Materiales y métodos

Aislados de E. perseae. Se utilizaron cinco aislados de E. perseae, de un total de 25 provenientes de distintas áreas agroecológicas de Michoacán, que se encuentran en la Colección de Hongos Fitopatógenos de la Facultad de Agronomía “Presidente Juárez” de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, en Uruapan, Michoacán.

Para la selección de los aislados, se consideraron áreas agroecológicas de muestreo, que se dividieron con base a la altura en metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.). Se consideró la altura óptima para el desarrollo del cultivo del aguacate de 1200-2300 m.s.n.m., obteniendo un total de cinco áreas. De cada área se seleccionó al azar un aislado: 1; aislado de Cerro Colorado ECC (1200-1420 m.s.n.m.), 2; Zumpimito EZU (1421-1620 m.s.n.m.), 3; Zacandaro EZA (1621-1820 m.s.n.m.), 4; Ario de rosales EAR (1821-2080 m.s.n.m.) y 5; aislado de Canacuas ECA (2081-2300 m.s.n.m.). Debido al lento crecimiento (tasa de 0.29 a 0.35 mm por día) solo cinco aislados fueron evaluados en esta investigación.

Para realizar las pruebas in vitro y de patogenicidad, se reactivaron las cepas y se sembraron en medio de cultivo PDA (10 mL por caja). Las condiciones en las que se mantuvieron fueron a 28 °C y 80% de humedad. Se generaron un total de 60 réplicas (seis por área).

Ensayos de patogenicidad y virulencia de E. perseae. Se utilizaron plantas de aguacate de vivero de un año de edad de las variedades Flor de María y Méndez, con frutos de 6-9 cm (etapa de llenado de fruto). Estas variedades se seleccionaron ya que en estudios previos se observó su susceptibilidad a dicha hongo. La variedad Méndez, son propiedad del vivero californiano Brokaw y Flor de María está en proceso de registro de derechos de obtentor (^{Compean, 2020}). Las plantas se mantuvieron en el vivero de la Facultad de Agrobiología “Presidente Juárez”. Un mes antes del inicio del experimento las plantas se trataron con el fungicida Switch^® (1 g L^-1 de agua) y Oleotech higuerilla (0.35 mL L^-1 agua). Lo anterior para eliminar posibles patógenos. También se fertilizaron con fosfato monopotásico (2 g por planta) y se regaron cada tercer día con aproximadamente 2 L de agua por planta para mantenerlas sanas.

Se realizó una doble inoculación, primero, con un alfiler entomológico del número cero se realizaron de 8 a 10 punciones en el epicarpio del fruto de aguacate en un área de aproximadamente 1.5 cm de diámetro para facilitar la entrada del hongo. Posteriormente, sobre el área de las punciones, con ayuda de un sacabocados se colocó una porción (5 mm de diámetro) de medio de cultivo PDA con crecimiento de E. perseae. Por otro lado, se realizó otra inoculación, utilizando una porción de algodón que contenía suspensión de esporas a una concentración de 1 x 10⁶ conidios mL^-1. La edad del hongo al momento de inoculación fue de cinco meses. Posteriormente, cada fruto de aguacate se cubrió, durante tres días, con papel parafilm y con una bolsa de polietileno, la cual funcionó como cámara húmeda.

Para medir la virulencia, se consideraron los siguientes parámetros: días en los que se presentaron los primeros síntomas, número y tamaño de manchas y caída del fruto. Las observaciones se realizaron cada tercer día durante en un periodo de 150 días.

El diseño experimental fue completamente al azar de los cinco aislados, con tres repeticiones más un testigo absoluto, sin inocular. Se contó cada fruto de la planta como una repetición. Se realizaron análisis estadísticos y pruebas de Tukey con P<0.05.

Sensibilidad de aislados de E. perseae a diferentes fungicidas in vitro. Se utilizaron cinco fungicidas químicos (Azoxystrobin 25SC 0.4 mL PF/L agua, Tiabendazol 60WP 0.6 g PF/L, Pyraclostrobin 25CE 1.0 mL PF/L, Ciprodinil+Fludioxonil 62.5WG 1.0 g PF/L y Azoxystrobin+Propiconazol 20SE 0.4 mL PF/L) y cuatro productos autorizados para su uso en huertos con manejo orgánico (Sulfato de cobre 1.0g PF/L, Gluconato de cobre 2.0 mL PF/L, Oxicloruro de cobre 1.0 g PF/L y extracto de Larrea tridentata 2.0 mL PF/L). Los productos fueron evaluados con los cinco aislados de E. perseae. En cada uno de estos compuestos se usó la dosis del producto formulado (PF). También se incluyó un tratamiento testigo sin fungicida. El diseño fue completamente al azar, para cada fungicida y aislamiento del hongo se tuvieron cinco repeticiones, una repetición fue representada por una caja Petri.

Para el bioensayo se utilizó medio de cultivo PDA. Después del proceso de esterilización del PDA, el medio se mantuvo a 50 °C en matraces Erlenmeyer y por cada matraz se agregó la dosis previamente mencionada de cada uno de los fungicidas y se vaciaron en cajas Petri y se dejó solidificar por 24 horas. Posteriormente se colocó en el centro y por separado, un disco agar (8 mm de diámetro) que contenía micelio de cada uno de los cinco aislados del patógeno. El testigo, fue cada aislado en medio de cultivo PDA sin fungicida. Se utilizó cinco cajas por fungicida.

El ensayo se mantuvo en una incubadora a 24 °C y 80% de humedad relativa en completa oscuridad. Después del inicio del experimento, cada semana se midió con un vernier el diámetro de crecimiento de cada uno de los aislamientos de E. perseae. Para los fungicidas autorizados para huertos con manejo orgánico (sulfato de cobre, gluconato de cobre, oxicloruro de cobre y el extracto vegetal Larrea tridentata) se tomaron mediciones durante un mes, para los fungicidas químicos (azoxystrobin, tiabendazol, pyraclostrobin, cyprodinil+fludioxonil y azoxystrobin + propiconazol) por tres meses, esto debido a la vida media de los productos orgánicos que son de 15 a 20 días máximo y los químicos pueden llegar hasta 90 o 120 días, además, por el lento crecimiento de E. perseae, el cual puede tardar hasta un año en llenar la caja Petri. El porcentaje de inhibición del crecimiento del micelio (PIM) se obtuvo de acuerdo con la fórmula de ^{Pandeyet al. (1982}).

Donde dc = diámetro de la colonia del testigo, dt = diámetro de los tratamientos. Los datos de PIM se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (P < 0.05). Se utilizó el programa JMP de SAS Institute.

Resultados y discusión

Todos los aislamientos de E. perseae evaluados produjeron manchas pequeñas de color purpura que conforme avanzó la enfermedad, las manchas fueron más grandes y coalecieron formando corchosis a los 150 días. Estos síntomas se asociaron a la enfermedad de mancha púrpura o roña del aguacate en los frutos (Figura 1). Los síntomas observados coincidieron con los descritos por ^{Everett et al. (2011}), ^{Fan et al. (2017}) y ^{Morales (2017}; 2022).

Figura 1 Síntomas de mancha púrpura=roña en frutos de aguacate producidos en las pruebas de patogenicidad por los aislados de E. perseae, en variedad Flor de María (superior) y Méndez (inferior). A) ECC (1,200-1,420 m.s.n.m.), B) EZU (1,421-1,640 m.s.n.m.), C) EZA (1,641-1,860 m.s.n.m.), D) EAR (1,861-2,080 m.s.n.m.), E) ECA (2,081- 2,300 m.s.n.m.). 

La variedad Flor de María fue la primera en presentar síntomas con un promedio aproximado de 41 días. Mientras que, Méndez presentó síntomas a los 91 días. Esta variedad también presentó mayor número y tamaño de manchas, con un promedio de 7-8 manchas y un tamaño promedio de 3 mm; y en el caso de la variedad Méndez presentó un promedio de 2-3 manchas y un tamaño promedio de 2 mm, esto al mes de haberse observado la presencia de síntomas (Figura 2).

Figura 2 Comparación de dos variedades de aguacate de Flor de María y Méndez. A) Grado de daño, B) Presencia de síntomas (días), C) en número de manchas y D) tamaño de manchas de los cultivares flor de María y Méndez. Valores promedio ± desviación estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05). 

De acuerdo con los parámetros evaluados, se observa la susceptibilidad variedad Flor de María con respecto a la variedad Méndez, lo que concuerda con lo expuesto por ^{Morales (2022}), quien reportó que en distintas variedades de aguacate inoculadas con E. perseae, la variedad Flor de María fue más susceptible, presentando síntomas más severos. Al contrario de lo que menciona Morales (2017) quien dio a conocer que existe una notable preferencia de E. perseae por atacar con mayor incidencia y severidad en campo al cultivar Méndez. Sin embargo, en campo se observa mayor superficie sembrada de variedad Méndez que de Flor de María, por lo cual es que no se ha detectado la susceptibilidad de esta variedad a dicha enfermedad.

Con respecto al grado de virulencia de los aislados de cada una de las áreas agroecológicas, se pudo observar que la variedad Flor de María, los frutos inoculados con los aislados de Cerro colorado (ECC) de 1200-1420 m.s.n.m. y Canacuas (ECA) de 2081-2300 m.s.n.m., fueron los primeros en presentar síntomas a los 33 días, mientras en número de manchas fue estadísticamente significativo el aislado ECC con 15 manchas. En cuanto al tamaño de las manchas no hubo diferencias significativas (Figura 3).

Figura 3 Comparación de presencia de síntomas y número de manchas de los aislados de cada área agroecológica en variedad Flor de María. Valores promedio ± desviación estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05). 

En los aislados de Zacandaro (EZA) y Canacuas (ECA) fueron los primeros en mostrar síntomas en la variedad Méndez a los 87 días. En cuanto al número de manchas, con el aislado EZA presentaron el mayor número de manchas en los frutos; mientras que, el tamaño de manchas no presentó diferencias significativas (Figura 4). El aislado ECC mostró el mayor grado de virulencia en la variedad Flor de María y el aislado EZA en variedad Méndez de acuerdo con los parámetros evaluados, seguidos del aislado ECA en ambas variedades.

Figura 4 Comparación de presencia de síntomas y número de manchas de los aislados de cada área agroecológica en variedad Méndez. Valores promedio ± desviación estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05). 

El área agroecológica de donde provenían los aislados de E. perseae pudo influir en su virulencia, ya que hubo diferencia estadística significativa con respecto a la presencia de síntomas y número de manchas. De acuerdo con ^{López (2006}) se encontró que en aislados de Histoplasma capsulatum provenientes de diversas regiones geográficas presentaron diferencias en virulencia, esto debido a que un organismo se encuentra en diferentes condiciones ambientales, por lo que puede cambiar su comportamiento (incidencia y serveridad) de acuerdo con la condición en que se encuentren.

Productos autorizados para su uso en huertos con manejo orgánico. Todos los productos evaluados perdieron efecto con el paso del tiempo. Sin embargo L. tridentata y oxicloruro de cobre desde la primera semana mostraron el mayor porcentaje de inhibición de micelio de 58%. Mientras que el gluconato de cobre mostró muy baja inhibición del micelio desde la primera semana con un 22% (Cuadro 1).

De acuerdo con ^{IRET (2022)}, la vida media de un fungicida es el tiempo requerido (en días) para convertir el 50% de éste en otra(s) sustancia(s), en cualquiera de las matrices o compartimentos ambientales (agua, aire, suelo, biota) y según ^{TECAGR (2013)}, los productos orgánicos pierden efecto entre 1 y 7 días, aunque depende de la formulación del producto y condiciones ambientales.

El efecto que mantuvo L. tridentata sobre los aislados de E. perseae inhibiendo el 58% del micelio del hongo (Cuadro 1), puede deberse a que este extracto contiene ácido nordihidroguaiaretico que según ^{Arteaga et al. (2005}), ^{Gowan (2022)}, Vargas et al. (2006) y ^{Lira (2003}) tiene un alto potencial para el control de hongos productores de aflatoxinas. En este sentido E. perseae se caracteriza por producir elsinocromos que según ^{Daub y Chung (2009)} es un tipo de toxina similares a las del género Aspergillus.

El oxicloruro de cobre tuvo mayor inhibición (57.5%) de micelio de los aislados evaluados en comparación con los otros compuestos que contenían cobre. El sulfato de cobre presentó una inhibición de 42% y gluconato de cobre 21.8% (Cuadro 1). Esto puede deberse a la concentración que posee este producto (35-70% de cobre metálico) (^{Adama, 2021}) y por su alto potencial de ionización al tener más cantidad de ion Cu^2+, que es la parte que tiene la acción fungicida e inhibe la germinación de las esporas (^{TECAGR, 2013}), más que el sulfato de Cu (25%) y gluconato de Cu (<9%) (^{Adama, 2021}). Además, la solubilidad de oxicloruro de cobre es más baja, esto significa que el cobre se libera más lentamente, por lo tanto, actúa por más tiempo (^{TECAGR, 2013}). El cobre actúa sobre seis diferentes estructuras y/o procesos de la célula del hongo: núcleo, ribosoma, mitocondria, retículo endoplasmático liso y rugoso, membrana plasmática y cromatina, lo que uede favorecer la eficiencia (^{Adama, 2021}).

La baja inhibición que tuvo el gluconato de cobre in vitro del 21.8% de inhibición sobre los aislamientos de E. perseae (Cuadro 1), se podría deber a que este producto interactúa con la planta ya que fue diseñado específicamente para mejorar la asimilación del cobre en el interior de la planta (^{ATEEC, 2022}). Como argumentan ^{Kirkby y Römheld (2007}) el cobre ayuda a la planta en la fotosíntesis, respiración y desintoxicación de radicales superóxidos y también a la producción de fitoalexinas que inhiben la germinación de esporas y el crecimiento de hongos y ligninas que forman una barrera mecánica como resistencia de la planta a enfermedades, por lo cual sería interesante probar su eficacia en campo.

Cada aislado evaluado de las diferentes áreas agroecológicas, presentó diferentes grados de sensibilidad, similar con lo reportado por ^{Espinoza et al. (2017}) que al evaluar la sensibilidad de 60 aislamientos Colletotrichum acutatum a los fungicidas tiofanato-metilo y azoxistrobina de dos regiones productoras de fresa, la dosis efectiva media DE₅₀ de tiofanatometil varió de 0.3 a 9.7 mL L^-1 en el Valle de Maravatío ubicada a 2032 m.s.n.m. y de 1.4 a 3.0 mL L^-1 en el Valle de Zamora (a 1580 m.s.n.m) y para azoxistrobina varió de 0.04 a 0.36 mL L^-1 en Maravatío y de 0.07 a 0.99 mL L^-1 en Zamora, mostrando así diferentes grados de sensibilidad en cada zona.

Por otro lado, de acuerdo con Fuentes et al. (2014) las melaninas que producen los hongos pueden protegerlos de algunos productos antimicóticos, en el caso de E. perseae produce elsinocromos a partir del segundo mes.

El tratamiento con L. tridentata presentó el mayor porcentaje de inhibición (74%) en los aislados de Zumpimito (EZU) y Canacuas (ECA) con 75% de inhibición, siendo el aislado de Zacandaro (EZA) donde tuvo menor efecto 34%. Oxicloruro de cobre en el aislado EZU logró un mejor control sobre el crecimiento con un 72% de inhibición, con diferencias significativas sobre el resto de los aislados. El sulfato de cobre tuvo la mayor inhibición del 60% en el aislado ECC, y en el aislado EAR registró menor efecto de inhibición (27%). Por otra parte, con el tratamiento de gluconato de cobre no existió diferencias significativas en el crecimiento del micelio de los aislamientos evaluados de las áreas agroecológicas (Cuadro 2).

Productos químicos. Los bioensayos con productos químicos se midieron tres meses en los cuales el primer mes todos los productos inhibieron por completo el crecimiento del micelio. En el segundo mes azoxistrobin+propiconazol, tiabendazol y azoxystrobin, no se observaron crecimiento micelial, por lo que se inhibió el crecimiento del micelio en un 100%, comparado con el testigo que creció 3 cm de diámetro. Cyprodinil + fludioxonil y pyraclostrobin perdieron efecto en el segundo mes de evaluación de los aislados mostrando un porcentaje de inhibición del 93%. Esto podría deberse al tiempo de eficiencia del producto por el tiempo de degradación que, de acuerdo con ^{Syngenta (2022)}, para cyprodinil + fludioxonil es de 10 a 30 días, para pyraclostrobin de 2 a 36 días y para azoxystrobin es de 17 a 30 días, mientras que para propiconazol es de hasta 85 días y tiabendazol hasta de 120 días. Aunque según ^{NPIC (2022)} se ha encontrado una amplia variedad de vidas medias para el mismo fungicida bajo diferentes condiciones ambientales.

En el tercer mes los productos azoxistrobin+propiconazol y tiabendazol continuaron inhibiendo el crecimiento del micelio en un 100%, mientras que cyprodinil+fludioxonil y pyraclostrobin inhibieron 87.5 y 86.3%, respectivamente y fue estadísticamente significativo comparado con azoxistrobin+propiconazol y tiabendazol. Aunque azoxystrobin perdió efecto inhibiendo solo el 93.3% no fue estadísticamente significativo con respecto a azoxistrobin+propiconazol y tiabendazol. Todos los productos tuvieron un porcentaje de inhibición de micelio significativo comparado con el testigo (Cuadro 3).

Con cyprodinil+fludioxonil y pyraclostrobin se presentaron diferencias significativas a los 60 y 90 días al presentar distintos porcentajes de inhibición de micelio en los aislamientos de las diferentes áreas agroecológica, resultando ser unos más sensibles que otros (Cuadro 4). Se observó menor susceptibilidad a estos productos del aislado ECA del 67%.

Conclusiones

Los cinco aislados de E. perseae de cada área agroecológica presentaron diferentes grados de virulencia en frutos de aguacate. Las plantas de vivero inoculadas en la variedad Flor de María, mostraron mayor susceptibilidad al patógeno bajo los parámetros evaluados (número de manchas, tamaño de manchas y días en los que se presentaron los síntomas). Los aislados de E. perseae de las diferentes áreas agroecológicas mostraron diferentes valores de sensibilidad in vitro a los fungicidas evaluados (Larrea tridentata, Oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, cyprodinil+fludioxonil y pyraclostrobin). Larrea tridentata y el oxicloruro de cobre inhibieron el 74.1 y 72.4% con el aislado EZU (1421-1640 m.s.n.m.), siendo los mejores productos comparado con gluconato de cobre al controlar un máximo de 37.7% de inhibición. El hongo presentó mayor sensibilidad in vitro (100%) a los fungicidas químicos: tiabendazol y azoxystrobin + propiconazol y a los autorizados en huertos con manejo orgánico: L. tridentata y oxicloruro de cobre un 58%.