Introducción

Las poliaminas (PAs) Putrescina (Pu), Espermidina (Spd) y Espermina (Spm) son moléculas ubicuas esenciales para el crecimiento y supervivencia de los organismos (^{Kusano et al., 2008}); así como para la replicación, la transcripción, la traducción, modulación de los canales iónicos y de unión a receptores, y para estabilización de muchas glicoproteínas (^{Brooks, 2013}). Las PAs se conservan de bacterias a animales y plantas, con algunas variaciones en sus vías biosintéticas (^{Tabor & Tabor 1984}). La síntesis esencialmente parte de los precursores L-arginina y L-metionina (^{Smirnova et al., 2018}). Aunque se conocen los genes que codifican para las enzimas participantes en las vías metabólicas de las PAs y su metabolón (^{Panicot et al., 2002}), pero la dinámica de su expresión durante los cambios ambientales aún no se ha investigado. Sin embargo, es evidente la importancia de la participación de las PAs en la respuesta al estrés, dado el creciente número de trabajos que muestran cambios en los niveles de PAs asociados a diversas formas de estrés (^{Smirnova et al., 2018}; ^{Satish et al., 2018}; ^{Majumdar et al., 2017}; ^{Valdés-Santiago & Ruiz-Herrera, 2014}). La concentración intracelular total de PAs está en el rango de varios cientos de micromoles a unos pocos milimoles y está estrechamente regulado, ya que los niveles más altos de PAs son tóxicos para las células y conducen a la muerte celular (^{Dong-Hu, et al., 2018}). Los niveles de PAs se regulan en varias etapas incluyendo la síntesis de novo, degradación y transporte; también las enzimas limitantes de su metabolismo suelen sufrir distintos efectos por los estímulos a que son sometidas (^{Ou et al., 2016}), lo que las hace apropiadas respecto a otros marcadores moleculares menos económicos utilizados en P. capitata (^{Delgadillo-Nuño et al., 2014}; ^{Liñán-Cabello et al., 2010a}; ^{Liñán-Cabello et al., 2010b}). En los tejidos vegetales la acumulación de Especies Oxigeno Reactivas (ROS) y PAs durante las tensiones abióticas y bióticas se consideran restauradores del daño inducido por el estrés, y elementos activos de cascadas de señalización de dicho fenómeno, más que ser consecuencias colaterales de los cambios metabólicos (^{Shabala & Pottosin, 2014}), por lo que sus niveles podrían asociarse con el estado fisiológico de los organismos, dependiendo de las condiciones ambientales en las que se encuentren.

Dado que la profundidad y por tanto la irradiación afectan la productividad en los corales (^{Lesser et al., 2000}) se requieren estudios con marcadores moleculares que se asocien con la sobrevivencia de estos organismos en cambios ambientales (^{Buckley & Szmant, 2004}). Entre otras características físicoquímicas y ópticas, la incidencia de la luz se ve alterada, incluso en la Radiación Fotosintética Activa (PAR, 400-700 nm) en lugares donde la marea baje más allá del promedio normal (^{Banaszak & Lesser, 2009}), como es en Playa Mora, uno de los sitios muestreados en este estudio. Además el campo de luz submarina se modifica por el ángulo de la luz incidente, la absorción y dispersión de la luz por los materiales disueltos, así como por las partículas en el agua. También se sabe que el ambiente luminoso es un componente importante de la productividad, fisiología y ecología de los corales (^{Lesser et al., 2000}). En las zooxantelas simbiontes que se encuentran en los corales existen aminoácidos tipo Microsporina (MAA) que funcionan absorbiendo la radiación UV de entre 330 y 360 nm, en los cuales se ha descrito una probable función similar a la de PAs, y que provoca la pérdida de un grupo metilo cuando se analizan con trampa de iones y las condiciones estándares de la misma (^{Whitehead & Hedges, 2003}). El presente estudio pretende determinar los niveles de Pu, Spd y Spm en tres áreas de la costa del PacÍfico Central Mexicano (PCM) con desarrollo coralino de P. capitata, sujetas a variaciones extremas en el nivel de marea.. El objetivo es evaluar la concentración de dichas PAs en P. capitata y las posibles diferencias en los niveles de estos compuestos de corales obtenidos bajo condiciones ambientales en dos épocas del año contrastantes, febrero en la que el nivel del agua baja de forma significativa, y octubre, en la que los corales están siempre cubiertos de agua. En el caso particular de Playa Mora, el desarrollo coralino de este sitio queda al descubierto durante febrero, por lo que los efectos medioambientales podrían ser más evidentes, comparado con los dos sistemas del género Pocillopora en Bahia Chamela, ubicados en sitios siempre cubiertos por el agua.

Materiales y Métodos

Para evaluar el estado de salud de las poblaciones del coral P. capitata en el PCM, utilizando las PAs como marcadores moleculares se tomó muestra del coral ramoso en dos condiciones ambientales extremas; invierno, cuando el nivel de la marea se presenta la bajamar máxima del año, y a finales de verano y principios de otoño, cuando el nivel de marea es la más alta del año o pleamar máxima. Además, se consideraron diversos atributos en la elección de las colonias de coral a toma de muestra, entre ellos fueron en orden de importancia que la colonia presentara un tono verde-café, indicador visual de buena salud, libre de epibiontes y algún daño aparente detectado visualmente. Con base a lo anterior, se realizó la colecta de ocho fragmentos de entre 5 y 10 cm de longitud de rama en colonias seleccionadas al azar a una profundidad de 1.8 a 3.5 m en Piedra Bola (19°34´31.6” N, 105°07´59.4” O), Palmito (19°33´0.4” N 105°06´20.7”) y Playa Mora (19°16´49” N. 104°52´20”) en febrero y octubre de 2014, con la ayuda de buceo SCUBA, guantes de goma, martillo, cincel y bolsa obscura de plástico con cierre tipo ziploc. La muestra fue conservada a 4 °C hasta su traslado al laboratorio de Biotecnología del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias y colocadas a -20 °C para su posterior análisis.

La identidad del coral P. capitata fue realizado bajo los criterios anatómicos y estructurales del exoesqueleto de cada fragmento con el apoyo de las claves taxonómicas ^{Hodgson (1995)} y ^{Reyes-Bonilla et al (2005)}.

Bahía Chamela

Cuenta con una extensión de 2,364 km², geológicamente está la placa de cocos, fosa de subducción y plataforma estrecha, con acantilados, islas, y escolleras. En la bahía de chamela se seleccionaron dos sitios (Figura 1), para realizar los muestreos de fragmentos del coral P. capitata: Piedra Bola, con dos grandes borras coralinas separadas entre sí por una barra arenosa; y Palmito con crecimientos coralinos aislados de Poritas sp.

Figura 1 Localización de arrecifes de coral de Pocillopora capitata en el Pacífico Central Mexicano. 

Análisis de Laboratorio

Resultados y Discusión

No existen reportes que determinen los niveles de PAs en corales actualmente. Los tiempos de retención para las tres PAs analizadas se presentaron en 3.64 min para Pu; 5.88 min para Spd y 9.51 min para Spm. Para el límite inferior de detección se determinó en 35 pg/mL para Pu; 62 pg/mL de Spd y 45 pg/mL de Spm. Para la estimación de límite superior se probó hasta una concentración de 80 µg/mL.

Aunque dichas moléculas son consideradas bioindicadores de estrés en plantas y es uno de los principales marcadores moleculares en este reino (^{Majumdar et al., 2017}); la participación de las PAs y sus cambios en respuesta al estrés (^{Smirnova et al., 2018}; ^{Satish et al., 2018}; ^{Majumdar et al., 2017}; ^{Valdés-Santiago & Ruiz-Herrera, 2014}), hace sugerirlas como alternativa a otros indicadores utilizados en los corales. Sin embargo es necesario realizar más estudios que permitan establecerlas como verdaderos indicadores asociados al estrés en dichos organismos.

La presencia de las PAs Pu, Spd y Spm en tejido coralino de P. capitata varían significativamente entre sitios (Palmito, Piedra Bola y Playa Mora) y épocas de muestreo (febrero y octubre). De igual manera, la concentración de PAs fue consistentemente mayor en octubre. Si se compara entre sí la presencia de las PAs, (Figuras 1-3) se aprecia que la concentración promedio de Pu fue de 10.03 µg/cm², 1.24 µg/cm² de Spd y 4.06 µg/ cm² para Spm, con un valor mínimo de 1.35 ± 0.16 µg/cm² en Pu, 0.15±0.03 µg/cm en Spd y 0.07 ± 0.02 µg/cm² en Spm; y concentraciones máximas de 42.91 ± 1.40 µg/cm² en Pu, 5.31±1.06 µg/cm² Spd y 12.10 ± 0.75 µg/cm² en Spm. Es importante establecer la relación en los contenidos de PAs en el coral P. capitata respecto a los estudios que reportan los niveles de las mismas en distintos tejidos y/o fluidos de animales, por ejemplo el grupo de ^{Khuhawar & Qureshi (2001)} utiliza la concentración en µg/mg de creatinina en orina; y la revisión de ^{Teti et al. (2002)} muestra valores que van del rango nmolar/ mL de muestra no solo para orina, sino también para plasma, pmolar/µL en eritrocitos, orina y células de linfoma, así como µg/mL en suero y ng/µL en orina concentrada. De esta manera se puede llegar a mejores estimaciones por célula, tanto de coral como del simbionte o zooxantela.

Figura. 2 Concentración de Putrescina (μg/cm²) en tejidos de P. capitata durante febrero y octubre en los tres sitios de muestreo. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05). 

Figura 3 Concentración de Espermina (μg/cm²) en tejidos de P. capitata durante febrero y octubre en los tres sitios de muestreo. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05). 

Por sitio de muestreo, se observa que en Palmito, la Pu presentó una concentración en varios órdenes de magnitud mayor entre las PAs registradas por sitio y mes. En contraste, Playa Mora y Piedra Bola, en octubre, presentaron la mayor concentración de Spm, mientras que Playa mora mostró la mayor concentración de Spd. Si comparamos el nivel de la marea por mes de muestreo (Figura 5), el cual es uno de los factores oceanográficos que más llaman la atención. La altura de la columna de agua es significativamente menor en febrero (-0.31 ± 0.02 m respecto al promedio anual de altura de la marea) respecto al mes de marzo (0.05 ± 0.01 m).

La comparación de la concentración de PAs entre sitios y época de muestreo se aprecia de forma gráfica en las Figuras 2, 3 y 4.

Figure 4 Promedios de las concentraciones de Espermina (μg/cm²) en tejidos del coral P. capitata obtenidos en los sitios y meses de muestreo. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05). 

Figura 5 Promedio de los niveles de mareas, durante 5 años. Los asteriscos presentan las diferencias estadísticamente significativas mediante la prueba de ANOVA y comparación múltiple, p<0.001. 

En la Figura 2 se observa la concentración de Pu, esta poliamina presentó diferencia significativa por sitio de muestreo, más no en la temporada de muestreo (Pmes = 0.0102; Psitio = 0.375), registrándose en Palmito las mayores concentraciones, con 7.29±0.25 µg/cm² en febrero y 42.91±1.40 µg/cm² en octubre.

En relación a la Spd, las concentraciones más altas se presentan en octubre (Figura 3). Se establecieron diferencias significativas por sitio de estudio, más no por mes de muestreo (Pmes= 0.0102; Psitio= 0.375). Playa Mora muestra las mayores concentraciones con 0.60 ± 0.10 µg/ cm² en febrero y 5.31 ± 1.06 µg/cm² en octubre.

La Spm (Figura 4) registró valores estadísticamente significativos por mes de muestreo (Pmes= 0.0439), en Playa Mora y Piedra Bola. Las mayores concentraciones fueron en octubre, con 12.10 ± 0.75 µg/cm² Playa Mora y 5.33±0.88 µg/cm² en Piedra Bola.

Los cambios en las mareas se registraron a partir de la estación mareográfica del puerto de Manzanillo, durante 5 años en el periodo comprendido entre 2012 y 2016 y promediando los 12 meses de cada año (Figura 5). Mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y comparación de medias de Dunn (p≤0.001) los resultados muestran diferencias estadísticas muy marcadas entre los primeros 4 meses del año, respecto a los meses de septiembre, octubre y noviembre, sobre todo en los meses de febrero y octubre cuando se llevó a cabo los muestreos del presente trabajo y en los tres sitios analizados.

Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren a las PAs, sobre todo a Spd y Spm, son marcadores que asocian a los niveles de PAs con las mareas, lo que podría indicar una homeostasis adecuada para que todas las vías metabólicas se encuentren en pleno funcionamiento, así como la replicación, transcripción y síntesis de proteínas, mientras la sobreacumulación de Pu induce apoptosis (^{Tobias et al., 1995}; ^{Teti et al., 2002}), aunque se requiere de más estudios con otros indicadores de control del estrés como, clorofilas, carotenoides, nutrientes y/o la biomasa presentes en P. capitata (^{Buckley & Szmant, 2004}). Los sistemas biológicos, en general, son complejos y poseen mecanismos que operan a diferentes niveles, ya sea molecular, celular o poblacional (^{Downs et al., 2005}). Consecuentemente se requiere una cantidad apropiada de indicadores (^{Buckley & Szmant, 2004}) para determinar el grado de estrés en el que se encuentran, lo que implica que estos sean representativos de la estructura, función y composición del sistema ecológico y que la información que aportan pueda complementarse en un análisis en conjunto (^{Adams, 2005}). Es importante tomar en cuenta que algunos marcadores químicos y celulares se manifiestan en periodos breves de tiempo o después de un impacto, y otros indican un efecto acumulativo por periodos prolongados de tiempo (^{Hughes et al., 2003}).

Dadas las múltiples funciones que se le conocen a las PAs, es difícil establecer la procedencia de las PAs Spd y Spm acumuladas en esta especie de coral de Playa Mora dado que puede ser el metabolismo propio de dichas moléculas, su exacerbación y/o probablemente alguna relación con el matabolismo de MAAs para defensa, dado tanto en condiciones artificiales (^{Whitehead & Hedges, 2003}) como naturales donde interfieren con el donador de metilos S-adenocilmetionina (SAM) (^{Brooks, 2013}). También se sabe que las PAs tienen efectos directos sobre el transporte de iones a nivel de las membranas en mamíferos (^{Li et al., 2007}; ^{Kusano et al., 2008}). Dada la nula investigación que existe en el metabolismo de estas moléculas en los corales, se requiere de estudios sobre las mismas en su fisiología para proponerlas como indicadores de estrés (^{Buckley & Szmant, 2004}) como se acepta en el caso de las plantas (^{Liu et al., 2017}).

Por otro lado y de manera importante resulta difícil asociar los niveles de PAs con algún otro parámetro en el ecosistema ya que son muchos factores los que podrían influir en el espacio donde se encuentran los corales. Si se toma como referencia la productividad primaria respecto al estrés en la zona en que se realizó el presente estudio, se encuentra que en la temporada de bajamareas, es decir en febrero, se registra la mejor productividad de la biomasa coralina, sinónimo de menor estrés y niveles de PAs sin cambios importantes o su asociación con el estado fisiológico de los organismos en simbiosis (^{Teti et al., 2002}).

Otra alternativa puede ser la asociación de los niveles de las mareas, dado que el nivel de las mareas tiene efecto sobre otros factores que impactan al sistema coralino, tales como incidencia de la radiación solar, turbulencia asociada a la columna de agua y turbidez o claridad de la misma, por mencionar algunas; y los indicadores de estrés, aún los ya establecidos para este tipo de estudios, actúan como respuesta a condiciones ambientales más exigentes (^{Sosa-Avalos et al., 2006}). De tal manera que Spd y Spm pueden representar un mecanismo de adaptación a las condiciones de menor productividad alrededor de octubre, si la consideramos como condición estresante, aumentando su concentración para favorecer las vías metabólicas de las moléculas indicadoras de estrés, como MAAs y dada la relación tan basta que tiene el aminoácido precursor de las PAs específicamente la ornitina (^{Sivashanmugam, 2017}), pero se requiere de estudios en el mismo modelo y niveles de PAs además de dichos indicadores ya establecidos.

El presente estudio realizado en condiciones naturales de corales ubicados en la región del PCM, y dado que están expuestos a diversos regímenes de luz en función de la profundidad y ubicación en el arrecife, no tiene muchos estudios precedentes. P. capitata, una de las dos especies de coral más abundantes en la zona de estudio (^{Reyes-Bonilla et al., 2013}), muestra un adecuado mecanismo fisiológico de adaptación a los cambios estacionales (^{Liñán-Cabello et al., 2010}). Además, presenta a nivel enzimático una serie de respuestas orientadas a adaptarse y mantener su capacidad reproductiva en entornos oceánicos poco profundos que comúnmente exhiben altos niveles de radiación ultravioleta, adicionalmente a la influencia de las mareas, cambios en la turbidez a corto plazo, concentración de nutrientes, temperatura y osmolaridad, que pueden actuar en combinación y causar daños irreversibles (^{Liñán-Cabello, et al., 2010}). Todas o algunas de estas condiciones se pueden modificar cuando las mareas alcanzan una diferencia de aproximadamente 35 cm como el caso de las zonas coralinas estudiadas en febrero y octubre (Figura 5). La concentración de Spm fue estadísticamente significativa por temporada de muestreo; el sitio de muestreo tuvo mayor efecto sobre las concentraciones de Pu y Spm, 42.91 y 12.1 μg/cm², respectivamente. Los resultados obtenidos muestran consistentemente una mayor concentración de PAs en octubre que en febrero, así como diferencias entre los sitios, registrando en Playa Mora los mayores niveles de Spd y Spm, mientras que en Palmito se expresó el mayor valor de Pu, probablemente por activación de la vía de retroconversión de las PAs (^{Dong-Hun et al., 2018}). Estas diferencias no solo se explican por el nivel de las mareas, ya que los sistemas estudiados están sometidos a diversos factores ambientales. Por una parte en octubre, en el que la marea es más alta, los corales pueden estar propensos a la turbulencia y presión de una mayor columna de agua, radiación solar con una menor inclinación, y mayores temperaturas ambientales y del agua de mar, así como mayor transparencia del agua, lo que favorece una menor dispersión de los rayos solares. Por otra parte, las condiciones en febrero y parte de marzo, con un nivel de marea más bajo, a tal grado que incluso en Playa Mora queda expuesta la masa coralina al aire, y que no obstante esta exposición, no recibe la presión y turbulencia de la columna de agua, y las condiciones medioambientales muestran una menor temperatura de estos meses de finales del invierno, así como una mayor turbiedad, que podría dispersar los rayos solares (^{Sosa-Avalos et al., 2006}).

Conclusiones

Existe una asociación entre los niveles de PAs en P. capitata y los niveles de mareas considerados inductores de estrés en las playas del PCM, evaluadas en el presente estudio. El presente trabajo reporta por primera vez la concentración de diversas poliaminas en tejido del coral P. capitata obtenido en desarrollos coralinos del PCM. Se sugiere el posible uso de estas moléculas como herramientas para determinar el estado de salud de organismos del ecosistema más diverso y complejo del planeta, como son los corales formadores de arrecife.