Material vegetal

Las plantas utilizadas correspondieron a dos quimiotipos de V. planifolia (QI y QVI) de genotipo diferente (Genotipo VI y Genotipo III, respectivamente) (^{Herrera-Cabrera, Hernández-Ruíz, & Delgado-Alvarado, 2016}); los cuales se recolectaron en acahual y malla sombra en localidades de la región del Totonacapan, México (Cuadro 1). Durante el periodo de floración (de abril a mayo de 2013) se recolectaron esquejes de un metro de longitud, de la base a la punta, para obtener hojas, tallos y flores. Con el fin de obtener frutos con un mismo estado de madurez, las flores de los dos quimiotipos se polinizaron manualmente y se marcaron. Los frutos se recolectaron 32 semanas después de la polinización y se sometieron de manera uniforme a un proceso tradicional de beneficiado (^{Xochipa-Morante, Delgado-Alvarado, Herrera-Cabrera, Escobedo-Garrido, & Arévalo-Galarza, 2016}).

Preparación de extractos para cuantificación

Compuestos fenólicos totales, taninos totales, taninos hidrolizables, taninos condesados y flavonoides: De cada tejido fresco (hoja, tallo, flor, fruto verde y fruto beneficiado) se prepararon extractos en metanol a una concentración de 50 mg·mL^-1. Las muestras se colocaron en un baño ultrasónico (AutoScience AS5150B) durante 30 min; posteriormente, los extractos se filtraron y almacenaron en viales de vidrio a -20 °C hasta su análisis.

Saponinas: Se agregaron 5 mL de agua destilada a 1 g de muestra fresca de cada tejido y se llevó a un baño ultrasónico (AutoScience AS5150B) por un lapso de 20 min con intervalos de 10 min.

Triterpenos totales: A 1 g de muestra fresca se adicionaron 5 mL de etanol al 70 % (v/v) y se dejó en maceración por 10 h. El extracto se centrifugó a 3,354 g por 5 min y el sobrenadante se evaporó en rotaevaporador (Heidolph, Laborota 4000), posteriormente el residuo vegetal se lavó cuatro veces con butanol:agua (1:1), donde la fase acuosa se descartó y la orgánica se evaporó en rotaevaporador. Al residuo se le agregó éter etílico y se mantuvo a 4 °C por 12 h. Finalmente el residuo se secó y almacenó a -20 °C para su posterior análisis.

Previo a la cuantificación, a todos los tejidos se les determinó el contenido de humedad en termobalanza (Ohaus MB45) para expresar la concentración de los metabolitos secundarios con base en materia seca (MS).

Cuantificación de fitoquímicos

Compuestos fenólicos totales: El análisis se realizó mediante el método descrito por ^{Singleton y Rossi (1965)}, con algunas modificaciones. A 50 µL del extracto con metanol se agregaron 250 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu al 50 % (v/v) y se dejó reposar en oscuridad durante 8 min, posteriormente se adicionaron 1.25 mL de carbonato de sodio al 5 % (v/v) y nuevamente se dejó reposar por 30 min en oscuridad a temperatura ambiente. La lectura de absorbancia de la mezcla se realizó a 725 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300, Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg equivalente de ácido tánico por g de MS, para lo cual se obtuvo como referencia una curva estándar (y = 2.0364x - 0.0016, R² = 0.9942) con ácido tánico (Sigma Aldrich).

Taninos totales: Se determinaron de acuerdo con el método descrito por ^{Makkar, Bluemmel, Borowy, y Becker (1993)}. En un tubo de ensayo, previamente forrado con papel aluminio, se colocaron 200 mg de PVPP (Polivinilpirrolidona), 2 mL de extracto metanólico y 2 mL de agua destilada, se agitó en vórtex y se dejó reposar por 15 min en oscuridad a 4 °C. Posteriormente, se volvió a agitar, se filtró, se tomó una alícuota de 150 µL y se aforó a 1 mL con agua destilada. De este extracto se tomaron 50 µL, se agregaron 450 µL de agua destilada y 250 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu al 50 % (v/v), se agitó y dejó reposar por 8 min para después agregar 1.25 mL de Na₂CO₃ al 5 % (v/v); nuevamente se agitó y se dejó reposar en condiciones de obscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. Finalmente, se realizó la lectura de absorbancia a 725 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300, Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg de ácido tánico (Sigma Aldrich) por g de MS, con base en la ecuación proporcionada por la curva estándar (y = 2.0977x - 0.0241, R² = 0.9919).

Taninos condensados (proantocianidinas): Se realizó de acuerdo con el método propuesto por ^{Porter, Hrstich, y Chan (1986)}, con algunas modificaciones. A 500 µL del extracto metanólico se le adicionaron 3 mL de 1-butanol-HCl y 100 µL de cloruro férrico al 2 % (p/v) en HCl 2 N. La solución se colocó en baño maría a 80 °C durante 15 min. Finalmente se registró la absorbancia a 550 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300, Thermo Scientific). La concentración de taninos condensados se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación y el resultado se expresó en mg. g^-1 MS:

donde A es la absorbancia a 550 nm, % MS el porcentaje de materia seca y 78.26 el factor de corrección.

Taninos hidrolizables: El contenido de taninos hidrolizables se calculó por medio de la diferencia de taninos totales y taninos condensados. Los resultados se expresaron en mg·g^-1 MS (^{García-Ferrer, Bolaños-Aguilar, Lagunes-Espinoza, Ramos-Juárez, & Osorio-Arce, 2016}).

Flavonoides totales: Se utilizó la metodología propuesta por ^{Chang, Yang, Wen, y Chern (2002)}, con algunas modificaciones. En un tubo de ensayo se colocaron 500 µL del extracto con metanol, 1.5 mL de etanol al 80 % (v/v), 100 µL de solución de cloruro de aluminio hexahidratado al 20 % (p/v), 100 µL de acetato de potasio 1 M y 2.8 mL de agua destilada. La mezcla se agitó e incubó por 30 min a temperatura ambiente. La lectura de la absorbancia se realizó a 415 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300 Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de quercetina (Sigma Aldrich) por g de MS, a partir de la ecuación obtenida de la curva estándar preparada con quercetina (y = 6.0986x - 0.0004, R² = 0.9952).

Saponinas: Se determinaron por el método de ácido sulfúrico-vainillina descrito por ^{Hiai, Oura, y Nakajima (1976)}. En un tubo de ensayo se mezclaron 5 µL del extracto, 95 µL de agua, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado y 100 µL de una solución fresca de vainillina al 8 % (p/v) en etanol. Posteriormente, la mezcla se incubó a 60 °C durante 20 min y después se colocó en baño con hielo. La absorbancia se leyó a 544 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300, Thermo Scientific). Como referencia, se obtuvo una curva estándar (y = 0.0033x + 0.0786, R² = 0.9919) con saponina de quillaja (Sigma Aldrich). Los resultados se expresaron en mg·g^-1 MS.

Triterpenos totales: Se utilizó el método colorimétrico vainillina-ácido acético descrito por ^{Fan y He (2006)}, con algunas modificaciones. A 0.5 mg de extracto se añadieron 100 µL de vainillina al 5 % (p/v) y 400 µL de ácido perclórico; la mezcla se mantuvo a 60 °C durante 15 min. Los tubos se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se les adicionaron 2.5 mL de ácido acético. La absorbancia se obtuvo 550 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300 Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg·g^-1 MS a partir de una curva estándar (y = 0.0125x - 0.0274, R² = 0.9949) preparada con ácido oleanólico (Sigma Aldrich).

Análisis estadístico

El efecto de la estructura vegetal, quimiotipo y sistema de manejo se analizó como fuente de variación sobre la concentración de fitoquímicos en V. planifolia. Se evaluaron 20 tratamientos con nueve repeticiones de plantas distintas, con un total de 180 muestras. El diseño experimental empleado fue un arreglo factorial con tres factores (dos sistemas de manejo, dos quimiotipos y cinco estructuras vegetales) (^{Statistical Analysis System [SAS], 2002}) y la comparación de medias para cada fuente de variación se realizó mediante la prueba de Tukey (^{SAS, 2002}). Además, con la finalidad de conocer la asociación entre variables ambientales y fitoquímicos (contenido y tipo), se realizó un análisis de correlaciones canónicas de acuerdo con el procedimiento PROC CANCORR (^{SAS, 2002}).

Efecto del sistema de manejo sobre los fitoquímicos

Dentro del factor sistema de manejo, todos los fitoquímicos presentaron diferencia estadística significativa (P ≤ 0.05) en su concentración, a excepción de los flavonoides que no mostraron variación entre sistemas de manejo (Cuadro 3). En el sistema acahual, con una radiación interceptada de 60 a 70 %, los tejidos de vainilla tuvieron una concentración mayor de compuestos fenólicos totales, taninos totales, taninos hidrolizables, taninos condesados y triterpenos totales, mientras que en malla sombra, con una radiación interceptada de 30 a 45 %, la concentración solo fue mayor en saponinas (Cuadro 3), debido posiblemente a que esta condición favorece la síntesis de saponinas esteroidales que se encuentran casi exclusivamente en plantas monocotiledóneas (^{Sparg, Light, & van Staden, 2004}), como la vainilla. La diferencia en la concentración de fitoquímicos entre sistemas de manejo podría deberse a las características ambientales particulares, como temperatura, humedad relativa, altitud y luminosidad (interceptada), incluso este último factor en algunas especies epifitas tiene gran influencia sobre la producción de fitoquímicos (^{Cach-Pérez, Andrade, & Reyes-García, 2014}).

Si bien el contenido nutrimental del suelo es un factor crítico en las respuestas fisiológicas de la mayoría de las plantas, en las especies de hábitos hemiepífitos (como en la vainilla) no es así, ya que dicho hábito permite alternar el funcionamiento de raíces aéreas y hábitos epífitos cuando existe un factor de estrés nutricional o hídrico, tanto temporal como espacial. Además, un gran número de especies de la familia Orchidaceae (V. planifolia) presentan micorrizas en su sistema de nutrición que amortiguan los cambios en la disposición de minerales (^{Canestraro, Mora, & Watkis, 2014}). Por lo anterior, el suelo como tal solo le sirve al tutor de las plantas de vainilla, lo que sugiere que tuvo poca influencia en la producción de fitoquímicos.

Efecto del quimiotipo sobre los fitoquímicos

Los resultados de este estudio evidenciaron que, aun cuando las estructuras de las plantas de ambos quimiotipos presentaron los mismos fitoquímicos, el quimiotipo QVI mostró predominancia de compuestos fenólicos totales, taninos totales, flavonoides, saponinas y, especialmente, taninos condensados y triterpenos totales, que en promedio tuvieron 84 y 45 % más concentración respecto del quimiotipo QI (Cuadro 3). Al respecto, ^{Herrera-Cabrera, Salazar-Rojas, Delgado-Alvarado, Campos-Contreras, y Cervantes-Vargas (2012)} mencionan que el quimiotipo QVI ha sido uno de los clones del germoplasma de vainilla más cultivado y utilizado por los agricultores de la región del Totonacapan; en tanto que el quimiotipo QI se ha cultivado poco y no es de interés comercial.

La variación quimiotípica que existe en el germoplasma de vainilla se originó a través de un proceso de selección humana, basado en el aroma y usos que los productores totonacos le han dado por más de 250 años (^{Delgado-Alvarado, Salazar-Rojas, & Herrera-Cabrera, 2014}). El uso del quimiotipo QVI por los agricultores sugiere que en este material se ve favorecida la síntesis de metabolitos secundarios que permiten la supervivencia de la planta en entornos naturales y bajo cultivo. Lo anterior indica que este quimiotipo es más sensible a las condiciones de estrés, por lo que desarrolla un mecanismo de defensa mayor que el quimiotipo QI.

El proceso adaptativo en relación con los metabolitos secundarios se ha observado como un producto de la coevolución con los enemigos de las plantas (^{Moore, Andrew, Külheim, & Foley, 2014}). A pesar de que la selección dirigida, intensa y permanente forzaría a deteriorar la variación cuantitativa de fitoquímicos, muchas otras fuerzas selectivas intervienen sobre estos compuestos, como herbívoros (^{Lankau, 2007}), patógenos, competidores (^{Kliebenstein, Rowe, & Denby, 2005}) y estreses abióticos (^{Burchard, Bilger, & Weissenböck, 2000}).

Efecto del tejido vegetal sobre los compuestos fitoquímicos

Dentro de las especies vegetales se ha mostrado una variación amplia en la concentración de fitoquímicos en los tejidos dependiendo de la estructura de la planta (^{Tahvanainen, Niemelä, & Henttonen, 1991}), lo cual coincide con este estudio, donde la concentración de metabolitos fue diferente en relación con el tipo de estructura vegetal. Por ejemplo, la hoja tuvo la concentración más alta de taninos totales (3.84 mg·g^-1 MS) y taninos condensados (2.21 mg·g^-1 MS), mientras que los frutos beneficiados presentaron la concentración menor de estos compuestos (Cuadro 3). Generalmente, estos metabolitos se encuentran en concentraciones altas en hojas y tallos, debido a que sirven como defensa contra herbívoros, ya que proporcionan sabor astringente que causa hostilidad (^{Provenza et al., 1990}).

Fue notable que los taninos hidrolizables presentaron el valor más alto en frutos beneficiados (2.25 mg·g^-1 MS), aunque no difirió estadísticamente de los obtenidos en tallo y fruto verde (Cuadro 3). Cabe destacar que la concentración de taninos hidrolizables se obtuvo por diferencia, y debido a que es un método gravimétrico pudo influir en la tendencia observada (^{Makkar, 2003}).

Aunque se ha identificado que los taninos más abundantes en los tejidos vegetales son los condensados, recientemente se ha reportado una concentración alta de taninos hidrolizables en frutos como frambuesa (3.26 mg·g^-1), zarzamora (2.7 mg·g^-1), granada (1.77 mg·g^-1), entre otros (^{Smeriglio, Barreca, Belloco, & Trombetta, 2017}). La cantidad de taninos condensados que presentan los tejidos de vainilla (tallos, frutos verdes y beneficiados) es valiosa e importante por sus efectos en la salud (^{Olivas-Aguirre et al., 2015}).

En frutos verdes se detectó la cantidad mayor de flavonoides (11.05 mg·g^-1 MS) (Cuadro 3). En especies de orquídeas como Phalaenopsis spp., la concentración de flavonoides es de 1.7 (raíz) a 4.98 mg·g^-1 (hoja) (^{Minh et al., 2016}), lo que revela que los frutos de vainilla tienen una cantidad importante de este fitoquímico. Sin embargo, en frutos beneficiados la concentración de flavonoides fue menor, ya que posiblemente son termosensibles y durante el beneficio se degradan (^{Liu, Wang, & Cai, 2015}).

También en frutos verdes se presentó la concentración más alta de saponinas (2.34 mg·g^-1 MS). Las variaciones en la distribución, composición y cantidad de saponinas en la planta pueden deberse a las diferentes necesidades que tienen para protegerse. En Phytolacca dodecandra y Dioscorea pseudojaponica, durante el desarrollo de los frutos y tubérculos, se observó la acumulación máxima de saponinas, presumiblemente para evitar pérdida y así asegurar la maduración de las semillas y la protección de los órganos reproductivos (^{Lin, Chen, Liu, & Yang, 2009}; ^{Ndamba, Lemmich, & Mølgaard, 1993}). No obstante, en algunas especies la producción de saponinas fue en respuesta al estrés biótico (herbivoría o ataque de patógenos) o abiótico (humedad, luz, falta de nutrientes y temperatura) (^{De Costa, Yendo, Fleck, Gosmann, & Fett-Neto, 2013}).

Aun cuando en frutos verdes se detectó una concentración superior a 20 mg·g^-1 MS de compuestos fenólicos totales y triterpenos totales, en frutos beneficiados fueron superiores (23.47 mg·g^-1 y 28.77 mg·g^-1, respectivamente) (Cuadro 3). Esto debido a que durante el beneficio de los frutos se forma una mezcla compleja originada por la hidrólisis de los precursores (formas glucosiladas no-volátiles) del aroma mediante la actividad de la enzima D-β-glucosidasa, la cual los convierte a sus formas volátiles (^{Odoux, 2000}; ^{Ranadive, 1992}). De esta manera, además de la vainillina (que es el compuesto más abundante, 10 a 20 mg. g^-1), se producen más de 200 componentes, como derivados de la ruta del shikimato, terpenos, derivados de furano, ésteres, ácidos aromáticos, cetonas, fenoles, aldehídos, carbonilos y alcoholes (^{Sinha, Sharma, & Sharma, 2008}), que le proporcionan el sabor y aroma a la vainilla.

Relación entre variables ambientales y fitoquímicos

El análisis de correlaciones canónicas identificó una correlación alta (0.91 y r² = 0.83) entre los parámetros ambientales y el contenido de fitoquímicos en cada sistema de manejo. Las correlaciones con mayor significancia se observaron entre altitud y el contenido de triterpenos totales (-0.34218***), taninos totales (0.34036***) y taninos condensados (-0.4246***). Al igual que entre humedad relativa y taninos condensados (0.29691***). Las variables humedad relativa y radiación interceptada no mostraron correlación significativa con la producción de compuestos fenólicos totales, saponinas y triterpenos totales (Cuadro 4).

En la Figura 1 se observa que los dos primeros factores del análisis de correlaciones canónicas explicaron 95.76 % de la varianza total. Además, se muestra la correlación estructural entre las variables ambientales y los fitoquímicos, donde se distinguió que a mayor altitud (Alt), menor contenido de taninos totales y condensados, flavonoides y triterpenos.

Figura 1 Representación gráfica de los coeficientes de correlación estructural de los dos primeros factores en la interacción de variables ambientales () y fitoquímicos () de los tejidos de Vanilla planifolia. Altitud (Alt), temperatura (Temp), humedad relativa (HR), radiación interceptada (RI), compuestos fenólicos totales (CFT), taninos totales (TT), taninos hidrolizables (TH), taninos condesados (TC), flavonoides (Flav), saponinas (Sap) y triterpenos totales (Terp).