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Revista Chapingo. Serie horticultura
versão On-line ISSN 2007-4034versão impressa ISSN 1027-152X
Rev. Chapingo Ser.Hortic vol.28 no.1 Chapingo Jan./Abr. 2022 Epub 01-Ago-2022
https://doi.org/10.5154/r.rchsh.2021.06.011
Artículos científicos
Mutagénesis in vitro en anturio inducida mediante colchicina
1
http://orcid.org/0000-0003-3780-8241
1
*
http://orcid.org/0000-0001-9382-3599
1
http://orcid.org/0000-0003-4224-4348
1
http://orcid.org/0000-0002-4293-5045
1
http://orcid.org/0000-0002-3892-946X
1Colegio de Postgraduados, Posgrado en Recursos Genéticos y Productividad. Carretera México-Texcoco km 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México, C. P. 56230, MÉXICO.
Desarrollar variedades nuevas de anturio (Anthurium andreanum L.) mediante hibridación puede llevar entre 8 y 10 años; por ello, la mutagénesis inducida puede ser una estrategia alterna a la hibridación. El objetivo de este trabajo fue inducir mutaciones en anturio mediante la exposición a colchicina de explantes obtenidos de vitroplantas. Explantes de hojas, nudos y raíces provenientes de vitroplantas se expusieron a 0.1 % de colchicina durante 0, 2, 3 y 4 h. Se evaluaron la dosis letal promedio (DL50), la supervivencia, el número de plantas que generaron callo, el número de plantas que formaron brotes y el número de brotes por explante. El cariotipo de las plantas regeneradas por presunta mutación se determinó mediante la técnica squash en ápice de raíz. Las hojas presentaron la mayor sensibilidad a la colchicina. La supervivencia de los explantes de raíz tratados con colchicina fue de 100 %, y 4 % de las raíces expuestas durante 2 y 3 h formaron brotes adventicios (120 brotes). En el caso de los nudos, la DL50 se encontró a 3.98 h; 76 y 56 % de los nudos cultivados con colchicina por 2 y 3 h, respectivamente, formaron brotes adventicios (4.4 y 3.6 brotes). Las plantas regeneradas a partir de explantes expuestos a colchicina mostraron cambios morfológicos. El número cromosómico de las vitroplantas regeneradas a partir de explantes expuestos a colchicina durante 2 y 3 h fue 2n = 29, mientras que el de aquellas obtenidas a partir de los explantes que permanecieron en colchicina por 4 h fue 2n = 31. La sensibilidad a la colchicina fue una función del tipo de explante y la dosis utilizada. La colchicina causó la pérdida (monosomía) o la ganancia de cromosomas (trisomía).
Palabras clave Anthurium andreanum L.; aneuploides; citogenética; regeneración vegetal; cultivo de tejidos
Developing new varieties of anthurium (Anthurium andreanum L.) by hybridization can take 8-10 years; therefore, induced mutagenesis can be an alternative strategy to hybridization. The objective of this work was to induce mutations in anthurium by exposing explants obtained from vitroplants to colchicine. Explants of leaves, nodes and roots obtained from vitroplants were exposed to 0.1 % colchicine for 0, 2, 3 and 4 h. The mean lethal dose (LD50), survival, number of explants that generated callus, number of explants that formed shoots and the number of shoots per explant were evaluated. The karyotype of the presumed mutated regenerated plants was determined by the root apex squash technique. The leaves showed the highest sensitivity to cochicine. The survival of the root explants treated with colchicine was 100 %; 4 % of roots exposed for 2 and 3 h formed adventitious shoots (120 shoots). For nodes, the LD50 was found at 3.98 h; 76 and 56 % of the nodes cultivated for 2 and 3 h with colchicine formed adventitious shoots (4.4 and 3.6 shoots). The plants regenerated from the explants exposed to colchicine showed morphological changes. The chromosomal number of the regenerated vitroplants from the explants exposed for 2 and 3 h to colchicine was 2n = 29, while that of those obtained from the explants that remained on the colchicine for 4 h was 2n = 31. The sensitivity to colchicine was a function of the type of explant and the dose used. Colchicine caused the loss (monosomy) or gain of chromosomes (trisomy).
Keywords Anthurium andreanum L.; aneuploids; cytogenetics; plant regeneration; tissue culture
Introducción
Los anturios (Anthurium andreanum L.) son plantas nativas de Centro- y Sudamérica que pertenecen al género Anthurium, y son altamente demandadas porque producen flores muy vistosas durante todo el año y tienen una larga vida poscosecha; características que les confieren gran aceptación en los mercados nacional e internacional (Castillo-Diego, 2012). Estas plantas son las segundas flores tropicales de corte más importantes después de las orquídeas (Buldewo & Jaufeerally-Fakim, 2002).
Los Países Bajos son el primer productor mundial de anturios, al cultivar 25 mil tallos al año, seguido de Hawái (11 mil) y las Islas Mauricio (10.2 mil) (Guillot-Ortíz, 2008). En México, los anturios se cultivan en aproximadamente 20 ha, distribuidas en los estados de Veracruz, Chiapas y México (Gallaga, 2000). Anthurium andreanum y Anthurium scherzerianum son las especies más cultivadas en México y el mundo (Gantait & Mandal, 2010). A. andreanum es la especie más importante desde el punto de vista económico, ya que cuenta con el mayor número de variedades comerciales (López-Puc, Ramírez-Mosqueda, & Lee-Espinosa, 2013).
Las principales variedades de anturios utilizadas en el mundo son de origen holandés y han sido creadas por hibridación (Hernández, 2004), así como por métodos de transformación genética; sin embargo, desarrollar un nuevo cultivar por estos métodos puede requerir de 8 a 10 años (Azadi, Bagheri, Nalousi, Nazari, & Chandler, 2016; Su et al., 2019). El material genético de las principales especies comercializadas en México es importado de los Países Bajos, lo cual crea una dependencia total de germoplasma (Ramírez-Zea & Chávez-Servia, 2014). Asimismo, el desarrollo de nuevas zonas de producción en países en desarrollo requiere de nuevas variedades con capacidad de adaptarse a las nuevas condiciones de cultivo. En este sentido, los productores europeos buscan constantemente nuevos cultivares como estrategia de mercado para ser competitivos, por lo que la necesidad de nuevas variedades ha mostrado un aumento sin precedentes a nivel internacional (Gupta & Agnihotri, 2017).
La mutagénesis inducida es una técnica que se ha utilizado para mejorar características como la resistencia a enfermedades y plagas, y para la generación de variabilidad genética (Ahloowalia, Maluszynski, & Nichterlein, 2004). Esta técnica se basa en el uso de estímulos físicos o sustancias químicas (mutágenos) (González-Jiménez, 2004; Messmer et al., 2015). Los agentes mutagénicos químicos, como la colchicina, generan variaciones genéticas, como la duplicación de cromosomas (poliploidía) (Eng & Ho, 2018). La poliploidía puede generar variantes con características deseadas, como un mayor tamaño de las flores (con colores y formas más vistosos), una mayor vida poscosecha y una mayor resistencia al estrés abiótico o biótico (Roughani & Mehdi, 2018). No obstante, el uso de la colchicina puede causar cambios en el número de cromosomas (aneuploidía o euploidía) y daños genéticos en las células germinales (Firbas & Amon, 2014).
Aunque la mutagénesis inducida ha probado ser un método eficiente en la generación de variedades ornamentales en diferentes países, en México, los estudios que reportan la generación de mutaciones en ornamentales son escasos y se han dirigido a especies como el nardo (Polianthes tuberosa), el crisantemo (Dendranthema grandiflora), la nochebuena silvestre (Euphorbiache pulcherrima), el girasol (Helianthus annuus), Tigridia pavonia y Laelia autumnalis, todos ellos utilizando mutágenos físicos (Estrada-Basaldua et al. , 2011; Canul-Ku et al., 2012; Castillo-Martínez, de la Cruz-Torres, Carrillo-Castañeda, & Avendaño-Arrazate, 2015; Díaz-López, Morales-Ruíz, Olivar-Hernández, Hernández-Herrera, & Juárez-Cortes, 2017). En el caso del anturio, únicamente existen tres informes sobre mutagénesis inducida en el mundo, de los cuales sólo uno utilizó colchicina (Puchooa, 2005; Chen, Hou, Zhang, Wang, & Tian, 2011; Suraninpong & Wuthisuthimethavee, 2015). Considerando lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue inducir mutaciones en A. andreanum mediante la exposición a la colchicina de explantes obtenidos de vitroplantas.
Materiales y métodos
Regeneración de vitroplantas
Se desinfectaron hojas de anturio cultivadas en invernadero con una solución fungicida al 1 % (0.2 % de Prozycar® y 0.2 % de Promyl®) durante 30 min; posteriormente, las hojas se colocaron en una solución con 1.2 % de hipoclorito de sodio (ingrediente activo) más 45 µL de nanopartículas de plata (Agrovit®) por 30 min. Las hojas se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril, se segmentaron en pedazos de 1 cm2, y se colocaron en cajas de Petri de 90 X 15 mm con 30 mL de un medio de inducción que contenía sales de Murashige y Skoog (MS), 1 mg·L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg·L-1 de benzilaminopurina (BAP), 30 g·L-1 de sacarosa y 7 g·L-1 de agar. El pH del medio se ajustó a 5.8 y se llevó a la autoclave durante 20 min a 121 °C antes de ser vertido en las cajas de Petri. Los cultivos se incubaron en una cámara de ambiente controlado a 26 ± 2 °C en oscuridad total.
Después de tres meses, los explantes con brotes adventicios se transfirieron a diferentes medios que contenían sales MS, 1 mg·L-1 de 6-furfurilaminopurina (kinetina), 0.3 mg·L-1 de ácido naftalenacético (NAA), 0.3 mg·L-1 de ácido giberélico (AG3), 30 g·L-1 de sacarosa y 7 g·L-1 de agar. Posteriormente, los brotes regenerados se cultivaron durante cuatro semanas en un medio que contenía sales MS, 0.5 mg·L-1 de kinetina y 0.3 mg·L-1 de nitrato de plata (AgNO3) (medio de cultivo). Los racimos de brotes se dividieron y subcultivaron (cada cuatro semanas), en el mismo medio descrito anteriormente, hasta que alcanzaron entre 6 y 8 cm de longitud. Los cultivos se incubaron a 26 + 2 °C y 16 h de luz fluorescente blanca fría (µmol·m-2·s-1 de intensidad de la luz).
Exposición de los explantes a la colchicina
Los explantes de hojas, nudos y raíces (puntas) (0.5 cm2) obtenidos de vitroplantas regeneradas (de siete meses de edad) se sumergieron durante 0, 2, 3 o 4 h en una solución de colchicina al 0.1 %, previamente esterilizada por filtración (filtro de membrana Millipore® de 45 µM), según los protocolos reportados por Tian y Ma (2008) y Matos (2014). Los explantes se sacaron de la solución, se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron secar en papel absorbente estéril. Dichos explantes se colocaron en cajas de Petri con medio de inducción, donde permanecieron durante 12 semanas en oscuridad a 26 + 2 °C.
Los explantes con brotes adventicios se retiraron del medio de inducción y se transfirieron al medio de diferenciación. Los brotes regenerados se cultivaron en el medio de crecimiento descrito anteriormente. Los cultivos se incubaron a 26 + 2 °C y 16 h de luz blanca fría fluorescente (60 µmol·m-2·s-1). Doce semanas después de exponer los explantes a la colchicina, se evaluaron la supervivencia del explante, la dosis letal media (DL50), el número de explantes que generaron callo y el número de explantes que formaron brotes. Adicionalmente, a las 20 semanas se cuantificó el número de brotes formados por explante.
Dieseño experimental
Para evaluar el efecto de la colchicina, se utilizó un diseño factorial completamente aleatorio con dos factores (tiempo de exposición y tipo de explante) y 12 tratamientos. Cada tratamiento tuvo 10 repeticiones, donde una caja de Petri con cinco explantes constituyó una repetición. La comparación de medias se realizó mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) utilizando el paquete estadístico SAS versión 9.4. La DL50 se determinó mediante un modelo de regresión logística (MRL).
Cariotipo y recuento de cromosomas
Los cromosomas de las células meristemáticas de la punta de la raíz (ca. 1 cm de longitud) de las vitroplantas regeneradas a partir de los nudos y expuestas a diferentes tratamientos con colchicina se contaron mediante la técnica aplastamiento conforme a García-Velázquez (1990). Brevemente, las raíces se incubaron a temperatura ambiente con una solución de colchicina al 0.05 % durante 5 h, en completa oscuridad, fijadas en una mezcla de ácido acético y etanol absoluto (3:1), y mantenidas a 4 °C hasta el recuento. Al momento de examinarlas, las puntas de las raíces se trataron durante 10 min a 60 °C en HCl 1 N, se sumergieron en reactivo de Schiff durante 5 min y se colocaron en un portaobjetos. Aproximadamente, 1 mm de las puntas de las raíces se tiñó con orceína acética al 2 %, y después se analizó por la técnica de aplastamiento.
Las preparaciones se observaron en un microscopio óptico (modelo Primo Star, Zeiss) con objetivos de 40x y 100x, se contaron los cromosomas y se capturaron las imágenes con una cámara digital (modelo DCM130E) adaptada al microscopio. En cada tratamiento se contaron los cromosomas de al menos 10 células en metafase. Para el cariotipo, se seleccionaron las tres fotografías que mostraron la mejor resolución y se procesaron con el programa Karyo Type (Altinordu, Peruzzi, Yu, & He, 2016). Se determinaron la longitud total (brazo largo + brazo corto; LT = BL + BC), el índice centromérico (brazo corto/longitud total x 100; IC = [BC/LT] x 100), la relación de brazos (brazo largo/brazo corto; AR = BL/BC) y el tipo de cromosoma (metacéntrico, submetacéntrico o subtelocéntrico) (Levan, Fredga, & Sandberg, 1964). Asimismo, se obtuvo la longitud del genoma haploide, el grado de asimetría de Stebbins (1971) y la fórmula cariotípica.
Resultados
Regeneración de vitroplantas
El protocolo desarrollado en esta investigación permitió obtener vitroplantas de anturio. La formación de callos en los explantes foliares se presentó después de 12 semanas de cultivo en el medio de inducción. A las 17 semanas de cultivo, varias yemas comenzaron a formarse, las cuales alcanzaron entre 6 y 8 cm de longitud cuando se subcultivaron en medio de cultivo por 12 semanas. Estos brotes regeneraron raíces en el mismo medio.
Efecto de la exposición de explantes foliares a la colchicina
Los explantes foliares fueron los más afectados por la colchicina, al presentar daño y mortalidad directamente proporcionales al tiempo de exposición. Dichos explantes mostraron baja supervivencia y nula respuesta en términos de formación de callos y brotes adventicios. Todos los explantes foliares tratados con colchicina murieron después de 16 semanas.
Efecto de la exposición de los nudos a la colchicina
La sobrevivencia y el porcentaje de nudos que formaron brotes decrecieron a medida que incrementó el tiempo de exposición. Se observaron diferencias significativas en estas dos variables entre los nudos expuestos por 4 h a colchicina (46 y 46 %, respectivamente) y el tratamiento testigo (86 y 86 %, respectivamente) (Cuadro 1). La DL50 para este tipo de explante fue de 3.89 h. Los explantes que sobrevivieron a este tiempo de exposición al mutágeno regeneraron menos brotes (1.1) que los explantes de raíz. El área basal de los nudos expuestos durante 2 y 3 h engrosó considerablemente y adquirió una apariencia de roseta; después de cinco meses de cultivo, los nudos comenzaron a formar brotes aéreos. El número de brotes formados por los explantes expuestos durante 2 h al mutágeno fue significativamente más alto (4.4) que el del testigo y el de 4 h (Cuadro 1).
Cuadro 1 Interacción entre el tipo de explante de anturio (Anthurium andreanum L.) y el tiempo de exposición a la colchicina sobre la supervivencia, formación de callo y regeneración de brotes aéreos.
| Explante | Tiempo | Variables | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Supervivencia (%) | Formación de callo (%) | Explantes con brotes (%) | Número de brotes por explante | ||
| Nudo | 0 | 86.0 abz | 0.0 b | 86.0 a | 1.0 c |
| Nudo | 2 | 76.0 abc | 76.0 a | 76.0 ab | 4.47 a |
| Nudo | 3 | 56.0 bc | 56.0 a | 56.0 ab | 3.25 ab |
| Nudo | 4 | 46.0 c | 0.0b | 46.0 b | 1.68 bc |
| Raíz | 0 | 60.0 bc | 40.0 a | ND | ND |
| Raíz | 2 | 100.0 a | 68.0 a | ND | ND |
| Raíz | 3 | 100.0 a | 56.0 a | ND | ND |
| Raíz | 4 | 100.0 a | 44.0 a | ND | ND |
ND = no determinado. zMedias con la misma letra dentro de cada columna no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05).
Efecto de la exposición de los explantes de raíz a la conchicina
No se observaron diferencias significativas en la supervivencia de los explantes de raíz expuestos durante 2, 3 y 4 h, pero se observaron diferencias con respecto del tratamiento testigo (Cuadro 1). La sobrevivencia a las 12 semanas fue mayor a 60 %, de tal manera que no fue posible determinar la DL50 dentro de este periodo. Las raíces expuestas por 2, 3 y 4 h formaron callo (44 a 68 %), el cual se originó en la costilla media. Este callo era friable y de color beige, y conforme incrementó la exposición a la colchicina, el tamaño de la masa celular disminuyó. Cuando los explantes se cultivaron en el medio de diferenciación y luz, los callos comenzaron a tornarse café oscuro y murieron. Únicamente 4 % de los explantes de raíz expuestos por 2 y 3 h a la colchicina sobrevivieron después de 16 semanas y formaron brotes (120 y 100 brotes, respectivamente).
Cariotipo y conteo de cromosomas
El análisis citológico de las plantas de anturio (tipo silvestre) mostró que su número de cromosomas es 2n = 2X = 30 (Figura 1a). Asimismo, se pudo determinar que el anturio tiene 11 cromosomas submetacéntricos (sm) y cuatro metacéntricos (m) (Cuadro 2; Figura 2). La longitud individual de los cromosomas osciló entre 2.13 y 5.08 µm, lo cual resultó en una longitud total del haploide de 46.8 ± 0.2 µm, obtenida con la ecuación cariotípica 2n = 2x = 6 metacéntricos (dos satélites) + 24 submetacéntricos. El índice centromérico medio fue de 33.86 ± 2.31, lo que indica un mayor número de cromosomas submetacéntricos. Con base en la variación inter- e intracromosómica, el cariotipo se caracterizó como asimétrico tipo 3A (Stebbins, 1971), debido a que el tamaño de los cromosomas osciló entre pequeño y mediano (Cuadro 2). Se observó un par de satélites en el segundo par de cromosomas, los cuales estaban muy cerca de estos. Asimismo, se identificaron dos estructuras similares a las de los cromosomas B (Figura 1a).
Figura 1 Cromosomas en metafase de plantas de anturio (Anthurium andreanum L.) regeneradas a partir de nudos expuestos a colchicina: a) Testigo, b) 2 h, c) 3 h, d) células con tres núcleos, e) células con cuatro núcleos y f) 4 h. Flechas verdes: cromosomas con satélites. Flechas negras: estructuras similares a los cromosomas B.
Cuadro 2 Parámetros cariotípicos del genoma haploide de anturio (Anthurium andreanum L.).
| CHap | LT (µm) | IC (%) | AR (µm) | Tipo |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 5.08 ± 0.4 | 43.04 ± 5.5 | 1.32 ± 0.3 | m |
| 2 | 3.99 ± 0.4 | 38.82 ± 3.7 | 1.58 ± 0.2 | m |
| 3 | 3.74 ± 0.4 | 29.72 ± 7.7 | 2.36 ± 0.7 | m |
| 4 | 3.48 ± 0.2 | 31.21 ± 3.4 | 2.20 ± 0.3 | m |
| 5 | 3.35 ± 0.1 | 25.95 ± 2.8 | 2.85 ± 0.4 | sm |
| 6 | 3.28 ± 0.1 | 30.76 ± 4.0 | 2.25 ± 0.4 | sm |
| 7 | 3.12 ± 0.3 | 30.41 ± 3.0 | 2.29 ± 0.3 | sm |
| 8 | 3.01 ± 0.2 | 29.38 ± 6.7 | 2.40 ± 0.7 | sm |
| 9 | 2.84 ± 0.2 | 31.48 ± 2.3 | 2.18 ± 0.2 | sm |
| 10 | 2.77 ± 0.1 | 34.36 ± 6.9 | 1.91 ± 0.5 | sm |
| 11 | 2.62 ± 0.1 | 31.19 ± 4.7 | 2.21 ± 0.5 | sm |
| 12 | 2.57 ± 0.1 | 34.81 ± 5.1 | 1.87 ± 0.4 | sm |
| 13 | 2.44 ± 0.1 | 33.63 ± 3.1 | 1.97 ± 0.2 | sm |
| 14 | 2.39 ± 0.2 | 39.73 ± 6.0 | 1.52 ± 0.4 | sm |
| 15 | 2.13 ± 0.1 | 31.56 ± 3.0 | 2.17 ± 0.3 | sm |
CHap = cromosoma haploide; LT = longitud total; IC = índice centrométrico; AR = relación de brazos, sm = submetacéntrico; m = metacéntrico.
Figura 2 Ideograma de plantas (de tipo silvestre) de anturio (Anthurium andreanum L.) en condición haploide.
Los resultados observados en el presente trabajo mostraron que las plantas regeneradas a partir de nudos expuestos a la colchicina resultaron aneuploides. Las plantas obtenidas a partir de explantes que permanecieron durante 2 y 3 h en presencia de colchicina presentaron de 16 a 30 cromosomas, siendo 29 los predominantes (Figuras 1b y 1c); esto originó una población mixoploide. También se observaron células con dos o más núcleos compartiendo el mismo citoplasma (Figuras 1d y 1e). Por otro lado, las plantas regeneradas a partir de explantes que permanecieron durante 4 h en la solución de colchicina presentaron de 30 a 32 cromosomas, donde predominaron los de 31 cromosomas (Figura 1f).
Características morfológicas de las mutaciones obtenidas
En los primeros meses del crecimiento in vitro, las plantas obtenidas a partir de explantes expuestos durante 2 y 3 h a colchicina eran más cortas, y tenían menos hojas y raíces que las plantas testigo, así como raíces más cortas (Figuras 3a-c). Por otro lado, las plantas que se regeneraron a partir de los explantes expuestos a colchicina durante 4 h mostraron hojas más grandes de color verde más oscuro y pecíolos más rojizos que las testigo (Figura 3d). Cuando las plantas aneuploides de anturio se cultivaron en condiciones ex vitro durante tres meses, mostraron una ligera reducción en el tamaño de las hojas y la longitud de los pecíolos con respecto a las plantas testigo (Figuras 3e-g). Tras siete meses de cultivo en el invernadero, se observó la formación de espata y espádice en las plantas regeneradas a partir de los explantes testigo y los expuestos durante 4 h a la colchicina (Figuras 3h -i). Además, las plantas mutadas eran más pequeñas que las testigo.
Figura 3 Plantas de anturio (Anthurium andreanum L.) regeneradas a partir de nudos expuestos a colchicina, creciendo en condiciones in vitro: a) 0 h, b) 2 h, c) 3 h y d) 4 h. Vitroplantas regeneradas a partir de nudos expuestos a colchicina y cultivadas durante 3 meses en invernadero: e) 0 h, f) 3 h y g) 4 h. Plantas obtenidas a partir de nudos expuestos a colchicina con espata y espádice: h) 0 h, i) 4 h.
Discusión
En este trabajo se expusieron explantes de vitroplantas de anturio a colchicina para inducir mutaciones. La sensibilidad al mutágeno fue diferente en función del tipo de explante y del tiempo de exposición. Los explantes foliares fueron los más afectados. El daño severo a los explantes foliares se podría deber a las características y al estado fisiológico de las vitroplantas y de las propias hojas (Valle-Sandoval, Mascorro-Gallardo, Gil-Vázquez, & Iturriaga-de la Fuente, 2008). A diferencia de las hojas de las plantas cultivadas en invernadero o en campo, las hojas de las vitroplantas presentaron una cutícula muy fina, lo cual pudo causar estrés por deshidratación y daños mecánicos severos derivados del corte, lo que comprometió su supervivencia. Torres y Sanabria (2011) mencionan que las hojas de plantas regeneradas in vitro pueden presentar anormalidades anatómicas y funcionales, como una reducción en el número de células del mesófilo, un sistema vascular débil, y un menor grosor de su lámina, epidermis y cutícula. Además, es probable que la exposición de las hojas a la colchicina haya aumentado su deterioro; así, las hojas de vitroplantas jóvenes de anturio se consideran una buena fuente de explantes para futuros estudios de mutagénesis.
Por otro lado, la mejor capacidad morfogenética observada en los nudos respecto a los explantes foliares y radiculares se podría deber a que en los nudos el meristemo está cubierto de primordios foliares, haciéndolo menos susceptible al daño, lo cual permitió determinar la DL50. Dicho parámetro indica la dosis en la que el 50 % de los individuos (explantes) mueren por efecto del mutágeno; su importancia radica en que a esta dosis hay una mayor probabilidad de obtener mutaciones útiles en un programa de mejoramiento genético (Álvarez-Holguín et al., 2018). En contraste, los callos generados por explantes de raíz cambiaron de color y murieron al ser transferidos al medio de diferenciación. Un resultado similar fue reportado por Chen et al. (2011) en explantes radiculares (masas de callo) de anturio “Arizona” expuestos a colchicina. Se sabe que las células meristemáticas de la raíz responden rápidamente a los fármacos, sufren daños en el ADN y acumulan proteínas (ERF115) relacionadas con la producción de etileno (hormona del estrés) (Heyman et al., 2016). Sin embargo, cabe destacar que los callos sobrevivientes formaron un mayor número de brotes que los explantes nodales.
El cariotipo y el número cromosómico de las plantas diploides de anturio son similares a los reportados por Chen et al. (2011) y Lakshmanan et al. (2015), quienes encontraron que el número de cromosomas para anturio es 2n = 2x = 30. Asimismo, fue posible detectar la presencia de satélites en un par de cromosomas de dicha flor comparables a los reportados en A. affine, A. bellum y A. pentaphyllum var. pentaphyllum (Pires-Cotias-de Oliveira, Silva-Guedes, & Cerqueira-Barreto, 1999). Los satélites son muy útiles para la descripción de los cariotipos, la delimitación taxonómica y la citogenética comparativa (Tapia-Pastrana & Tapia-Aguirre, 2018). También se registraron estructuras similares a las de los cromosomas B en nuestra exploración de las células en metafase. De igual manera, los cromosomas B habían sido reportados en otras especies de anturio como A. affine (Pires-Cotias-de Oliveira et al., 1999). Farhan y Martins (2019) mencionan que los cromosomas B son componentes cariotípicos que muestran características no mendelianas y tienen un comportamiento no estándar de herencia; su presencia puede cambiar o desaparecer en una condición aneuploide.
En cuanto a la aneuploidía y a las células multinucleadas, se sabe que la viabilidad de generar mutaciones deseables se puede ver afectada por la aparición de múltiples eventos de mutación en genomas individuales. El uso de mutágenos químicos, como la colchicina para la inducción de poliploides, frecuentemente genera aneuploidía (de Storme & Mason, 2014), la cual se refiere a la eliminación o adición de cromosomas individuales de un conjunto cromosómico básico (Huettel, Kreil, Matzke, & Matzke, 2008). Esta variación en el número de cromosomas podría ser resultado de irregularidades en la formación del huso mitótico y la citocinesis, dos mecanismos que dependen de la biogénesis de los microtúbulos (Akhmanova & Steinmetz, 2015). Los microtúbulos son estructuras celulares cruciales del citoesqueleto, y se forman por el ensamblaje consecutivo de dímeros de αβ-tubulina.
Dado que la colchicina tiene una alta afinidad por dichos dímeros in vitro, su unión da lugar a complejos de tubulina-colchicina, que también se pueden unir al extremo en crecimiento de los microtúbulos (Hardham & Gunning, 1980). Cuando los dímeros se unen in vivo, la biogénesis de los microtúbulos se detiene debido a la despolimerización de la tubulina (Leung, Li, Hui, & Kraus, 2015). La velocidad y los resultados de esta interrupción dependen de la concentración de colchicina y de la duración de la inmersión, como se ha demostrado en otros estudios. En este estudio se probó la colchicina al 0.1 % durante 2, 3 o 4 h en explantes de hojas, nudos y raíces. Quedó claro que la concentración de colchicina evaluada no fue suficiente para duplicar el conjunto de cromosomas. En cambio, la duración de la inmersión tuvo algunos resultados interesantes, como la aneuploidía y la presencia de células multinucleadas.
A las 2 y 3 h de inmersión, se observaron células multinucleadas y aneuploides con 16-29 cromosomas. La causa de esta variación podría provenir de fallas en el ensamblaje del huso mitótico o de irregularidades en la formación de los microtúbulos corticales. Es probable que los microtúbulos de ambas estructuras se vuelvan incapaces de reorganizarse debido a la despolimerización causada por la colchicina, ya que los periodos cortos de exposición a la colchicina comprometen la formación del huso y del fragmoplasto, lo cual da lugar a células multinucleadas. Este tipo de células, junto con las anafases multipolares y las fallas del huso, son frecuentes en las células tratadas con bajas concentraciones de colchicina (Compton, 2011). La extensión de este efecto también depende del tejido; por ejemplo, Ruíz y Vázquez (1982) observaron células interfásicas con núcleos grandes o micronúcleos, así como células binucleadas y polinucleadas cuando expusieron embriones de cebada a la colchicina al 0.3 % durante 24 h. En consecuencia, es probable que, durante la mitosis de estas células multinucleadas, el conjunto total de cromosomas se distribuya de forma irregular entre las células hijas, lo cual podría dar lugar a anomalías cromosómicas numéricas como las observadas en este estudio y en el de Matos (2014) en plantas de aloe vera tratadas con colchicina al 0.1 % durante 48 h.
De manera similar, las observaciones en el número de cromosomas en el tratamiento con la exposición más prolongada (4 h) indicaron que el efecto principal fue la aneuploidía, con una variación de uno o dos cromosomas adicionales. En este sentido, se ha informado que los periodos de exposición más largos (o las altas concentraciones de colchicina) estimulan la aparición de nuevas estructuras que contienen tubulina. Estas nuevas estructuras son similares a una red ondulada de “jaula de tubulina”, la cual sustituye, temporalmente, a los verdaderos microtúbulos corticales (Caperta et al., 2006). Posiblemente, esta nueva estructura de tubulina polimerizada, la reversibilidad de los complejos tubulina-colchicina, la baja concentración de colchicina y el tiempo de exposición fueron factores que permitieron que la elongación de los microtúbulos se reanudara una vez que las células dejaron de estar en contacto con el mutágeno. Por tanto, el equilibrio entre todos estos factores es clave para que se dé la ploidía.
Durante el crecimiento in vitro, las plantas aneuploides regeneradas a partir de explantes expuestos a colchicina mostraron una evidente reducción de su tamaño y vigor con respecto a las plantas testigo. En este sentido, Zhu, Shao, Pan, Ge, y Li (2015) observaron que las plantas aneuploides (nulisómicas) de Brassica napus presentaron cambios fenotípicos: eran más pequeñas, con hojas pequeñas de color verde claro, y tenían flores más pequeñas y dominancia no apical. Por el contrario, las plantas monosómicas mostraron una morfología similar a las plantas normales, pero florecieron aproximadamente 10 días antes. Asimismo, Matos (2014) menciona que en algunos casos se puede producir aneuploidía positiva, que promueve cambios a nivel morfológico como ligeros aumentos en las dimensiones foliares de las plantas, pero sin tener algún efecto visible en el incremento de la acumulación de biomasa. En algunos casos, la aneuploidía, como la monosomía y la nulisomía, puede causar mortalidad debido al efecto desestabilizador sobre la expresión génica causado por la duplicación o eliminación de algunas regiones cromosómicas (de Storme & Mason, 2014).
Sun et al. (2013) señalan que cuando los segmentos cromosómicos o cromosomas se reducen de dos a uno, se produce una compensación de la dosis (aumento de la expresión de los genes del cromosoma restante) en la mayoría de los genes afectados. En la trisomía, también se produce una reducción como resultado inverso de la dosis (a mayor dosis, menor expresión). Con efectos de dosis tanto positivos como negativos, la reducción de la expresión de los genes objetivo se producirá tanto en los monosómicos como en los trisómicos. Birchler (2013) menciona que la variación en el número cromosómico se podría eliminar por la ventaja selectiva de las células diploides normales; si un gran número de genes se ve afectado, la expresión génica se normaliza y el efecto es silenciado.
La información sobre cómo afecta la aneuploidía a las características de las plantas es limitada. Los aspectos reguladores del genoma tienen una relación estequiométrica, por lo que se infiere que la aneuploidía produce efectos perjudiciales; sin embargo, en varias especies tetraploides (maíz, cebada, datura, lechuga y centeno) se han detectado individuos aneuploides en porcentajes que oscilan entre 15 y 50 %. Lo anterior sugiere que algunas especies pueden producir gametos aneuploides y presentar diferentes niveles de tolerancia a la aneuploidía. Se ha determinado que las variaciones en la expresión de los genes dependen de múltiples factores, como la dosis de moléculas reguladoras, los factores epigenéticos, la sensibilidad de las regiones repetitivas y los mecanismos de silenciamiento de genes (Birchler, 2013).
La especiación y la diversificación de las plantas dependen de los cambios estructurales en el genoma nuclear, tanto a nivel de la ploidía completa como de los cromosomas individuales (de Storme & Mason, 2014). La aneuploidía no ha sido considerada como un factor en la especiación y la evolución del cariotipo, esto debido al efecto desestabilizador en la expresión génica causado por la duplicación o eliminación de algunos cromosomas o regiones cromosómicas (Guerra, 2008). No obstante, la aneuploidía puede aportar efectos positivos sobre el crecimiento y la proliferación celular. Además, podría ser una etapa intermedia en el establecimiento de nuevos cariotipos euploides y contribuir al establecimiento de nuevos cariotipos.
En Malus, los gametos aneuploides pueden tener una ventaja sobre los gametos euploides, la cual contribuiría al incremento de la heterocigosidad y la variación genética (Considine et al., 2012). Asimismo, en las plantas que se reproducen asexualmente, la aneuploidía somática puede ser tolerada en niveles altos, y los sectores aneuploides quiméricos pueden contribuir a la formación de nuevas plantas a través de propagación vegetativa (de Storme & Mason, 2014). Oleszczuk, Rabiza-Swider, Zimny, y Lukaszewski (2011) destacaron la importancia de las plantas aneuploides en la formación de líneas doblemente haploides en xTriticosecale Wittmack; además, afirman que los individuos aneuploides se pueden utilizar en la asignación de marcadores en los cromosomas, lo cual puede ser una herramienta importante en programas de mejoramiento asistido por marcadores de ADN.
Como se mencionó anteriormente, las plantas aneuploides pueden mostrar una reducción de tamaño (enanismo) en relación con las diploides. Se han reportado fenotipos enanos en plantas aneuploides de Musa, canola y trigo (Roux, Toloza, Radecki, Zapata-Arias, & Dolezel, 2003; Zhu et al., 2015; Jiao et al., 2020). En la presente investigación, las plantas aneuploides de anturio fueron más pequeñas que las plantas diploides (testigo), lo cual indica que el protocolo de mutagénesis in vitro desarrollado permite regenerar plantas enanas o variantes más pequeñas que mantienen su capacidad de formar flores. Actualmente, existen en el mercado fenotipos de anturios enanos cuya demanda comercial va en aumento. Sin embargo, el germoplasma de anturio que se comercializa en México proviene de los Países Bajos, ya que en el catálogo nacional de variedades vegetales no hay registro de ninguna variedad que se haya generado en nuestro país (Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas [SNICS], 2021).
Las plantas aneuploides generadas con el protocolo desarrollado en el presente trabajo podrían ser incorporadas a un programa de mejoramiento de anturio, si se identifican aquellas mutaciones que presenten características sobresalientes o novedosas de interés comercial. Dado que las plantas aneuploides pueden presentar altas tasas de mortalidad e infertilidad (de Storme & Mason, 2014), el cultivo de tejidos (micropropagación) es una alternativa viable para evitar la pérdida de material vegetal y mantener su condición aneuploide, ya que esta técnica permite clonar y multiplicar un genotipo a partir de una pequeña sección de la planta donante (planta madre) (Teixeira-da Silva, Dobránszki, Winarto, & Zeng, 2015). A partir de los genotipos seleccionados, es posible obtener líneas de mutaciones para su uso en la propagación vegetativa o como progenitores para generar híbridos. La combinación de mutagénesis y cultivo de tejidos ha sido utilizada ampliamente en el mejoramiento de variedades de propagación vegetativa, y ofrece la posibilidad de generar un mayor número de mutaciones con características agronómicas sobresalientes (Hernández-Muñoz, Pedraza-Santos, López, Gómez-Sanabria, & Morales-García , 2019).
Oladosu et al. (2016) destacan el potencial del fitomejoramiento por mutación como un enfoque flexible y aplicable a cualquier cultivo, siempre que se utilicen los objetivos y métodos de selección adecuados. En México, la mutagénesis inducida ha permitido generar variedades de diferentes cultivos ornamentales (Polianthes tuberosa, Dendranthema grandiflora, Euphorbiache pulcherrima, Helianthus annuus y Laelia autumnalis), entre los que no se encuentra el anturio (Hernández-Muñoz et al., 2019). La mutagénesis inducida se podría convertir en una poderosa herramienta para el mejoramiento genético de anturio en México, ya que permitiría el desarrollo de nuevas variedades que se adapten a las condiciones propias de este país, así como ajustarse a las necesidades del mercado nacional e internacional, reduciendo así la dependencia actual del país en cuanto a germoplasma.
Conclusiones
El efecto de la colchicina en los explantes de anturio estuvo en función del tipo de explante y de la dosis utilizada. La mayor capacidad de regeneración de los mutantes de anturio se presentó en los explantes de nudos y raíces. La exposición de los explantes a la colchicina dio lugar a plantas aneuploides (monosómicas y trisómicas), que mostraron características morfológicas diferentes a las del genotipo silvestre. La colchicina se puede utilizar en los programas de reproducción de anturios para generar variabilidad genética.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, México) por la beca otorgada a María Isabel López Martínez (1171170) para la realización de sus estudios de maestría.
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Recibido: 31 de Mayo de 2021; Aprobado: 23 de Septiembre de 2021
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