Materiales y métodos

Aislamiento y caracterización del fitopatógeno causante del tizón foliar. El aislamiento de Alternaria sp. se realizó a partir de hojas y tallos de plantas de crisantemo con signos y síntomas asociados al tizón foliar. Las muestras fueron colectadas en la Unidad Florícola “Nicte-Ha”, en el municipio de Chocholá, Yucatán, México (20° 41’ N y 89° 49’ W). A partir de material infectado se hicieron cortes de aproximadamente un cm² y se desinfestaron en una solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 2 min. Se depositaron de cuatro a cinco piezas de tejido vegetal en cajas Petri con medio agar dextrosa y papa (PDA) y se incubaron a 28 °C (^{Villanueva-Couoh et al., 2005}). Después de tres días, el hongo se purificó mediante cultivos monospóricos. Para lograr la esporulación del hongo se utilizó el medio agar extracto de malta y a partir de éstos, se realizó la identificación del hongo mediante características morfotaxonómicas que incluyeron: color y tipo de micelio, número de conidios y conidióforos (^{Barnett y Hunter, 1972}; ^{Simmons, 2007}), medición del ancho y largo de 100 conidios con microscopio compuesto (Estándar Modelo K7) y en aumento 400x.

Asimismo, se corroboró con la identificación molecular del fitopatógeno. Para estos propósitos, se registró la cepa del hongo como CICY004 y se cultivó en medio papa-dextrosa-agar (PDA) en placas de Petri e incubadas a 25 °C y 12 h de luz/ 12 h de oscuridad durante cuatro días. El ADN genómico se extrajo de acuerdo a ^{Johanson y Jeger (1993}). La mezcla de reacción (1X) contenía 100 ng de ADNg, 2 mM MgCl2, 200 mM dNTPS, 0.4 mM de cada primer ITS1 e TS4 (^{White et al., 1990}) y 1U de Taq polimerasa, en un volumen total de 25 mL. La reacción de PCR se llevó a cabo con una desnaturalización inicial de 95 °C durante 3 min, y 30 ciclos con 1 min a 95 °C, 45 s a 53 °C y 30 s a 72 °C. Después de los ciclos, se dio una etapa de elongación de 3 min a 72 °C.

Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (Invitrogen^®). Los productos amplificados fueron purificados con un kit de purificación de PCR (Gene Clean II, Roche) y posteriormente fueron secuenciados en el Instituto de secuenciación de Davis, CA (http://www.davissequencing.com) usando 100 ng del producto de PCR. Se secuenciaron ambas hebras de ADN, usando el oligo ITS1 para la hebra sentido y el oligo ITS4 para la hebra antisentido.

Las secuencias obtenidas se editaron con el programa BioEdit Sequence Alignment (^{Hall, 1999}) para eliminar las secuencias correspondientes a los iniciadores y las regiones mal secuenciadas (ruido con Ns). Una vez editadas, la secuencia antisentido se convirtió en sentido con la herramienta Reverse Complement (https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html), en ambas secuencias se alinearon con el programa ClustalW (^{Madeira et al., 2019}), para obtener una secuencia consenso en la cual cada base fue confirmada por ambas hebras; se obtuvo una secuencia consenso de 533 nucleótidos y se comparó con las bases de datos del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y RDP “Ribosomal Database Project” (https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) con el algoritmo BLAST. La secuencia de 533 nucleótidos se depositó en el GenBank con el número de accesión MH846127.

Se realizó un análisis BLASTN con la secuencia MH846127, y se seleccionó una accesión de cada especie entre los primeros 100 comparaciones que tuvieron homología con la secuencia MH846127; adicionalmente se incluyó la accesión MN153803 de la cepa HN4-9 deA. eichhorniaeya que no estuvo entre los primeros 100 homólogos. El análisis se realizó con el programa MEGA X mediante el método Maximum Likelihood (^{Tamura y Nei, 1993}).

La patogenicidad de la cepa CICY004 se determinó en 15 plantas sanas de crisantemo en condiciones protegidas. Las plantas fueron laceradas superficialmente en la parte axial de las hojas con un pincel y se inocularon 20 µL de una suspensión de 2.5 × 10⁶ esporas mL^-1. Las plantas se colocaron en contenedores de plástico por separado y se cubrieron para regular la temperatura y la humedad durante dos días. Después de cinco días, a partir de las lesiones necróticas en las hojas se reaisló el patógeno (^{Riego et al., 1997}).

Preparación de los extractos acuosos. El extracto acuoso del material vegetal deshidratado de raíz de A. gaumeri y la corteza de B. flammea (30 g de cada uno) se obtuvo mediante infusión (20 min) en 500 mL de agua destilada a punto de ebullición (^{Herrera-Parra et al., 2009}). La infusión se filtró a través de papel y se aforó a 1000 mL para obtener el extracto acuoso al 3% (30 g L^-1, p/v) (^{Vargas-Díaz et al., 2014}). El extracto se almacenó a temperatura ambiente (menos de 24 h) hasta su aplicación en campo.

Evaluación de extractos en el control de la enfermedad. Para asegurar la presencia del patógeno en el cultivo en campo, la cepa CICY004 se creció por 15 días en medio PDA a 23 °C. A partir de este cultivo, se realizó una suspensión de 2.5 × 10⁶ esporas mL^-1 (^{Vargas-Díaz et al., 2014}). El cultivo se estableció en los meses de marzo a mayo, en la Unidad Limones Cheé en el área Florícola Ulu´umil lool, en el municipio de Maní, Yucatán, México (20°39’ N y 89°40’ W), se utilizaron esquejes de C. morifolium cv. Polaris Yellow con 20 días de edad; éstos fueron proporcionados por la Unidad Florícola “Nicte-Ha” del municipio de Chocholá, Yucatán, México. Los esquejes se trasplantaron en camas de 1 m de ancho x 12 m de largo, y como sustrato se utilizó una mezcla local de suelo, abono orgánico de bovinaza y grava en proporción 2:2:1. El diseño experimental fue bloques completamente al azar, con cuatro repeticiones por tratamiento; para cada repetición se utilizaron parcelas de 1 m por 2.5 m. Cuando las plantas alcanzaron una altura de 30 cm, cada parcela experimental fue inoculada con una suspensión de 2.5 × 10⁶ esporas mL^-1 de la cepa fúngica indicada. Después de ocho días de la inoculación, las plantas se asperjaron semanalmente con los tratamientos, durante siete semanas. Los tratamientos evaluados fueron T1: extracto acuoso de la corteza de B. flammea (30 g L^-1), T2: extracto acuoso de la raíz de A. gaumeri (30 g L^-1), paralelamente dos testigos, T3: Control negativo (agua) y T4: fungicida comercial Captan (2 g L^-1).

El control de la enfermedad se realizó con la estimación de la severidad de la enfermedad, con el uso de una escala logarítmica diagramática de severidad para el patosistema C. morifolium-A. chrysanthemi (^{Villanueva-Couoh et al., 2005}). Las mediciones se iniciaron al observarse los síntomas de la enfermedad (ocho días después de la inoculación con el fitopatógeno) y se continuaron semanalmente con muestreos al azar, y en cada repetición, un total de 20 plantas centrales, de las cuales se consideraron 30 hojas basales de cada planta. Con base en el porcentaje de severidad, se construyeron curvas del progreso de la enfermedad y se estimó el Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE), mediante el método de integración trapezoidal (^{Campbell y Madden, 1990}); tasas de infección aparente con el modelo de descripción de Weibull, con el parámetro inverso b ^-1 (^{Thal et al., 1984}) y severidad final de la enfermedad (Y_final) con la última evaluación y con la que se calculó la efectividad del control de la enfermedad (^{Abbott, 1925}).

En adición, como variables de crecimiento se registraron el número de botones y diámetro del racimo en 20 plantas centrales. El experimento se repitió dos veces y los resultados se promediaron para sus análisis estadísticos. El manejo general del cultivo se realizó de acuerdo a las prácticas tradicionales del productor. Al finalizar del experimento se aisló el hongo para verificar la presencia de la cepa CICY004.

Análisis de datos. Los datos obtenidos de los parámetros epidemiológicos, así como las variables de crecimiento, se analizaron con el paquete computacional SAS para Windows versión nueve, mediante un análisis de varianza de una vía y prueba de comparación de medias (Tukey, p≤0.01).

Resultados

Identificación morfológica y molecular. La cepa del hongo CICY004 en medio extracto de malta mostró un crecimiento aterciopelado, inicialmente de color olivo en los bordes y posteriormente de color café; al reverso de la caja Petri se observó de color negro. Los conidios presentaron forma obclavada o cilíndrica de color oscuro. En su morfometría, con una longitud de 52 a 82 μm por 12.5 a 15 μm de ancho en la parte más ancha. Con 5 a 9 septos trasversales y 0 a 4 longitudinales, solitarios o en cadenas de dos frecuentemente (Figura 1). El análisis morfológico de la cepa CICY004 mostró diferencias con las cepas reportadas por ^{Domínguez-Serrano et al. (2016}), ya que presentó conidios de mayor tamaño (52-82 × 12.5-15 µm) que A. alternata (15-35 × 7.5-12.5 µm) y A. tenuissima (30-67,5 × 7,5-12,5 µm). De igual forma, la cepa CICY004 presentó cadenas cortas con uno o dos conidios, mientras en A. alternata cadenas de 10-37 conidios y en A. tenuissima cadenas de 5-12 conidios (^{Barnett y Hunter, 1972}; ^{Simmons, 2007}). Estos datos confirmaron que la cepa CICY004 es diferente y de acuerdo a la descripción del hongo este correspondió a la especie de A. chrysanthemi (Barnett y Hunter, 1972; Simmons, 2007). La patogenicidad de la cepa se comprobó al ser inoculado y reaislado en plantas de crisantemo.

Figura 1 Características morfológicas de la cepa CICY004 (A. chrysanthemi), A). Morfología de la colonia en medio agar extracto de malta, B) conidios de la cepa CICY004. 

En el análisis BLAST de la región ITS de la cepa CICY004, fue homóloga a secuencias que corresponden con Alternaria con 100% de cobertura y 99.81% de identidad, por lo que se confirmó que la cepa pertenece a este género. Para confirmar la cepa con registro CICY004 corresponde con alguna de las especies de Alternaria previamente reportadas en México (^{Domínguez-Serrano et al., 2016}), se comparó la secuencia de la región ITS de CICY004 con esas cepas (A. alternata KF728748, KF728750 y A. tenuissima KF728749, KF728751), se encontró con ambas especies una identidad del 99.62 %, lo que descarta que CICY004 se trate de alguna de ellas.

Con base en la identificación morfológica, y al análisis de la secuencia, la cepa con registro CICY004, se identificó como A. chrysanthemi. La secuencia se depositó en el GenBank como A. chrysanthemi CICY004 con el número de acceso MH846127.

Efecto de extractos en campo sobre el control de la enfermedad. Los síntomas de la enfermedad del tizón foliar en el cultivo se presentaron a los 37 días después del trasplante (ddt). En el control negativo (agua) el progreso de la enfermedad fue mayor que en el resto de los tratamientos (Figura 2).

Figure 2 Progress curves of the severity of leaf blight caused by A. chrysanthemi on the chrysanthemum crop and effect of the application of treatments T1: Aqueous extract of the cortex of B. flammea, T2: Aqueous extract of the root of A. gaumeri, T3: Negative control (water) and T4: Captan ^® fungicide. 

Figura 3 Efecto de tratamientos en el control del tizón foliar en crisantemo, T1: Extracto acuoso de la corteza de B. flammea, T2: Extracto acuoso de la raíz de A. gaumeri, T3: Control negativo (agua) y T4: Fungicida Captan ^® . 

Con base al ABCPE y Y_final los extractos acuosos A. gaumeri (T2) (165% por día, 8 y 67%, respetivamente) y corteza de B. flammea (T1) (186% por día, 13 y 50%, respetivamente) redujeron la severidad de la enfermedad, con diferencia significativa con respecto al control negativo (T3) (369% por día, 25 y 0%, en su orden). Asimismo, la aplicación de estos extractos fue significativamente igual al fungicida Captan® (T4) (179% por día, 14 y 45%, respectivamente) (Cuadro 1 y 2). Sin embargo, cuando se estimó la velocidad de la enfermedad mediante la tasa de infección con el modelo de descripción Weibull (b ^-1), solo el extracto acuoso de A. gaumeri T2 (0.017 unidad día^-1) redujo significativamente el progreso de la enfermedad (Cuadro 1) (Figura 3).

En las variables de crecimiento del cultivo evaluadas: número de botones y diámetro del racimo, los tratamientos que incluyeron a los extractos y al fungicida sintético, mejoraron significativamente estas variables (p ≤ 0.01) (Cuadro 2).

Discusión

Las enfermedades causadas por hongos afectan severamente la industria del crisantemo (^{Borah et al., 2019}; ^{Trolinger et al., 2018}). En este trabajo se identificó a A. chrysanthemi como agente causal del tizón foliar del crisantemo en México. Esta especie se ha reportado en crisantemo en otros países como Australia, EE.UU., Holanda e India (^{Sobers, 1965}). En México, ^{Domínguez-Serrano et al. (2016}) reportaron a las especies A. alternata (KF728748, KF728750) y A. tenuissima (KF728749, KF728751) como agentes causales del tizón en crisantemo, cuyos análisis morfológico y molecular no coinciden con la cepa aislada en este estudio. El alineamiento con las secuencias previamente reportadas de A. alternata (KF728748, KF728750) y A. tenuissima (KF728749, KF728751) presentan dos y tres nucleótidos diferentes con la cepa CICY004. Es importante mencionar que Domínguez-Serrano et al. (2016) encontraron una sola diferencia en la región que estudiaron (540 nucleótidos) de los ITS de A. alternata y A. tenuissima; una sola inserción de un nucleótido “T” en la secuencia de la segunda y ausente en A. alternata, mientras lo demás fue idéntico. Esta diferencia fue aceptada como criterio para distinguir ambas especies, ya que los autores secuenciaron 5 veces cada especie y esa diferencia fue reproducible.

En el presente trabajo las diferencias encontradas entre CICY004, A. alternata y A. tenuissima también fueron pocas, y estas diferencias aceptadas ya que la secuencia de CICY004 corresponde a una secuencia consenso, confirmada al 100% con las secuencias de la hebra sentido y de la hebra antisentido. Estas diferencias nucleotídicas son informativas, y diferencian a CICY004 de A. alternata y A. tenuissima, y también de A. eichhorniae. La morfología reveló que se trata de A. chrysanthemi, por lo que este es el primer reporte de la secuencia ITS de este fitopatógeno, ya que previamente no existía en el GenBank o en el RDP. Este estudio ahora permite ser referencia de futuras investigaciones sobre A. chrysanthemi como agente causal del tizón foliar en crisantemo.

En el control del tizón foliar, ambos extractos acuosos de A. gaumeri y de B. flammea y el Fungicida Captan^® mostraron el mismo efecto, para detener el progreso de la enfermedad y mejoraron lo reportado por ^{Kumar et al. (2017}) cuando evaluó extracto de ajo (efectividad 36.64%) en el mismo cultivo. También, los extractos acuosos de A. gaumeri y de B. flammea, mostraron un mayor efecto, en comparación con extractos acuosos de Eucalyptus globolus y Ocimum sanctum al 5% contra el tizón temprano de la papa (20.83 y 25.37%) (^{Debbarma et al., 2017}). Estos resultados indicaron que los extractos de A. gaumeri y de B. flammea al 3% son capaces de reducir la severidad causada por A. chrysanthemi, y se confirmó lo previamente reportando en las pruebas in vitro contra este patógeno (^{Vargas-Díaz et al., 2014}).

En los parámetros ABCPE y Y_final, ambos extractos resultaron igual de efectivos para reducir la severidad que el fungicida Captan^®. Un estudio, ^{Ortega-Centeno et al. (2010}) reportaron con extractos de coliflor, brócoli y rábanos (Brassicaceae), misma efectividad de control con fungicidas sintéticos (captan, amistar y manzate) contra Uromyces transversalis causante de la roya en gladio.

Las plantas A. gaumeri y B. flammea son consideradas endémica de la Península de Yucatán, lo que significa poca información sobre sus propiedades fitoquímicas y biológicas (^{Hernández-Bolio et al., 2019}). A. gaumeri es una planta en la que existen pocos reportes de su actividad antifúngica (^{Gamboa-Angulo et al., 2008}; ^{Vargas-Díaz et al., 2014}). En el género se han reportado familias químicas, que de acuerdo con el disolvente utilizado están presentes: terpenos, esteroides, taninos, saponinas alcaloides, antocianinas, policétidos y flavonoides principalmente responsables de actividades antifúngicas (^{Adesina et al., 2000}; ^{Gutierrez-Lugo et al., 2002}; ^{Hungeling et al., 2009}; ^{Seebaluck et al., 2015}).

En cuanto a B. flammea,^{García-Sosa et al. (2011}), a partir de extractos metanólicos de raíces, reportaron efecto inhibitorio contra C. gloeosporioides. ^{Sánchez-Medina et al. (2010}) identificaron la presencia de una sakurososaponina a partir del residuo acuoso procedente de la partición líquido-líquido del extracto, con actividad citotóxica y contra C. gloeosporioides. La sakurososaponina es uno de los principales metabolitos responsables de actividad antifúngica de B. flammea, y se sabe que tiene la habilidad de formar complejos con esteroles de la membrana celular, lo que causa una pérdida en la integridad de la misma y la muerte del hongo (^{Morrissey y Osbourn, 1999}).

En el cultivo de ornamentales se considera que el daño estético en follaje y flores causado por fitopatógenos es de vital importancia, ya que merman la calidad, la vida de anaquel y el precio de su comercialización (^{Barrera-Necha y Bautista-Baños, 2016}). La disminución de la intensidad de la enfermedad mediante las aplicaciones de los extractos y el fungicida, permitieron mayor número de botones y diámetro del racimo, con diferencia significativa al control negativo, lo que es fundamental para obtener mayores rendimientos en la producción de crisantemo (^{Kumar et al., 2011}).

Además de su obtención fácil para aplicarse en campo por productores, los extractos acuosos son ambientalmente más seguros en comparación con otros métodos de extracción con disolventes, Esto representa un paso importante en el desarrollo de plaguicidas amigables con el ambiente a base de plantas. Este estudio es el inicio de futuras investigaciones que contribuye a plantear estrategias de control de enfermedades en el cultivo sustentable del crisantemo.

Conclusiones

Se identificó a Alternaria chrysanthemi como el agente causal del tizón foliar en crisantemo. Los extractos acuosos de raíz de A. gaumeri y corteza de B. flammea fueron igual de efectivos que el fungicida Captan® para controlar la enfermedad del tizón foliar bajo condiciones de campo.