La granada es el fruto del árbol de granado (Punica granatum), la cual es consumida en todo el mundo y actualmente se cultiva en Irán, España, Italia, Afganistán, Estados Unidos, India, China, Rusia, Uzbekistán, Marruecos, Grecia y México (^{Koba y Yanagita, 2011}). Su producción ha cobrado importancia por las propiedades funcionales que posee, por lo que se elaboran diversos productos alimenticios como jugos, zumos y licores, además de que posee importancia en la industria cosmética (^{Ge et al., 2021}). En México, en el año 2021, se cultivaron 1,251 ha en donde se produjeron 8,636 t. Los estados con mayor volumen de cosecha fueron Morelos, Hidalgo y Oaxaca con 1,622, 1,467 y 1,327 t, respectivamente (^{SIAP, 2021}), destinadas tanto para consumo nacional como para la exportación. Por otro lado, los huertos de granado son afectados por enfermedades inducidas por diversos microorganismos tales como Alternaria spp y Aspergillus spp, siendo las de mayor impacto las que afectan directamente al fruto desde precosecha (^{Behzad et al., 2020}), tal es el caso del moho gris inducido por Botrytis cinerea, enfermedad que ha sido reportada principalmente en huertos de granado en Grecia y Pakistán (^{Bardas et al., 2009}; ^{Alam et al., 2018}), la cual se presenta posterior a la floración en los comienzos de la formación del fruto, y que se caracteriza por la presencia de manchas que aumentan de tamaño, con lesiones expandidas de color marrón claro a oscuro de consistencia blanda, seguido de la aparición de micelio gris sobre las superficies infectadas. Los frutos pueden permanecer momificados en el árbol. Recientemente este problema fitosanitario ha sido reportado en el Estado de México, México (^{Patricio-Hernández et al.,2023}), por lo que se requiere de la utilización de escalas diagramáticas para estimar la severidad del moho gris en frutos de granada en pre y postcosecha, las cuales son herramientas que permiten una correcta interpretación del avance y progreso de enfermedades en los cultivos, definiéndose como conjuntos de ilustraciones de plantas u órganos vegetales, con signos y síntomas que muestran los porcentajes del área afectada por la enfermedad con base en el principio de Weber-Fechner, que permite establecer clases en un sistema logarítmico que elimina la designación arbitraria de los niveles de severidad (^{French y Hebert, 1980}), las cuales, deben ser rápidas y simples al usarse bajo condiciones de campo y postcosecha, así como, exactas, precisas y reproducibles (^{Richard et al., 2021}; ^{Vereschuk et al., 2022}). Hasta la fecha, no se han reportado escalas para evaluar la severidad del moho gris sobre frutos de granada. El objetivo del presente estudio fue desarrollar y validar una escala diagramática, la cual servirá a los productores y técnicos para evaluar la severidad de la enfermedad.

Durante los meses de julio a septiembre del año 2022 se colectaron 120 frutos de granada con y sin síntomas de moho gris (Botrytis cinerea) en parcelas con producción activa ubicadas en los municipios de Chilcuahutla y Taxquillo, Hidalgo, México (20° 18’ 11’’ N, 99° 14’ 23’’ O, 20° 32’ 01’’ N, 99° 20’ 03’’ O, respectivamente). Posteriormente se seleccionaron 60 frutos representativos de los diferentes grados de afectación. Para obtener la severidad real, cada fruto fue dividido a la mitad para poder tomar fotografías de la superficie total de cada uno con una cámara fotográfica profesional Canon T7 (Verechuk et al., 2022).

Para eliminar el fondo, las imágenes fueron procesadas con el software GIMP^® v.2.10.12. La cuantificación del área total y afectada se realizó con Image Tool v1.8.0. Con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de severidad real mediante la siguiente fórmula: severidad = (área enferma/área total de la imagen) * 100 (^{Nutter Jr et al., 2006}; ^{Ortega-Acosta et al., 2016}). Los datos se utilizaron para definir los valores mínimos y máximos de severidad real, los cuales se utilizaron para generar una escala logarítmica con seis clases, con el software 2LOG v.1 (^{Mora-Aguilera y Acevedo-Sánchez, 2018}), el cual sigue la ley de agudeza visual de Weber-Fechner (^{Horsfall y Cowling, 1978}). Los datos obtenidos se utilizaron para construir la escala diagramática con el software Adobe Photoshop (^{Fantin et al., 2018}).

Para validar la escala diagramática, 60 imágenes digitales representativas de los diferentes grados de severidad se insertaron aleatoriamente en diapositivas individuales para ser visualizadas en Microsoft 365^® Power Point y presentadas a 18 evaluadores con y sin experiencia en la observación de enfermedades en plantas, quienes realizaron evaluaciones en forma independiente en un tiempo aproximado de 20 s/imagen para su visualización. Los datos de esta primera evaluación se expresaron como porcentaje de severidad (^{Fragoso-Benhumea et al., 2022}). Para la primera y segunda evaluación con la escala se seleccionaron 12 evaluadores tomando como criterio la cantidad de aciertos en la evaluación sin la escala y su disposición para su participación subsecuente (^{Belan et al., 2014}). Cada evaluación se realizó con un intervalo de 7 días entre cada una.

Para cuantificar la exactitud de las evaluaciones de severidad que hicieron los evaluadores, se realizó una regresión lineal simple para verificar las siguientes hipótesis: para el intercepto (β ₀) la hipótesis nula H₀: β ₀=0 versus H₁: β ₀≠0 y para el coeficiente de la pendiente (β ₁) H_o: β ₁=1 versus H₁: β ₁≠1, con un nivel de significancia del 5%, utilizando una prueba t, teniendo como variable independiente los valores reales obtenidos y como variable dependiente los valores estimados por evaluador (^{Da silva et al., 2019}), tomando en cuenta que si los valores estimados de la pendiente son diferentes de 0, indican una sobreestimación de la severidad real cuando β ₀ >0 y una subestimación sí β ₀<0. De igual manera sí los datos de la pendiente son diferentes de 1, indican sobreestimación de la enfermedad (>1) o una subestimación (<1) en todos los niveles de severidad de la enfermedad (^{Nutter Jr. y Schultz, et al., 1995}; ^{Nutter et al., 2006}; ^{Ortega-Acosta et al., 2016}).

También, la precisión de la estimación fue determinada por el coeficiente de determinación (r²) de la regresión lineal y se graficó el error absoluto, además se realizó un análisis de datos pareados por evaluador. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa Rstudio (http://www.rstudio.com/).

A partir de colectas en campo en los municipios de Chilcuautla y Taxquillo, Hgo., se obtuvieron 120 frutos de los cuales se seleccionaron 60 con base a su grado de severidad real. Aquellos con 0% de severidad fueron considerados sanos y los que presentaron signos y síntomas de moho gris, se caracterizaron por la presencia de lesiones marrones que se originaron en la base del cáliz y avanzaron hacia el pedúnculo lo que ocasiona pudrición del área infectada con valores desde 5 a 100% de afectación.

Con base en los porcentajes de área dañada de los 60 frutos seleccionados, el programa 2LOG permitió definir seis clases de severidad. Los rangos y los puntos medios de cada clase (0, 1, 2, 3, 4 y 5) se expresaron como porcentaje de la superficie afectada: Clase 0= 0, Clase 1 = (>1 - 5 - 10), Clase 2 = (>11 - 25 - 50), Clase 3 = (>51 - 75 - 85), Clase 4 = (>86 - 90 - 95) y Clase 5 = (>96 - 100) (Figura 1).

Figura 1 Escala diagramática para evaluar severidad del moho gris (Botrytis cinerea) sobre frutos de granada (Punica granatum). Entre paréntesis se muestran los intervalos de severidad para cada clase. 

La exactitud de las evaluaciones mostró diferencias significativas con y sin el uso de la escala diseñada. Cuando ésta no fue utilizada, los valores de r² variaron de 0.06 a 0.87 con una media de 0.44, sin embargo, con el uso de la escala los resultados fueron de 0.71 a 0.93, para la primera evaluación y de 0.70 a 0.97 para la segunda evaluación, con valores de media de 0.81 y 0.90, respectivamente, por lo tanto, las estimaciones fueron precisas (Cuadro 1).

Respecto a los resultados de la regresión lineal, en la evaluación donde no se utilizó la escala, los valores del intercepto fueron mayores a uno, indicando sobreestimación de la severidad por la mayoría de los evaluadores. En el caso de los valores de la pendiente, para el evaluador 10 (EV10) fue significativamente diferente de 1, sin embargo, hubo tendencia a la subestimación, a excepción de EV1 y EV11 que mostraron valores más cercanos a 1 (Cuadro 1).

Para la primera evaluación donde se utilizó la escala, los valores del intercepto mostraron una tendencia a la sobreestimación de la severidad de la enfermedad, donde para el EV3 fue significativamente diferente de 0. En cuanto a los valores de la pendiente, el EV4, EV5, EV6 y EV10 mostraron sobrestimación con respecto al resto de los evaluadores. En la segunda evaluación, el EV4 y EV5 subestimaron la severidad al obtener valores mayores a 1, por otro lado, para el EV1 y EV7 los valores fueron estadísticamente diferentes de 0. Para el caso de la pendiente, ninguno de los datos mostró diferencia significativa, sin embargo, sus valores fueron cercanos a 1 (Cuadro 1).

En general, tomando énfasis en las evaluaciones donde se utilizó la escala y con base en las hipótesis nulas (H₀: β ₀=0 y H₀: β ₁=1), β ₀ presentó valores cercanos a 0 para todos los evaluadores, mientras que para β ₁ todos estuvieron alrededor de 1, esto confirma que el uso de la escala diagramática de severidad del moho gris permite obtener valores de precisión y de exactitud cercanos a los de severidad real, aun cuando existen ligeras tendencias de subestimación y sobreestimación de los mismos. Esta afirmación se ve reforzada al comparar los valores de error absoluto de las evaluaciones, donde se observa una disminución del mismo al utilizar la escala diseñada en este trabajo (Figura 2).

Figura 2 Representación gráfica del error absoluto de las estimaciones de la severidad del moho gris en frutos de granada. a) evaluación realizada sin apoyo de la escala diagramática, b) y c) evaluaciones realizadas con apoyo de la escala diagramática. d) y e) representación de los incisos b) y c) a menor escala del error absoluto. 

Las combinaciones de los valores de r² de las evaluaciones mostraron que las escalas son reproducibles. En donde no se utilizó la escala diagramática se obtuvo un intervalo de 0.13 a 0.77, con una media de 0.44. Con las escalas, los intervalos de r² fueron de 0.72 a 0.91, y de 0.76 a 0.97, en la primera y segunda evaluación, respectivamente, con un valor medio global de 0.85 (Cuadro 2).

El uso de escalas diagramáticas es eficiente en la evaluación de la severidad de las enfermedades en plantas (^{Fantin et al., 2018}). Recientemente se reportó la presencia de moho gris causado por B. cinerea en frutos de granada en México (^{Patricio-Hernández et al., 2023}), y hasta donde se sabe no se ha reportado oficialmente una escala diagramática para evaluar la severidad de dicha enfermedad. La escala desarrollada en la presente investigación, permite evaluar la severidad de esta enfermedad de manera confiable con una mayor precisión y exactitud. Cuando no se utilizó la escala, el valor promedio de r² fue de 0.44 mientras que en la primera y segunda evaluación con la escala se obtuvo un promedio de 0.81 y 0.90, respectivamente, lo que representa un incremento significativo, esto concuerda con lo observado por ^{Belan et al. (2014}), quienes obtuvieron valores de r² de 0.89 a 0.87 en la primera y segunda evaluación, respectivamente, al utilizar la escala que ellos diseñaron para el manchado foliar del cafeto.

Los valores de r² de la presente investigación fueron significativamente mayores en las evaluaciones donde se utilizó la escala, lo cual se asemeja a lo reportado por ^{Fragoso-Benhumea et al. (2022}), (0.90 a 0.97, con media de 0.93) quienes evaluaron la severidad de la roya (Uromyces viciae-fabae) en el cultivo de haba, con y sin la utilización de escalas diagramáticas, concluyendo que dicho valor mejora con el uso de escalas diagramáticas. Esto es un indicativo de que la escala diseñada puede ser utilizada en campo, al poseer valores de precisión (r²) cercanos a 1 en las evaluaciones.

En diversos estudios se ha observado la tendencia a la sobreestimación (^{Figueiredo et al., 2022}; ^{Pereira et al., 2021}) y en menor medida a la subestimación (^{Braga et al., 2020}) cuando no se utilizan escalas diagramáticas. En el presente trabajo se observaron sobreestimaciones en la mayoría de los datos absolutos cuando no se hizo uso de la escala diagramática, en contraste, con las evaluaciones donde sí se utilizó. Este comportamiento puede deberse a estímulos visuales, tales como coloraciones similares en las lesiones que no son consideradas para la evaluación de la severidad, tal y como lo reporta ^{Perina et al. (2019}), quienes identifican los factores que pueden llevar a la sobre estimación de la severidad de la mancha marrón sobre hojas de Citrus reticulata ocasionada por Alternaria sp., por la presencia de pigmentos diferentes en la superficie del órgano que no corresponden a la enfermedad evaluada, esto puede afectar a evaluadores con y sin experiencia.

El uso de la escala, permitió disminuir considerablemente el error absoluto de las evaluaciones, con respecto a donde no se utilizó (sin la escala fue de -59 a 39%, con la escala fue de -0.4 a 0.4% y -0.16 a 0.48% en la primera y segunda evaluación, respectivamente). Resultados similares fueron obtenidos por ^{Muños-Arias et al. (2020}) para el moho gris en Rubus glaucus, donde el valor de este parámetro disminuyó por el uso de la escala diagramática (de -30 a 30% sin la escala a -20 a 20% con la escala). Por otro lado, ^{Ortega-Acosta et al. (2016}) y ^{Nutter Jr y Schultz (1995}), mencionan que valores menores al 5% del error absoluto, son considerados aceptables. En este trabajo se obtuvieron en promedio para las dos evaluaciones resultados de -0.35 a 0.5%, lo cual apoya la exactitud de las evaluaciones al utilizar la escala, por lo que la presente investigación aporta un instrumento confiable para la evaluación de la severidad inducida por el moho gris en frutos de granada.

Al comparar los valores de r² entre evaluadores, se observó que la escala diseñada es precisa al reducir los intervalos de variación entre comparaciones al utilizar la escala diagramática, la cual permitió estimar la severidad del moho gris ocasionado por B. cinerea sobre frutos de granada, de manera exacta, precisa y reproducible, por lo que puede ser empleada como herramienta en el manejo, el seguimiento y el monitoreo de la enfermedad.