque, en México se ha reportado la presencia de L. monocytogenes en diversos alimentos (^{Castañeda-Ruelas et al., 2013}; ^{Silva et al., 2007}; ^{Vázquez-Salinas et al., 2001}; ^{Saltijeral et al., 1999}), son pocos los casos clínicos descritos, lo anterior probablemente por el hecho de que la listeriosis no es una enfermedad de declaración obligatoria (^{Castañeda-Ruelas et al., 2014}). En 2016, la Dirección General de Epidemiología de México reportó 4,476,041 casos de infecciones intestinales, 25,896 casos de intoxicación alimentaria bacteriana y 628 casos de meningitis, pero, la etiología de ambos cuadros clínicos no fue definida (^{DGE, 2018}). No obstante, que entre 1967-2006, se reportaron algunos casos de listeriosis, los cuales a pesar del tratamiento con antibióticos tuvieron una tasa de mortalidad del 50 % (^{Espinoza-Gómez et al., 2006}; ^{Castrejón-Alba et al., 1997}; ^{Kraus et al., 1994}), en ninguno de ellos se realizó la búsqueda de la fuente y la cepa de L. monocytogenes responsable de la infección.

Una posible explicación del porqué en México no se conoce la relación entre la listeriosis y su agente causal, posiblemente se debe a fallas para establecer el diagnóstico clínico y por ende el etiológico. Por otro lado, aunque, se ha trabajado sobre la presencia de L. monocytogenes en diferentes alimentos, la información sobre las cepas aisladas se ha limitado a su identificación bioquímica por lo que no se sabe si presentan características que permitan establecer el ciclo infectivo en el hospedero. El propósito del presente estudio consistió en analizar algunas propiedades de virulencia de cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos y casos clínicos, para definir la importancia de los alimentos en la transmisión de cepas virulentas a los humanos.

Materiales y Métodos

Resultados y Discusión

Las 30 cepas de L. monocytogenes analizadas se adhirieron a las células HT-29, HEp-2 y Caco-2 con un patrón de adherencia difuso y/o agregativo (Figura 1), lo que sugiere la capacidad para colonizar e iniciar su ciclo de invasión en el hospedero. No se observó un patrón de adherencia diferencial de acuerdo con el perfil de PFGE, origen (clínicas y alimentarias) y/o serotipo entre las cepas. Sin embargo, mostraron diferentes niveles de adherencia, daño o destrucción celular de la monocapa y la formación de las prolongaciones célula-célula (Figura 1).

Figura 1 Micrografía del patrón de adherencia difusa de cepas de L. monocytogenes en células HEp-2, HT-29 y Caco-2. (A) control de células Caco-2, (B) control de células de HT-29, (C) control de HEp-2, (D) serotipo 4b en células Caco-2, (E) serotipo 1/2c en células HT-29, (F) serotipo 1/2b en células HEp-2, (G) cepa clínica en células Caco-2, (H) serotipo 3b en células HT-29, (I) serotipo 1/2a en células HEp-2. Aumento 100x. 

La capacidad de L. monocytogenes para invadir las células HT-29 y HEp-2 varió de 0.422-0.865 y de 0.307-0.858, respectivamente, observándose diferencias estadísticas entre cepas (p=0.000), líneas celulares (p=0.001), serotipo (p=0.018) y perfil electroforético (p=0.001), pero no respecto al origen (p=0.658). Es decir, el índice de invasión de las cepas de L. monocytogenes se observa como una propiedad no estable. El perfil de invasión global expresado por las cepas de origen alimentario (n=23) se determinó con respecto a la cepa control de L. monocytogenes ATCC 4976 previamente reportada con potencial patogénico (^{Jaradat & Bhunia, 2003}); la mayoría (87 %) de las cepas corresponde a un índice de invasión similar a la cepa control y las cepas de origen clínico. No obstante, una cepa correspondiente al serotipo 1/2a (cepa 10) presentó un fenotipo de invasión superior a la cepa de L. monocytogenes ATCC 4976. Mientras que, aislados de los serotipos 4b (cepa 116) y 1/2c (cepa 101) mostraron un fenotipo menor (Figura 2).

Figura 2 Fenotipo de invasión de cepas de Listeria monocytogenes aisladas de alimentos y casos clínicos en México. ^aEl fenotipo de invasión promedio se determinó respecto a la cepa control L. monocytogenes ATCC4976 en las células HEp2 y HT-29; fenotipo alto (negro), fenotipo similar (gris), y fenotipo bajo (blanco). La media de los fenotipos de invasión entre las cepas es estadísticamente diferente en las células HEp-2 y HT-29 (p<0.05). N.D: No determinado. 

El estudio comparativo del fenotipo de adherencia e invasión de cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos y casos clínicos, es la primera descripción al respecto que se hace en México. En la literatura se refiere que la mayoría de los casos de listeriosis son vinculados con los serotipos 1/2a, 1/2b y 4b, y que su transmisión es a través de los alimentos (^{Orsi et al., 2011}). Nuestro estudio muestra que la mayoría de las cepas de origen alimentario pertenecen a dichos serotipos con potencial y capacidad patogénica in vitro en líneas celulares.

Para iniciar el evento de invasión a las células del hospedero y garantizar la progresión del ciclo intracelular de L. monocytogenes, la adherencia es un proceso primordial (^{Camejo et al., 2011}; ^{Vázquez-Boland et al., 2001}). Algunos estudios han cuantificado la capacidad de adherencia de L. monocytogenes, encontrando diferencias del grado de expresión de acuerdo al serotipo (^{Jaradat & Bhunia, 2003}). Sin embargo, la información sobre la descripción de la topología de la célula hospedera infectada por L. monocytogenes es escasa. En este estudio se identificó que las cepas de L. monocytogenes presentan un patrón de adherencia difusa similar al descrito en E. coli (^{Nataro & Kaper, 1998}), el cual no mostró relación con el serotipo y el origen de las bacterias ni con las células epiteliales ensayadas.

En el modelo de células epiteliales polarizadas se ha observado que la invasión del patógeno se realiza mediante una adherencia basolateral, lo cual es resultado de la interacción entre las proteínas de superficie bacteriana (Internalinas) y la proteína E-cadherina que rodea las uniones de la célula hospedera (^{Pentecost et al., 2006}). En este sentido, el fenotipo difuso de las cepas evaluadas se relaciona con esta descripción, y con la influencia de la bacteria sobre la tipología de la célula hospedera infectada al mostrar daño celular y las prolongaciones célula-célula. L. monocytogenes puede ocasionar daño celular por efecto de la invasión o por la potencial capacidad de producir toxinas, ambas propiedades patogénicas características de la bacteria (^{Camejo et al., 2011}; ^{Pentecost et al., 2006}; ^{Vázquez-Boland et al., 2001}). ^{Scalestky et al. (2002)} describieron la presencia de diferentes fenotipos de adherencia y su relación con las manifestaciones clínicas inducida por E. coli que es un microorganismo altamente diversificado, hecho que contrasta con lo observado con L. monocytogenes que no presenta fenotipos de adherencia diferenciales.

Previamente en México, ^{Vázquez-Salinas et al. (2001)} identificó cepas aisladas de alimentos con serotipo 4 y 1/2 que en un modelo murino se identificaron como bacterias no virulentas y virulentas, respectivamente. En contraste, en el presente estudio al evaluar el grado de invasión de las cepas de origen alimentario se observaron diferencias al hacer el análisis entre cepas/serotipos/PFGE, lo que permite concluir que la virulencia de L. monocytogenes es una propiedad individual que varía entre las diferentes cepas. En este sentido, algunos estudios han descrito la no relación del grado de invasión con la expresión de adherencia o hemólisis de cepas y/o serotipos de L. monocytogenes (^{Jaradat & Buhnia, 2003}). ^{Rychli et al. (2014)} señalan que genomas de diferentes cepas de L. monocytogenes mantienen un grupo similar de genes de virulencia funcional (isla de patogenicidad-1) permitiendo el ciclo infectivo, pero, con genes de virulencia distintivos de cada cepa que reflejan la magnitud de su virulencia. Adicionalmente, se observó mayor afinidad de L. monocytogenes por las células HT29, esto podría atribuirse al origen intestinal de las células y la capacidad del patógeno para causar enfermedades gastrointestinales (^{Posfay-Barbe & Wald, 2009}).

De acuerdo con otros estudios, nuestros resultados confirmaron que L. monocytogenes independiente de su procedencia son patógenos con diferente grado de virulencia, y que esta puede estar condicionada por el serotipo o su perfil genético (^{Indrawattana et al., 2011}; ^{Larsen et al., 2002}). La información al respecto refiere que algunas cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos pueden tener un potencial humano-patógeno limitado (^{Roberts et al., 2005}), y que en ciertos casos depende de la matriz y temperatura de almacenamiento del alimento (^{Midelet-Bourdin et al., 2006}), o se relaciona con factores moleculares adicionales que contribuyen al ciclo patogénico (^{Roberts & Wiedmann, 2003}). Aunque, con algunas diferencias por la capacidad invasiva observada en las cepas origen alimentario y las clínicas se puede proponer la participación de los alimentos como fuente de transmisión de clones de L. monocytogenes potencialmente patogénicos y responsables de la Listeriosis en México.

Conclusiones

En México L. monocytogenes no es un patógeno de diagnóstico obligatorio en los casos clínicos sospechosos. Sin embargo, hay informes de casos esporádicos y estudios que sustentan la prevalencia del patógeno en los alimentos. Nuestros resultados mostraron que la mayoría de los serotipos de L. monocytogenes aislados de alimentos tienen la capacidad de adherirse e invadir las células hospederas similar al comportamiento de las cepas clínicas, y que los alimentos representan una vía principal de transmisión. Ante esto surge la necesidad de implementar medidas para realizar un control más estricto en los alimentos, mediante la búsqueda intencional de L. monocytogenes como patógeno de transmisión alimentaria en México. Por otro lado es importante plantear a los médicos que en los casos clínicos de abortos o problemas neurológicos en los que no se establezca el diagnóstico, es conveniente considerar la posible participación de la bacteria. Los estudios moleculares de la bacteria se muestran como una posibilidad promisoria, para desarrollar sistemas para su identificación rápida y para conocer más sobre la genómica del microorganismo.