Producción de plántula

Las plántulas de un único cultivar se obtuvieron con semillas proporcionadas por el Centro Nacional de Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA) de El Salvador. Las semillas se sembraron en bandejas de plástico, de 54 por 28 cm, con turba y cubiertas con 1 cm de vermiculita. Veinte días después de la siembra, las plántulas se transfirieron a bandejas de plástico con 72 celdas y se colocaron en condiciones controladas hasta el trasplante a campo o a invernadero. Las condiciones del ambiente controlado fueron: temperatura promedio de 21 °C durante el día, 16 °C por la noche, y 12 h de luz y oscuridad.

Multiplicación de cepas de Rhizobia

Las cepas de Rhizobia evaluadas fueron: Bradyrhizobium sp. (Vigna) (R₁), Bradyrhizobium USDA 3384 (R₂), Rhizobium leguminosarum biovar (R₃) y Bradyrhizobium USDA 2370 (R₄). Las cepas R₂ y R₄ se multiplicaron en medio líquido modificado de gluconato de arabinosa (MAG), con pH ajustado a 6.6. El crecimiento bacteriano se indujo descongelando una pequeña porción de las bacterias en 100 mL de medio líquido MAG y colocando la solución en un agitador rotatorio a 200 rpm. Después de observar un crecimiento suficiente de la bacteria, la solución se diluyó en cuatro concentraciones (1:1, 1:10, 1:100 y 1:1,000) y se transfirió a cajas Petri individuales (100 x 15 mm) con medio MAG sólido. Todo el procedimiento se realizó bajo campana de flujo laminar. El inoculante para las cepas R₁ y R₃ se obtuvo de dos productos comerciales desarrollados por INTX microbials-llc, Indiana, EUA. La cepa R₁ provino del producto comercial inoculante N-DURE^® para caupí (Vigna unguiculata L.), y la cepa R₃ del inoculante N-DURE^® para frijol (Phaseolus spp. L.).

Se preparó una solución de cada una de las cepas bacterianas fijadoras de nitrógeno con concentración mínima de 2 x 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC). La colonización bacteriana del sistema radicular se indujo al aplicar, con jeringa de plástico, 10 mL de la solución al sustrato donde crecían las plántulas.

Experimento en invernadero

En 2012 se realizó un ensayo en invernadero (Experimento de invernadero 1) para evaluar la eficacia de la inoculación de cepas específicas de Rhizobia y determinar la interacción de la colonización bacteriana con aplicaciones de N inorgánico. El experimento se llevó a cabo en las instalaciones del Colegio de Ciencias Naturales de la Universidad de Massachusetts, Amherst. Las condiciones generales del invernadero fueron: 14 h de luz con temperatura promedio de 21 °C durante el día y 16 °C por la noche. Las plántulas se trasplantaron a macetas de vivero de 18.5 cm de altura y 16.2 cm de diámetro, llenadas con una mezcla de arena de río y perlita en proporción 1:1.

El diseño experimental fue bloques completos al azar con cuatro repeticiones. En el ensayo se evaluaron cuatro cepas de Rhizobia (R₁, R₂, R₃ y R₄) y un tratamiento testigo (R₀), en combinación con siete concentraciones de N (0, 26.25, 52.5, 105, 157.5, 210 y 262.5 mg·L^-1).

Las dosis de N se suministraron a través de la solución nutritiva de Hoagland 0.5 M modificada (^{Hoagland & Arnon, 1950}), utilizando nitrato de sodio (NaNO₃) como la fuente principal de N. Macro y micronutrientes también se incluyeron en la solución de Hoagland mediante fosfato de potasio (KH₂PO₄), sulfato de magnesio (MgSO₄), cloruro de calcio (CaCl₂) y cloruro de potasio (KCl), lo que aportó las siguientes concentraciones (mg·L^-1): 234 de potasio (K), 31 de fósforo (P), 48 de magnesio (Mg), 64 de azufre (S), 200 de calcio (Ca) y 525 de cloruro (Cl). Las concentraciones de macro y micronutrientes se mantuvieron constantes en las siete soluciones nutritivas, a excepción del sodio (Na): 0, 44, 87, 173, 259, 345 y 432 mg·L^-1.

Los sistemas radiculares de las plantas se lavaron cuidadosamente, y una vez que el ciclo de cultivo finalizó se registró el número de nódulos por planta (NN) y el peso promedio por nódulo (PN, en mg).

Experimentos en campo

En 2011 se realizó una evaluación en campo (Experimento de campo 1) para determinar la respuesta del cultivo a ocho dosis de N inorgánico. En 2012, se llevó a cabo un ensayo experimental adicional (Experimento de campo 2) para evaluar la eficiencia de inoculación de tres cepas de bacterias de Rhizobia fijadoras de nitrógeno con diferentes dosis de N inorgánico. Ambas pruebas se llevaron a cabo en la Granja Experimental de la Universidad de Massachusetts en South Deerfield, Massachusetts. Las características del suelo donde se establecieron los experimentos son: occum limo arenoso fino (grava-arcillosa, mezclado, Fluventic Dystrudept) con pH de 6.5, 2.4 % de materia orgánica, 10 ppm de P₂O₅, 53 ppm de K, 556 ppm de Ca, 65 ppm de Mg y 91.23 ppm de NO₃.

Las parcelas se establecieron en camas elevadas con separación de 1.8 m, cubiertas con plástico de acolchado negro degradable (BioTelo®). Las plántulas se trasplantaron a 30 cm de distancia en doble hilera por cama para obtener una densidad de plantación de 29,000 plantas·ha^-1. El riego se proporcionó con un sistema de goteo y se programó de acuerdo con la información recopilada por tensiómetros del suelo (Irrometer®, EUA) colocados a 38 y 76 cm de profundidad del suelo. El fósforo (33.7 kg·ha^-1, como P₂O₅) y el potasio (123.3 kg·ha^-1, como K₂O) se suministraron con fertilizante inorgánico mediante riego por goteo de acuerdo con las recomendaciones generales para col rizada y acelgas de la Guía de Manejo de Vegetales de Nueva Inglaterra, 2011- 2012 (^{Howell, 2011}).

En el Experimento de campo 1 se evaluaron seis dosis de N inorgánico (40, 80, 120, 160, 200 y 240 kg·ha^-1), y en el Experimento de campo 2 se incluyeron dos dosis de N adicionales (0 y 280 kg·ha^-1). Cada dosis de N se suministró en cinco aplicaciones, cada una de las cuales correspondió a 12.5 % del total de N. La fuente de N en ambos experimentos fue nitrato de amonio (NH₄NO₃). En el Experimento de campo 2, las cepas de Rhizobia (R₁, R₂, R₃ y R₄) también se evaluaron en combinación con siete concentraciones de N inorgánico. Ambos ensayos experimentales se evaluaron en un diseño de bloques completos al azar con cinco repeticiones.

Los brotes frescos (BF, en kg·ha^-1) se cosecharon en cinco ocasiones cuando se alcanzó el tamaño de comercialización del chipilín de entre 15 y 20 cm, y las muestras se secaron en horno durante 48 h a 75 °C hasta obtener el peso seco (PS, en kg·ha^-1). El color, el vigor y la uniformidad del cultivo se registraron con una escala visual de 1 a 5, donde 1 fue el peor y 5 el mejor. Asimismo, se midió la altura de la planta (AP, en cm). Los siguientes caracteres se evaluaron solo en el Experimento de campo 2: contenido de clorofila en la hoja, determinado con un medidor Minolta (SPAD-502, México) (unidades SPAD); contenido total de nitrógeno (TN, en mg·L^-1) de la materia seca, estimado con el método de combustión de Dumas en un sistema analizador de elementos, y el NN y PN, obtenidos al limpiar el sistema radicular dentro de un radio de 35 cm alrededor de la planta.

Análisis estadístico

Las lecturas de BF, PS, SPAD, AP, TN, NN y PN se sometieron a análisis de varianza con el diseño experimental de bloques completos al azar.

En el modelo, Y _ijk es la variable respuesta para la dosis de nitrógeno i, con la cepa Rhizobia j en el bloque k; μ es la media general; N _i es el efecto de la i-ésima dosis de N; R _j es el efecto de la j-ésima cepa de Rhizobia; R _j x N _i representa el efecto de interacción de la j-ésima cepa de Rhizobia con la i-ésima dosis de N; β _k es el efecto del k-ésimo bloque, y ε _ijk es el efecto del error aleatorio para el tratamiento con la i-ésima dosis de N y la j-ésima cepa de Rhizobia en el k-ésimo bloque. Para el análisis estadístico de datos del Experimento de campo 1, los términos R _j y R _j x N _i se excluyeron del modelo lineal.

La prueba de comparaciones de medias de Tukey se usó para los efectos principales de Rhizobia y N. Además, se evaluó la asociación estadística entre las dosis de N y las variables respuesta mediante contrastes ortogonales polinomiales (lineal, cuadrático y cúbico). Este análisis se realizó para el ensayo de invernadero y para ambas pruebas de campo (Experimentos de campo 1 y 2). Adicionalmente, se ajustó un modelo de regresión para BF con las dosis de N. Todos los análisis se realizaron con el programa SAS versión 9.3 (^{SAS Institute Inc., 2011}).

Respuesta del cultivo a aplicaciones de nitrógeno inorgánico

Se detectaron diferencias estadísticas en las dosis de N para BF y AP, con coeficientes de variación de 16.9 y 7.7, respectivamente (Cuadro 1). La BF cosechada durante el ciclo de cultivo varió desde 5.4 hasta 6.2 t·ha^-1, con las dosis de N de 240 y 40 kg·ha^-1, respectivamente. Se observó una asociación lineal positiva entre el BF y las dosis de N, pero solo para aplicaciones de N entre 40 y 120 kg·ha^-1. Cuando las aplicaciones de N fueron altas (240 kg·ha^-1), el rendimiento comercial se redujo 25 %, en comparación con la aplicación más bajas (40 kg·ha^-1). La AP promedio del cultivo varió de 12.5 a 13.8 cm, pero solo la AP del tratamiento NR₆ (240 kg·ha^-1) fue diferente estadísticamente del resto de las dosis de N (Cuadro 1). Lo anterior sugiere que el aumento de BF asociado con las aplicaciones de N de 40 a 120 kg·ha^-1 (Figura 1) se debió a la acumulación de biomasa, más que a un aumento en la AP.

Figura 1 Peso promedio de los brotes frescos cosechados (BF_promedio en kg·ha^-1) y peso total de brotes frescos cosechados (BF_total en kg·ha^-1) para seis dosis de nitrógeno (N) inorgánico. Experimento de campo 1, 2011. 

Se observó una tendencia polinomial cuadrática entre el BF del cultivo y las dosis de N inorgánico (Figura 1). Si dos funciones lineales independientes se ajustan para las dosis de N y BF, se observa una pendiente positiva para las dosis de N de 40, 80 y 120 kg·ha^-1; así como una pendiente negativa para las dosis de 160, 200 y 240 kg·ha^-1. Las pendientes de estos modelos fueron 6.45 y -15.2, respectivamente. De esta manera, por cada kg·ha^-1 de N inorgánico aplicado hubo un incremento de 6.45 kg·ha^-1 de BF; sin embargo, esta tendencia solo se observó para aplicaciones de N por debajo de 120 kg·ha^-1. En contraste, hubo una disminución de 15.21 kg·ha^-1 de BF por cada kg·ha^-1 de N inorgánico aplicado por arriba de 120 kg·ha^-1.

Eficiencia de inoculación de cepas de Rizobia

Como se esperaba, las inoculaciones con cepas de Rhizobia modificaron significativamente a NN y NW (P ≤ 0.01), y las aplicaciones suplementarias de N inorgánico solo afectaron el NN. En contraste, el efecto del N inorgánico sobre la eficiencia de inoculación de Rhizobia solo se observó en el NN. El Cuadro 2 presenta el NN promedio por planta y el PN individual en respuesta a la inoculación con las cepas de Rhizobia. De acuerdo con estos resultados, el NN detectado en R₁, R₂, R₃, R₄ y R₀ fue 51, 38, 128, 39 y 23, respectivamente. Las cuatro cepas de Rhizobia indujeron mayor NN que cepas nativas de América Central, para las cuales el NN promedio fue de 9.4 (^{Guamán-Díaz et al., 2016}). Por lo tanto, Rhizobium leguminosarum biovar indujo el desarrollo de seis veces más nódulos que el testigo, con un PN promedio de 0.8 mg.

De acuerdo con ^{Isidoro y Messier (2009)}, Rhizobium leguminosarum biovar es un simbionte superior para el chipilín que induce la producción de una mayor cantidad de nódulos en el sistema radicular. Las cepas R₁, R₂ y R₄ también desencadenan el desarrollo de nódulos con tamaños significativamente mayores; sin embargo, la presencia de nódulos en las raíces no siempre garantiza un proceso eficiente de fijación de N. En el chipilín, solo el 20 % de los nódulos recolectados de plantas colonizadas por cepas bacterianas nativas en América Central contenían leghemoglobina (^{Barnish & Spinelli, 2011}), la cual amortigua la concentración de oxígeno libre y garantiza la función adecuada de los nódulos de la raíz.

Recientemente, se identificó una cepa bacteriana aislada (S.F3.1) con características de la familia Rhizobiaceae que se asoció con un incremento significativo del peso fresco y seco, la altura de la planta y la biomasa de las raíces (^{Guamán-Díaz et al., 2016}). No obstante, se requiere realizar un análisis detallado en un sistema de producción intensivo para comparar la eficiencia de fijación de N del aislado S.F3.1 y Rhizobium leguminosarum biovar.

La presencia de nódulos en el sistema de raíces de las plantas del testigo también fue informado en una investigación reciente (^{Guamán-Díaz et al., 2016}). En este estudio, el desarrollo de nódulos en plantas del testigo se atribuye a la presencia de cepas de Rhizobia desconocidas en el sustrato utilizado para producir las plántulas.

El Cuadro 3 presenta el NN y el PN para las dosis de N, y se observa una asociación negativa entre el NN y la concentración de N de la solución nutritiva. Al comparar las respuestas de HS₀ y HS₁, el suministro mínimo de N de 26.25 mg·L^-1 parece soportar el desarrollo de nódulos. Resultados similares indican un incremento en el NN al suministrar 2 mmol·L^-1 de N a alfalfa (Medicago sativa) (^{Salles-de Oliviera, Anchão-Oliveira, Corsi, Sanches-Duarte, & Mui-Tsai, 2004}) y a cáñamo (Crotalaria juncea) (^{Miranda-Mendonça & Aparecida-Schiavinato, 2005}). Esta concentración mínima de N podría ser suficiente para soportar el crecimiento de la planta sin afectar en forma negativa el proceso de fijación simbiótica y biológica del N. En cambio, cuando la dosis de N alcanza 260 ppm (HS₆), hay una clara reducción del NN de aproximadamente 82 % en comparación con HS₁.

En la Figura 2 se presenta un análisis del efecto del N inorgánico sobre el NN de las plantas inoculadas con las cepas de Rhizobia. En la gráfica, la concentración estándar de la solución nutritiva Hoagland (210 ppm) se representa como 1.0 en el eje de las abscisas; la mitad del estándar de la concentración (105 ppm) se representa como 0.5, y 1.25 denota 262.5 ppm. Se observa una tendencia clara hacía la disminución en la nodulación y la fijación de N con altas dosis del fertilizante nitrogenado.

Figura 2 Número de nódulos por planta en respuesta a la inoculación de cuatro cepas de Rhizobia con seis dosis de nitrógeno (N) de la solución nutritiva de Hoagland 0.5 M modificada. 

Aunque Rhizobium leguminosarum biovar fue afectado por el gran suministro de N, el alto NN inducidos por la inoculación con esta cepa compensó dicha inhibición (Figura 2). Con concentraciones de N tan altas (260 ppm) hubo una reducción en el NN de aproximadamente 200 nódulos. La capacidad de Rhizobium leguminosarum biovar para soportar la inhibición de la fijación de N bajo altas concentraciones de N inorgánico y para maximizar la fijación bajo concentraciones reducidas de N, resalta la importancia de identificar cepas de Rhizobia específicas al huésped.

Los aumentos constantes en los precios de los fertilizantes y combustibles con N tienen un efecto importante en las decisiones de producción y la rentabilidad. Por ello, se debe hacer hincapié en el desarrollo de nuevos métodos de producción adecuados, tanto agronómica como económicamente. La capacidad de Rhizobium leguminosarum biovar para convertir el gas N estable de la atmósfera en una forma biológicamente útil es una gran ventaja en la producción de chipilín al disminuir los costos de producción y mitigar los efectos sobre el cambio climático al reemplazar todo o la mayor parte del N requerido por el cultivo.

Eficiencia de la fijación de nitrógeno por cepas de Rhizobia en sistemas de producción comercial

La eficiencia de colonización de las cuatro cepas de Rhizobia se validó en campo. El Cuadro 4 presenta las fuentes de variación en N, cepas de Rhizobia (R) y su interacción (N x R) para los caracteres evaluados. El suministro de N inorgánico al cultivo mostró un efecto positivo (P ≤ 0.01) en las principales variables económicas: color, vigor, uniformidad, BF total y color verde de hojas. Dicha respuesta coincidió con observaciones preliminares, donde un suministro constante y abundante de N inorgánico mejoró drásticamente la calidad comercial del cultivo.

Las inoculaciones con las cepas de Rhizobia también tuvieron un efecto positivo (P ≤ 0.01) en el BF de las plantas. Cepas específicas indujeron el incremento de la biomasa total de la planta, pero no mostraron efecto sobre la intensidad del color verde de las hojas. Aunque la colonización con las cepas bacterianas incrementó el NN, no hubo efecto de la colonización sobre el contenido total de N en el BF.

Por su parte, las altas dosis de N inorgánico disminuyeron la fijación de N (Cuadro 2). Este efecto negativo sobre la simbiosis también se reportó para Sinorhizobium meliloti en alfalfa (Medicago sativa) cuando el suministro anual de N alcanzó 450 kg·ha^-1 (^{Salles-de Oliviera et al., 2004}), y para Rhizobia en cáñamo (^{Miranda- Mendonça & Aparecida-Schiavinato, 2005}). Sin embargo, el NN no fue afectado por el incremento continuo de la dosis de N en el Experimento de campo 2 (Cuadro 5). Esta discrepancia puede ser causada por diferencias en el número de cosechas del cultivo y el método de aplicación de tratamientos con N. En campo, se aplicó N inorgánico cada vez que se cosechó el cultivo, mientras que en invernadero, el N se aplicó semanalmente y el cultivo se cosechó solo una vez. El crecimiento constante de las plantas en la prueba de campo pudo haber generado la extracción del N del suelo hasta el punto en que no afectara la formación de nódulos o la fijación de N.

La respuesta del rendimiento económico del BF a las dosis de N se presenta en el Cuadro 5. Si se analiza el equilibrio entre la aplicación de N y el BF en el Experimento de campo 2, se puede determinar que por cada kg de N suministrado en el intervalo de 0 a 80 kg·ha^-1, hay un incremento en BF de 30 kg·ha^-1 (P ≤ 0.01). Aplicaciones superiores de 80 kg·ha^-1 son menos rentables, ya que presentan un incremento máximo en BF de 1.12 kg·ha^-1 por kg de N aplicado. Similarmente, en PS el suministro de N superior a 80 kg·ha^-1 proporciona incrementos (P ≤ 0.01) de sólo 0.175 kg·ha^-1 por unidad de N. La ausencia de N inorgánico produjo solo 0.61 t·ha^-1 de PS por ciclo, mientras que en áreas tropicales, el PS total puede alcanzar 3.4 t·ha^-1 por año (^{Sosa-Rubio, Cabrera-Torres, Rodríguez, & Ortega-Reyes, 2008}). Adicionalmente, se observó un incremento simultáneo en el contenido de clorofila y el contenido de TN de las hojas con las dosis de N de hasta 280 kg·ha^-1.

La asociación alta entre el contenido de clorofila y la acumulación total de N en las hojas (r = 0.95, P ≤ 0.01) valida el uso del medidor SPAD para estimaciones in situ del contenido de N de la planta. En arroz, maíz, cebada y trigo, se determinó una asociación similar entre las lecturas de SPAD y la concentración de N en la hoja. (^{Dwyer et al., 1995}; ^{Lin et al., 2010}; ^{Peltonen, Virtanen, & Haggrèn, 2008}; ^{Reeves, Mask, Wood, & Delaney, 2008}; ^{Shukla et al., 2004}).

Considerando la importancia de los caracteres de calidad en la producción de hortalizas, se examinó la importancia del N inorgánico en la expresión de dichos caracteres de comercialización, y se detectaron diferencias en el color, el vigor y la uniformidad del cultivo. Cuando no se aplicó N, el color, el vigor y la uniformidad fueron 2.3, 2.5 y 2.3, respectivamente, y con 280 kg·ha^-1 de N, los valores correspondientes fueron 3.5, 3.5 y 3.3. La adición de N en más de 80 kg·ha^-1, y hasta 280 kg·ha^-1, resultó en una mejora mínima en el color de 0.2, en vigor de 0.3 y en uniformidad de 0.4. Los análisis para determinar el efecto de las inoculaciones de Rhizobia en estas tres características de calidad no mostraron significancia estadística.

El Cuadro 6 muestra las asociaciones estadísticas entre las cepas de Rhizobia y las variables BF, PS, unidades SPAD, TN, AP, NN y PN. Un incremento no significativo de 158 kg·ha^-1 en BF se asoció con la inoculación de plantas con Rhizobium leguminosarum biovar. Mientras que un incremento mínimo en el rendimiento económico en las plantas colonizadas con Bradyrhizobium USDA 3384 presentó una mejora significativa en el color verde de las hojas; aunque esta misma cepa disminuyó significativamente el NN. En promedio, Bradyrhizobium sp. (Vigna) y Rhizobium leguminosarum biovar indujeron el desarrollo de seis nódulos más por planta en comparación con Bradyrhizobium USDA 3384. A pesar de que la colonización con las cepas de Rhizobia modificó el NN, este carácter no afectó el peso por nódulo.

La asociación planta-microbio, de chipilín con Rhizobium leguminosarum biovar y Bradyrhizobium USDA 3384, fue un sistema eficiente de fijación de N, pero se necesitan mayores esfuerzos para desarrollar cultivares adaptados a inoculantes específicos y evaluar cómo los factores bióticos y abióticos pueden afectar su eficiencia de fijación. Además, la presencia de nódulos en el sistema radicular de las plantas en el testigo sugiere una competencia potencial entre el Rhizobia nativo en el suelo y las cepas introducidas. Cuando los competidores del suelo son ineficientes fijadores de N, las tasas de fijación de N y la productividad de la planta pueden disminuir (^{Olivares et al., 2013}). Además, es importante considerar múltiples inoculaciones para asegurar la adecuada colonización del inoculante.