En México el cultivo del café (Coffea arabica) es una de las actividades principales que conlleva una gran importancia económica, social y ambiental. Tal es el caso del estado de Veracruz, que se mantiene entre los primeros lugares de producción debido a la superficie destinada (alrededor de 139 mil hectáreas), volumen de comercialización (^{SAGARPA, 2015}) y número de productores para su cultivo (^{Pérez y Pérez, 2012}). Específicamente, se cultivan las variedades Typica, Garnica, Bourbon, Caturra, entre otros (^{López-García et al., 2016}). Sin embargo, el cultivo de Coffea arabica y sus variedades, son vulnerables a problemas fitosanitarios que afectan la producción de granos y su calidad; como es el caso de la variedad Typica que se caracteriza por un porte alto, tronco y ramas delgadas muy separadas, hojas grandes con puntas de color bronce, frutos de color rojo, acidez y alta calidad en taza, por sus notas a flores y frutas de sabores complejos (^{Hernández-Solabac et al., 2011}; ^{López-García et al., 2016}). No obstante, esta variedad es susceptible a plagas y enfermedades, entre las que más predominan y afectan su producción, se encuentra la roya del cafeto, producida por el hongo Hemileia vastatrix (^{Avelino et al., 2015}).

Ante este problema fitosanitario, el control químico, a pesar de ser efectivo cuando se usa adecuadamente, conlleva altos costos para los productores, y en ocasiones, el sistema de cultivo orgánico de café tiene estándares oficiales que prohíben el uso de pesticidas (^{Shigueoka et al., 2014}; ^{Silva-Acuña et al., 2002}). Mientras que la introducción de híbridos resistentes de la especie arábica, es la forma de control más económica y amigable con el ambiente (^{FAO, 2015}). Sin embargo, la resistencia de la planta puede reducirse debido a la variabilidad genética del patógeno, su alto potencial evolutivo y probabilidad de eventos de mutación (^{Várzea y Marques, 2005}). Actualmente, las nuevas iniciativas y tendencias tecnológicas se están dirigiendo al desarrollo de bioinsumos como bioinsecticidas, bioherbicidas, biofungicidas, entre otros (^{Ordanza-Beneitez 2017}); que incluyen estimulantes de defensas, técnicas de control biológico y derivados de productos naturales obtenidos a partir de plantas y microorganismos (^{Ordanza-Beneitez 2017}; ^{Mesa et al., 2019}). Por lo que, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en inglés), ha descrito que los productos naturales juegan un papel importante para proteger cultivos bajo el concepto del Manejo Integrado de Plagas y Enfermedades (MIPE) (^{Cantrell et al., 2012}; ^{Leahy et al., 2014}; ^{Sparks et al., 2017}).

Es por ello, que, en varios sistemas de cultivo como el maíz y frijol, por mencionar algunos, han usado este tipo de alternativas, por ejemplo, el aceite esencial del neem (Azadirachta indica) se utilizó para combatir hongos fitopatógenos como Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Sclerotina sclerotiorum, Lagenidium giganteum, Metarhizium anisopliae y Fusarium graminearum (^{Mohamed-Ali et al., 2017}; ^{Mohammad et al., 2014}; ^{Mohanty et al., 2008}; ^{Heidtmann-Bemvenuti et al., 2016}), así como en las urediniosporas de Phakopsora pachyrhizi, observándose una reducción del 35% de severidad de la roya asiática de la soya (Glycine max) cultivada en invernadero. Asimismo, el extracto de acuyo u hoja santa (Piper auritum), ha sido catalogado como agente biofungicida contra especies de hongos fitopatógenos tales como Helminthosporium y Fusarium spp. (^{Montes-Belmont, 2009}), Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides y Botryodiplodia theobromae (^{Pineda et al., 2012}). Dado a esta particularidad, en este estudio se evaluó la actividad biofungicida de extractos foliares de Piper auritum y A. indica sobre H. vastatrix a través de ensayos in vitro e in vivo.

Se obtuvieron hojas frescas (que no tuvieran daño mecánico y sin manchas) de A. indica colectadas en Boca del Río, Veracruz (19° 09’ 00.3” N y 96° 07’ 32.9” W, 16 msnm) y P. auritum colectadas en Coatepec, Veracruz (19° 27’ 33.3” N y 96° 57’ 18.8” W, 1200 msnm) durante el periodo de primavera del año 2020. Las hojas frescas de ambas especies se enjuagaron con agua corriente para limpiarlas, posteriormente, se trituraron y pesaron 10 g por especie mediante una balanza analítica; estas se colocaron en un recipiente limpio y se agregaron 100 mL de etanol absoluto, se dejó reposar durante 72 h y, en otro recipiente se realizó la misma operación, pero en este caso, se le agregó una solución apolar (una mezcla 1:1 de hexano con cloroformo). Transcurrido este tiempo, las soluciones por separado, se vertieron en un embudo con papel filtro (Wattman # 2) para obtener el extracto etanólico y apolar. Finalmente, cada extracto, se colocó en baño maría a 45°C para concentrar los extractos vegetales (1g a 900 mg de extracto recuperado), hasta evaporar el solvente (método modificado de ^{Alvarado-Castillo et al., 2017}). Posteriormente, se guardaron en un refrigerador a 4 °C para su posterior uso en los ensayos in vitro e in vivo.

Las uredosporas de H.vastatrix se colectaron de hojas de café arábica Typica infectadas de forma natural. La colecta se realizó en los meses de abril-julio del año 2020, en la localidad de Mahuixtlán, Coatepec, Ver., (19° 24’ 31.7” N y 96° 55’ 37.0” W, 980 msnm); en ese mismo día se llevaron al laboratorio de parasitología de la Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Veracruzana, Xalapa, Ver. Las uredosporas, se colectaron con ayuda de un pincel de punta fina y se depositaron en tubos de 2 mL marca eppendorf, para posteriormente llevar a cabo el ensayo in vitro. Se usó el método de ^{Alvarado-Castillo et al. (2017}) para realizar el ensayo de efectividad de los extractos. Este ensayo consistió en colocar 100 ± 10 uredosporas de H. vastatrix en una cámara húmeda, posteriormente se les aplicó el extracto de P. auritum y A. indica en tres concentraciones, 1000, 3000 y 5000 ppm (1mL de volumen), un testigo a base de agua:etanol (1:1 v/v) y un blanco que fue Oxicloruro de cobre (OXIMET^®) 50% polvo humectable (3.0 g/L de agua); se preparó siguiendo las instrucciones del empaque comercial para la aplicación en cafeto. Las cámaras húmedas se colocaron en una incubadora a una temperatura regulada de 27 °C por cinco días, siendo la unidad experimental una caja Petri por cada tratamiento, y se realizó por triplicado. Se consideraron cinco días de observación debido que es el tiempo necesario para observar el inicio de germinación los tubos germinativos de las uresdosporas, que generalmente ocurre a partir de las seis a 12 h, sin que esta penetre y lleve a cabo su ciclo biológico totalmente, como el fitoparásito obligado que lo caracteriza (^{Avelino y Rivas, 2013}; ^{Virginio-Filho y Astroga-Domian, 2015}).

La observación de germinación in vitro, se realizó a las 24, 72 y 120 horas con el apoyo de un microscopio óptico (VELAB™ modelo VE-B6) y se cuantificó el número de esporas germinadas por tratamiento. Transcurridos los cinco días, se obtuvo el porcentaje de germinación por cada tratamiento. El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente fórmula: % inhibición de crecimiento = [(crecimiento del testigo - crecimiento del tratamiento) / crecimiento del testigo] *100 (Tomado con modificaciones de ^{Polanco-Florían et al., 2020}).

Para el análisis in vivo de la efectividad de los extractos de P. auritum y A. indica, se utilizaron plantas de café variedad Typica con presencia de H. vastatrix que se obtuvieron de un vivero comercial ubicado en San Marcos de León, Xico, Ver. (19° 25’ 17.1” N 96° 57’ 59.2” W, 1100 msnm) durante el periodo de primavera del año 2020. Posteriormente, se llevaron a la facultad de Biología, Universidad Veracruzana, Xalapa, Ver., para su posterior análisis. Los criterios de selección e inclusión de las plantas fueron el tamaño y número de hojas similares (11 a 15 hojas aproximadamente), misma edad (un año), variedad, sustrato y sin ningún tratamiento previo con fungicidas. Las plantas de café se agruparon por unidad experimental de 10 individuos y se formaron los diferentes grupos por tratamiento: testigo (agua), blanco (oxicloruro de cobre), extracto etanólico de P. auritum y A. indica a tres concentraciones, 1000, 3000 y 5000 ppm; cada tratamiento con tres repeticiones. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar. El análisis de los datos se realizó por medio de un análisis de varianza (ANOVA) y la comparación de medias de cada evaluación, 24, 72 y 120 h, se realizó con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) y una previa comprobación de los paramétricos de Normalidad mediante prueba de Shapiro-Wilks, utilizando el programa STATISTICA^® para Windows.

Todas las plantas de café se mantuvieron en las mismas condiciones de temperatura, humedad, incidencia de luz y aplicación de agua, en condiciones de vivero. Para inducir la infección de H. vastatrix (previamente colectadas en la localidad de Mahuixtlán, municipio de Coatepec, Ver), se inocularon alrededor de 100 uredosporas por centímetro cuadrado (previamente cuantificadas con la ayuda de un estereoscópico binocular básico (VELAB™ modelo VE-S1) en el envés de las hojas de las plantas de café Typica con la ayuda de un pincel de punta fina. Para observar la infección, se utilizó el criterio de la escala diagramática de severidad de infección de roya del café (^{SINAVEF, 2013}); así como el progreso de la enfermedad durante los 20 días, Período de incubación (PI) y Período de latencia (PL). Es importante resaltar que, durante este periodo, se observó la producción de los primeros soros, liberación de nuevas esporas que confirmaron la presencia de roya e inicio del proceso de infección (^{Avelino y Rivas, 2013}) en un 2% del área afectada para iniciar con el experimento (^{Capucho et al., 2011}).

La aplicación de los tratamientos se realizó en el envés de las hojas, una vez que se detectaron los primeros signos del patógeno (100 mL de volumen de solución previamente preparada), y se registró el avance de la enfermedad (0, 5, 10, 15 y 20 días después de la inoculación) (^{SINAVEF, 2013}), es decir, durante la aparición de nuevas manchas amarillas o anaranjadas en el envés de las hojas, que es uno de los indicativos del incremento de la enfermedad. Se cuantificó el avance de la enfermedad mediante una escala diagramática de acuerdo con ^{SINAVEF (2013)}, en todos los grupos experimentales. Al mismo tiempo, se tomaron fotos del haz y envés de las hojas para clasificarlas de acuerdo con la escala diagramática de severidad y verificar las reacciones crecientes de H. vastatrix como ha sido reportado por ^{SINAVEF (2013)} y ^{SENASICA (2019)}. Para evaluar la severidad en hoja se utilizó la escala de ^{SINAVEF (2013)}.

Los datos obtenidos con la escala diagramática fueron transformados a porcentajes de severidad, utilizando la fórmula de Townsend y Heuberger (^{Guillén-Sánchez et al., 2017}):

P=∑n*vCM*N*100

Donde,

P - media ponderada de severidad

n - número de hojas por cada clase en la escala

v - valor numérico de cada clase

N - número total de hojas en la muestra

CM - categoría mayor

El diseño experimental que se utilizó fue completamente al azar, con arreglo factorial de tres repeticiones. El factor A correspondió al fungicida comercial y a las tres concentraciones de los extractos de plantas y, el factor B al hongo. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para determinar el efecto del tratamiento. En los casos donde se encontraron diferencias, se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) utilizando el programa STATISTICA^® para Windows.

En la Figura 1, se observa el efecto de inhibición de la germinación de las uredosporas de H. vastatrix en todos los tratamientos. Los extractos de A. indica y P. auritum, tanto etanólico como apolar, inhibieron el 99% de la germinación de H. vastatrix y no se observó la coloración amarilla que comúnmente presentan las uredosporas sin tratamiento. Mientras que, las uredosporas tratadas con oxicloruro de cobre continuaron con una coloración amarilla similar a las del grupo testigo (Figura 1 A y C). En el grupo testigo, se observó un incremento paulatino de germinación de las uredosporas, del 18% al 99% durante las 24, 72 y 120 horas (Figura 2).

Figura 1 Efecto de extractos vegetales en uredosporas de Hemileia vastatrix. A) Uredosporas de H. vastatrix sin tratamiento; B) Testigo, la flecha de color azul muestra los tubos germinativos de H. vastatrix. C) Blanco (Oxicloruro de cobre) inhibe la germinación de H. vastatrix. D-F) Extracto A. indica etanólico; G-I) extracto A. indica apolar; J-L) Extracto P. auritum etanólico; M-O) extracto P. auritum apolar (40X), las flechas amarillas señalan despigmentación de H. vastatrix y sin germinación. 

El efecto de los tratamientos de A. indica y P. auritum, en particular la concentración de 3000 ppm y 5000 ppm, promovieron un daño sobre las uredosporas de H. vastatrix; debido que se observaron uredosporas decoloradas y deformadas en parte de la estructura exterior de la uredosporas, mientras que las uredosporas que recibieron oxicloruro de cobre permanecieron amarillentas y no germinaron. De acuerdo con Alvarado et al. (2017), mencionaron que las uredosporas dañadas en la parte exterior del hongo y despigmentadas, no tienen capacidad para germinar después del tratamiento con extractos vegetales, y considerando la definición del concepto “antifúngico de ^{Gregorí-Valdés (2005})”, comprueba que los extractos foliares de A. indica y P. auritum tienen actividad biofungicida contra las uredosporas de H. vastatrix. Ambos extractos implementados en este estudio, podrían estar alterando parcialmente las estructuras externas, o simplemente, alterando su viabilidad o capacidad de superviviencia, bien sea directa o indirectamente como los describe Gregorí-Valdés (2005).

Figura 2 Porcentaje de germinación de uredosporas de Hemileia vastatrix ante la acción de extractos etanólicos y apolares de Piper auritum y Azadiractha indica, y oxicloruro de cobre (Blanco) durante las 24 h, 72 h y 120 h de exposición. Las letras indican diferencias significativas entre las medias (Tukey, P ≤ 0.05). 

El efecto dañino de los extractos sobre las uredosporas podría deberse a la presencia de los metabolitos secundarios con actividad biofungicida, tales como los monoterpenoides, sesquiterpeoindes y fenilpropanoides en P. auritum; o bien, la presencia de los metabolitos fenólicos, alcaloides y glicósidos en A. indica (^{Mohammad et al., 2014}; ^{Pineda et al., 2012}; ^{Nagano y Batalini, 2021}). Asimismo, se puede considerar que la presencia de varios metabolitos secundarios podría tener una sinergia para inhibir la germinación de H. vastatrix, es decir, una acción conjunta para incrementar su acción biofungicida (^{Babatunde, et al., 2019}; ^{Mgbeahuruike et al., 2017}; ^{Durant-Archibold et al., 2018}, ^{Salehi et al., 2019}; ^{Mesa et al., 2019}). Esta posible acción, podría estar interactuando en la pared o membrana celular del hongo, sin embargo, es importante realizar otros estudios que permitan identificar los posibles mecanismos de acción y que tipo de metabolitos secundarios están actuando como biofungicida.

En los ensayos in vivo, se omitió el extracto apolar debido a su grado de toxicidad para el ambiente. Mientras que al utilizar los extractos etanólicos de P. auritum y A. indica no se observó ningún incremento de manchas amarillas o esporulación de las uredosporas en las plantas de café Typica, a las tres diferentes concentraciones 1000, 3000 y 5000 ppm (Figura 3); manteniéndose un porcentaje constante de alrededor del 26.6% durante los 20 días de experimentación (^{SENASICA 2019}); es decir, no se encontraron nuevas colonias de esporas en el envés de las hojas y se minimizó el margen de lesión foliar de acuerdo a la escala diagramática de evaluación de severidad de la roya del café en hojas y plantas, como ha sido reportado por ^{SAGARPA (2015)} y ^{SENASICA (2019)}. Por lo que, la severidad se mantuvo constante desde el inicio hasta al final del ensayo, observándose solo las manchas amarillentas ocasionadas por las uredosporas de H. vastatrix (Figura 4 C y D).

Figura 3 Porcentaje de severidad de H. vastatrix en hojas de café Typica tratadas con extractos etanólicos foliares de A. indica y P. auritum durante 20 días de tratamiento. En el título del eje Y: Severidad de Hemilea vastatrix (%). Las letras indican diferencias significativas entre las medias (Tukey, P ≤ 0.05). 

Mientras que, en el testigo, la infección aumentó progresivamente hasta finalizar el ensayo, quedando en la clase cuatro de severidad, representada en un 69.3 % del porcentaje de severidad de la enfermedad (Figura 4 y 5 A). Al comparar los tratamientos a través del tiempo, se encontraron diferencias significativas entre ellos (Tukey, P ≤ 0.05). En el caso de las plantas de café tratadas con oxicloruro de cobre, la infección no se incrementó, sino que, esta se observó hasta 15 días después de la aplicación del tratamiento; la infección subió de la clase dos a la tres, representando de un 32 a 52 % de severidad (Figura 4); es decir, hubo aparición de algunas manchas amarillentas con pequeñas pústulas del hongo en el envés de la hoja de las plantas de café Typica, que indica el inicio de la producción de uredosporas. Por lo tanto, el empleo de los extractos etanólicos de A. indica y P. auritum, ha sido hasta ahora, uno de los extractos prometedores para ser aplicados en plantas de café Typica en condiciones de vivero, y como preventivo a una creciente infección de roya del café H. vastatrix. ^{Sánchez-Fernández et al. (2013}), reportaron la importancia de realizar pruebas en invernadero o viveros sobre especies vegetales cultivables o sobre malezas para determinar la actividad de tipo pre y post-emergente; así como la identificación de los compuestos naturales y activos potenciales.

Figura 4 Efecto de la aplicación de oxicloruro de cobre y extractos de Azadirachta indica y Piper auritum en hojas de café Typica. A) Testigo, flechas rojas indican la infección de H. vastatrix; B) Oxicloruro de cobre, manchas amarillentas; C y D) Hojas de café tratadas durante 15 días con extracto de A. indica y P. auritum (las flechas rojas señalan el daño ocasionado por la infección inicial, así como la ausencia de uredosporas debido a la aplicación de los extractos vegetales). 

Asimismo, previos estudios han reportado que los extractos de P. auritum y A. indica son efectivos para el manejo de hongos fitopatógenos de plantaciones de mango, aguacate, manzana, durazno, tomate, papa y arroz infectados con hongos de los géneros Colletotrichum, Botryodiplodia, Alternaria, Curvularia, Sarocladium, Bipolaris, Fusarium (^{Pineda et al., 2012}); Rhizoctonia y Sclerotium (^{Mohamed-Ali et al., 2017}), Sclerotinia (^{Mohammad et al., 2014}), Lagenidium y Metarhizium (^{Mohanty et al., 2008}). Estas investigaciones, refuerzan la idea de que los extractos de P. auritum y A. indica podrían ser utilizados como biofungicidas potenciales en plantas de café Typica previo a ser sembradas en parcelas y, la concentración a elegir podría ser entre un rango de 1000 a 5000 ppm. Así, el empleó de estos extractos en el marco de una agricultura sostenible, es una alternativa promisoria por su efectividad, bajo costo y de fácil degradación debido a su origen natural (^{Rodríguez et al., 2000}; ^{Villavicencio-Nieto y Pérez-Escandón, 2010}). Aunado a lo anterior, se recomienda establecer un consenso de clasificación según el efecto del extracto como: activo, moderadamente activo y ligeramente activo e inocuo; que permita clasificar al extracto vegetal como antifúngico promisorio (^{Mesa et al., 2019}). Finalmente, sugerimos que el empleo de A. indica y P. auritum constituye una alternativa novedosa como biofungicida contra H. vastatrix.

Se concluye que los extractos foliares de A. indica y P. auritum a concentraciones de 1000, 3000 y 5000 ppm inhibieron la germinación de H. vastatrix durante las 120 horas de tratamiento, causando uredosporas H. vastatrix decoloradas y deformadas en la estructura exterior. Asimismo, ambos extractos aplicados en plantas de café variedad Typica, presentaron actividad biofungicida contra las uredosporas de H. vastatrix y redujeron la propagación de la enfermedad durante los 20 días de aplicación de los extractos. Por lo tanto, los extractos de A. indica y P. auritum a concentraciones de 1000 a 5000 ppm, son una alternativa en el manejo preventivo de la roya del cafeto, principalmente en plantas de vivero. Esto podría ser una alternativa en el manejo preventivo en cultivos de café Typica en viveros.