Sitios de muestreo

Los aislados de B. cinerea se recolectaron de frutos de fresa y hojas con síntomas de moho gris en las hojas en el Valle Maravatío (19° 52’ 44.2092’’ N, 100° 24’ 29.595’ ’W) y Zamora-Jacona (19° 59’ 9.0168’’ N, 102° 18’ 58.9608’’ W) durante el ciclo de cultivo de 2009 y 2010.

Aislados monospóricos

Trozos pequeños de tejidos enfermos de los frutos de fresa fueron desinfestados con una solución de hipoclorito de sodio al 2 % por 2 min, enjuagados con agua destilada estéril, secados en la campana por 10 minutos y colocados en placas de Petri que contenía medio de cultivo PDA (Difco Lab. Sparks, MD, USA). Las placas se incubaron bajo luz fluorescente por 5 d a temperatura del laboratorio (22±2 °C) para promover la esporulación. A partir de cultivos esporulados se preparó una suspensión de 1x10³ conidios mL^-1 y 0.1 mL de suspensión se colocó en placas de Petri con medio de agua agar (2 %) e incubado a temperatura del laboratorio por 6 h. Después, los conidios germinados fueron aislados y colocados individualmente en placas de Petri con medio PDA. Una vez que los cultivos llenaron las placas, se conservaron a 4 °C para su uso en las pruebas de sensibilidad. Se obtuvieron 62 aislados monospóricos (Cuadro 1).

Cuadro 1 Aislados de Botrytis cinérea de dos regiones productoras de fresa em Michoacán, México, cuyoa sensibilidad a los fungicidas iprodiona y metil-tiofanato fue determinada en el ciclo 2009-2010 

Identificación morfológica y filogenética

La identificación preliminar de los aislados se realizó con base a color de colonia, morfología de conidios y conidiofóros (^{Elad et al., 2007}). Para confirmar la identificación, ocho aislados, seleccionados al azar, se obtuvieron de las recolectas de campo enlistados en el Cuadro 1 (Z7A-1-3, Z7A, Z16C-2-3, Z14A, Z14A-2, Y-1, Z7C y Z7C-2) y se crecieron los aislados en PDA a temperatura del laboratorio (222 °C) por 7 d. La identificación filogenética se realizó a través de la amplificación por PCR de la región ITS de ADN ribosomal, usando los iniciadores ITS4 and ITS5 (^{White et al., 1990}). Una micro pipeta se usó para colocar una porción de micelio de cada aislado en tubos de Eppendorf con 30 µL de una solución de lisis desarrollada en el Colegio de Posgraduados (Silva-Rojas, comunicación personal, 2009). Los tubos se colocaron en un termociclador, Peltier Thermal Cycler PTC 200 (Bio-Rad, USA), a 95 °C por 5 min y centrifugados a 12 000 g por 5 min. En tubos nuevos, 45 µL de agua HPLC para PCR y 5 µL de sobrenadante se centrifugaron por 2 min. De esta solución, 5 µL de cada solución de ADN de cada aislado se usó como ADN molde. La mezcla de reacción se preparó en un volumen final de 25 µL 2 U de ADN of Taq polimerasa, 10X buffer Taq ADN 10 pM de cada iniciador y 200 mM de dNTPs (Promega, USA). El programa de amplificación fue así: un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C por 4 min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 2 min, un ciclo a 56 °C por 1 min y 72 °C por 2 min; y un ciclo de extensión final a 72 °C por 7 min.

Los productos de PCR se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % con 1X TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA) corrido a 87 V cm^-1 por 1 h. Este gel se tiño con bromuro de etidio y las bandas se visualizaron en el sistema de documentación Infinity 1000/26MX Xpress (Vilber Lourmat, Germany). Antes de secuenciar, los productos de PCR se purificaron con ExoSAP-IT (Affymetrix, USA), según las instrucciones del fabricante. La reacción de secuenciación se preparó usando Big Dye Terminator v3.0 (Applied Biosystems, USA), y los fragmentos se resolvieron por electroforesis capilar en un analizador Genetico de DNA Modelo 3730 (Applied Biosystems, USA). Las regiones correspondientes a ambas secuencias fueron ensambladas y editadas con el software BIOEDIT v7.2.0 (^{Hall, 1999}). Las secuencias de consenso de cada aislado se compararon con las de la base de datos GenBank, NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), con la opción BLASTN 2.2.19 (^{Zhang et al., 2000}).

Fungicidas

Como fuente de ingrediente activo de metil-tiofanato e iprodiona se usaron los fungicidas Cercobin M^® (79 % de ingrediente activo, BASF Mexicana, Zapopan, Jalisco, Mexico) y Rovral 50 PH^® (50 % ingredient activa, Bayer Crop Science en Mexico, DF), respectivamente.

Pruebas de inhibición de crecimiento de micelial

El medio de cultivo PDA se preparó y mantuvo en baño de María a 60 °C hasta su uso. Por separado se preparó una solución madre de 10 000 µg mL^-1 IA de cada fungicida y se hicieron diluciones seriales de 1:10, 1:100 and 1:1000 en frascos estériles de 250 mL. La proporción apropiada de cada una de estas diluciones se mezcló con el medio PDA para obtener las concentraciones finales del fungicida: 0, 0.1, 0.5, 1, 10, 50 y 100 µg mL^-1 para iprodiona, y 0, 0.1,1, 0,100, 1000 y 2000 µg mL^-1 de IA para metil-tiofanato. Aproximadamente 10 mL de los medios enmedadados con el fungicida se vertieron en placas de Petri de 60 x 0.5 mm.

Desde los márgenes de las colonias de 5 d, discos de micelio de 0.5 cm en diámetro se colocaron en el centro de cuatro placas de Petri de 6 cm que contenían medio de cultivo enmendado con los fungicidas. Estas placas se sellaron con Parafilm^®, colocadas en bolsas de Ziploc^® e incubadas en la oscuridad a temperatura del laboratorio (22 ±2 °C) por 72 h. Después se midió el diámetro de las colonias en dos direcciones para cada una de las dosis probadas y promediadas. La mediana del crecimiento de micelio (mm) de cada aislado probado en las cuatro repeticiones se tomó y se usó para calcular el crecimiento relativo en relación a la mediana de crecimiento de micelio en las placas no adicionadas con fungicidas por cada una de las concentraciones. Los medios de crecimiento de micelio se usaron para estimar la dosis efectiva de 50 (CE₅₀). La prueba se realizó dos veces.

Pruebas de inhibición de la germinación conidial

Las mismas concentraciones de fungicida usadas para las pruebas de crecimiento de micelio se evaluaron en el medio de agua de agar. Colonias de 8 a 10 d de cultivo se usaron para preparar una suspensión conidial (1x10³ conidios mL^-1) en destilada estéril. De esta suspensión, 0.1 mL se colocó en una placa de Petri con el medio de cultivo + fungicida para cada concentración e incubado en la oscuridad por 14 h. Después se contaron los números de conidios germinados y no germinados en una muestra de 100 conidios en el campo visual del microscopio (Carl Zeiss, Germany) con magnificación de 40x para cada concentración. Un conidio se consideró germinado cuando el largo del tubo de germinativo fue igual o mayor que tres veces su ancho (^{Yourman and Jeffers, 1999}). Tal como en las pruebas de crecimiento micelial, se usaron cuatro repeticiones para cada dosis de la combinación de fungicida-aislado. Con estos datos, calculó la germinación conidial relativa a las placas no enmendadas con fungicida. La prueba se realizó dos veces.

Análisis de datos

Con estos datos se estimó la dosis efectiva que inhibió el 50 % (CE₅₀) de crecimiento de micelio o la germinación conidial ajustando a los datos el modelo log-logístico con asíntota superior usando el procedimiento NLMIXED SAS (ver. 9.2) para cado uno de los aislados probados. El modelo se expresa así:

donde “y” es el crecimiento relativo de micelio o germinación conidial, α es la asíntota superior (valor más alto posible de y), β es la pendiente de la curva en el punto de inflexión, y CE_5O es la dosis a la cual el crecimiento relativo/germinación conidial se reduce en 50 % (^{Schanbenberger and Pierce, 2002}; ^{Rebollar-Alviter et al., 2007}). Este modelo es una re-parametrización del modelo log-logístico en términos de CE_5O (^{Schanbenberger and Pierce, 2002}). Los valores de inicio de los parámetros en las iteraciones se asignaron arbitrariamente. Puesto que no todos los valores de inicio resultaron en convergencia para cada aislado, diferentes grupos de valores fueron usados para lograr convergencia. El patrón de residuales sirvió como un indicador de la bondad de ajuste del modelo (^{Rebollar-Alviter et al., 2007}).

Distribución de la sensibilidad

Diagramas de caja e histogramas de los valores de CE₅₀ se usaron para ilustrar la distribución de la sensibilidad del crecimiento de micelio y germinación conidial. Los momentos estimados y pruebas de normalidad se obtuvieron con el Procedimiento Univariate de SAS (ver. 9.2). Los datos fueron diagnosticados para verificar la presencia de valores atípicos en la distribución. Se aplicó la transformación log10 a los datos para lograr la normalidad donde posible. Si después de hacer la transformación, los datos no se ajustaban a una distribución normal, se eliminaron valores extremos para estimar los parámetros de interés, pero se mantuvieron para ilustrar la distribución.

Para determinar cualquier diferencia significativa entre la sensibilidad de aislados de las dos áreas de muestreo, la distribución de la sensibilidad en conidios y micelio de cada fungicida en cada región de estudio se evaluó comparando la distribución de las CE_5O usando la prueba de Kolmogorov-Smirnov para dos poblaciones con el Procedimiento NPAR1WAY de SAS (ver. 9.2).

Identificación morfológica y filogenética

Las muestras usadas para la identificación de los aislados de las dos regiones productoras de fresas en Michoacán correspondieron a B. cinerea. Las secuencias de la amplificación de productos en la región ITS de ADN ribosómico de ocho asilados obtenido por PCR, mostraron un 100 % de identidad con las secuencias en GenBank (accessions EU128648 and EU128649).

Sensibilidad de Botrytis cinerea a iprodiona

La distribución de la sensibilidad de micelio a iprodiona fue bimodal (Figura 1A) y no se ajustó a una distribución normal después de la transformación a Log₁₀ , variando de 3 µg mL^-1 a 0.21 µg mL^-1 con una mediana de 0.74 µg mL^-1, mientras que en conidios varió de 0.47 µg mL^-1 a 22.59 µg mL^-1 con una mediana de 3.73 µg mL^-1, similar a los resultados reportado por ^{Chen et al. (2011)}. Sin embargo, para determinar si la sensibilidad en las dos áreas de estudio fue diferente dado el comportamiento bimodal, los conjuntos de datos fueron analizados por separado. Las comparaciones estadísticas por la prueba de Kolmogorov-Smirnov para 2 muestras de las distribuciones de sensibilidad del micelio en B. cinerea en ambas regiones de estudio, indicó diferencias significativas (p≤0.001, Ks=3.44) entre los valles Zamora-Jacona y Maravatío. En cambio, las distribuciones de la sensibilidad en conidios para ambas áreas de muestreo fueron normales (Log10 CE_5O) y no mostraron ninguna diferencia significativa (Figura 1B). Por lo tanto, los datos de las dos áreas fueron analizados en conjunto. La sensibilidad de micelio de los aislados del Valle de Maravatío varió de 0.23 a 0.89 µg mL^-1 con una mediana de 0.35 µg mL^-1, mientras la sensibilidad de aquellos del Valle de Zamora-Jacona varió de 0.22 µg mL^-1 a 3.0 µg mL^-1 con una mediana de 1.5 µg mL^-1, el cual indica que el último fue casi 5 veces menos sensible que los del Valle Maravatío. ^{Myresiotis (2007)} obtuvo una CE₅₀ en el rango de 0.1 a 1.42 µg mL^-1 y se consideró resistentes aquellos asislados con una CE₅₀ ≥1 µg mL^-1. ^{Banno et al. (2008)} reportaron como susceptibles los aislados con una CE₅₀< 0.4 µg mL^-1 y reportó diferentes grados de resistencia asociados con mutaciones diferentes en los aislados con un CE₅₀ > 0.4 µg mL^-1. Grabke et al. (2013) usó dosis discriminatorias de 5 y 50 µg mL^-1 para detectar aquellos aislados altamente susceptibles, susceptibles, moderadamente resistentes y altamente resistente, según lo evaluado usando la longitud del tubo germinativo de conidios. Los aislados con bajos niveles de resistencia fueron los más frecuentes se asociaron principalmente con las mutaciones I365S y I365N del gen bos1. Con base en los estudios de ^{Banno et al. (2008)} realizados en micelio, 46 % de los aislados del Valle de Maravatío y 94 % de los del Valle de Zamora-Jacona serían considerados resistentes a iprodiona. Sin embargo, no se realizó ningún estudio de genotipificación para confirmar la presencia de mutaciones de punto específico.

Figura 1 Distribución de la sensibilidad (log₁₀ CE₅₀) de aislados de B. cinerea (N=62) de dos áreas productoras de fresa en Michoacán, México. A) Distribución de la sensibilidad a iprodiona basada en micelio, B) distribución de la sensibilidad a iprodiona basada en germinación de conidios, C) distribución de la sensibilidad a metil-tiofanato basada en crecimiento de micelio, y D) distribución de sensibilidad a metil-tiofanato basada en germinación conidial. 

La distribución de la sensibilidad de B. cinerea a iprodiona en el ensayo de germinación conidial mostró una distribución amplia de valores de CE₅₀. La sensibilidad varió de 0.47 a 22.60 µg mL^-1. ^{Grabke et al. (2013)} y ^{Amiri et al. (2013)} consideraron que los aislados fueron moderadamente resistente a resistente si crecieron a concentraciones de iprodiona superiores a 5 µg mL^-1 (CE5O>5 µg mL^.1). Con base en estos resultados, 45 % de estos aislados de ambas áreas de estudio tienen algún grado de resistencia, mientras 53 % de los aislados del Valle de Zamora-Jacona excedieron la dosis discriminatoria indicada, confirmando que los aislados de esta área tienden a ser más tolerantes a los fungicidas probados, basado en los bioensayos de conidios y micelio.

Los aislados del Valle de Zamora-Jacona fueron menos susceptibles a iprodiona que aquellos del Valle de Maravatío. Estos resultados se pueden explicar parcialmente por el avance tecnológico de ambas áreas, los cual puede estar relacionado no solo al número de aplicaciones de fungicidas por ciclo (15 a 20) sino también a los aspectos biológicos intrínsecos de las poblaciones de patógenos en esa área. En contraste, el Valle de Maravatío es un área de baja tecnología poco desarrollada y sin asistencia técnicas continua para los productores de fresa, quienes cultivan principalmente para mercados nacionales y locales. Bajo estas condiciones, es probable que los patógenos estén sujetos a menos presión de selección que bajo las condiciones del Valle de Zamora-Jacona.

Sensibilidad de Botrytis cinerea a metil-tiofanato

La distribución de la sensibilidad de B. cinerea basada en crecimiento de micelio fue claramente bimodal (Figura 1C), separando las dos áreas de estudio con la frecuencia más alta de aislados a cada lado de la distribución (Figura 2C). En cambio, la distribución de sensibilidad basada en germinación conidial se ajustó a una distribución normal, considerando ambas áreas de estudio. Los datos de la comparación entre las distribuciones de sensibilidad de micelio a metil-tiofanato entre las dos áreas de estudio indicaron que estas áreas fueron significativamente diferentes (p≤0.002, Ks=1.86) y que la mediana de la CE_5O del Valle de Zamora-Jacona fue casi 667 veces mayor que la del Valle de Maravatío. Sin embargo, no hubo ninguna diferencia significativa (p=0.13, Ks=1.17) entre las distribuciones de sensibilidad de conidios, aunque la mediana fue 9 veces más alta que en el Valle de Zamora-Jacona, en parte indicando la falta de correlación entre las sensibilidades basados en conidia y micelio en este grupo de fungicidas. El crecimiento micelial muestra más sensibilidad a fungicidas de benzimidazoa que la germinación de conidios (^{Leroux, 2007}).

Figura 2 Distribución de la sensibilidad de aislados de Botrytis cinerea de dos áreas productoras de fresa (1. Valle de Maravatío, n= 30; 2. Valle Zamora-Jacona, n=32) en Michoacán, México. A) Distribución de la sensibilidad de micelio a Iprodiona, B) distribución de la sensibilidad de conidios a iprodiona, C) Distribución de la sensibilidad de micelio a metil-tiofanato, y D) Distribución de la sensibilidad de conidios a metil-tiofanato. En cada figura se muestra el valor-p y el estadístico de prueba de Kolmogorov-Smirnov para dos dos muestras independientes. 

Debido a la forma bimodal del histograma, se realizó un análisis basado en micelio para ambas áreas de muestreo por separado. La distribución de la sensibilidad a micelio de aislados del Valle de Maravatío fue dispersa (Figura 2C) con valores de CE₅₀ que variaron de 0.11 to > 2000 µg mL^-1 con una mediana de 3.11 µg mL^-1. La distribución no fue normal, aun después de la eliminación de valores atípicos y después de la transformación a log10. La distribución de los aislados del Valle de Zamora-Jacona también fue dispersa con valores CE₅₀ variando de 0.82 to > 2000 µg mL^-1 con una mediana de 2000 µg mL^-1 sin ajustar a la distribución normal después de la transformación de log10.

La distribución de valores conidiales CE₅₀, considerando los aislados de las áreas de muestreo, varió de 0.01 a más que 2000 µg mL^-1 con una mediana de 2.01 µg mL^-1. En el Valle de Maravatío, la distribución varió de 0.02 a 892 µg mL^-1 con un mediana de 1.13 µg mL^-1, mientras en el Valle de Zamora-Jacona, los valores fueron más dispersos, en un rango de 0.01 a 2000 µg mL^-1 con una mediana de 9.7 µg mL^-1, el cual fue 9 veces más que la mediana de la CE₅₀ de los aislados del Valle de Maravatío. En ambas pruebas de conidios y micelio, los valores de la CE₅₀ de los aislados del Valle de Zamora-Jacona excedieron los de los aislados del Valle de Maravatío.

Los datos indican un alto nivel de resistencia de B. cinerea a metil-tiofanato en ambas áreas productoras de fresa, pero esta resistencia fue significativamente más alta en los aislados del Valle de Zamora-Jacona que en los aislados del Valle de Maravatío. En ambas áreas es común el uso de fungicidas benzimidazoles, especialmente tiabendazol, benomil y metil-tiofanato basado en el calendario.

Estudios que definen la línea base de sensibilidad de micelio en B. cinerea mostraron que aislados con valores de CE₅₀ superiores a 50 µg mL^-1 son resistentes (^{Luck and Guilling, 1995}; ^{LaMondia and Douglas, 1997}; ^{Yourman and Jeffers, 1999}). Con base en este criterio, 81% de los aislados del Valle de Zamora-Jacona fueron resistentes, mientras 34 % de los aislados del Valle de Maravatío terminaron en esta categoría. Con una dosis discriminatoria de 50 µg mL^-1, ^{Mercier et al. (2010)} encontraron que 92 % de los aislados fueron resistentes a metil-tiofanato en campos de fresa en Oxnard, California. Basado en estudios de elongación del tubo germinativo en conidios, ^{Weber y Hahn (2011)} consideraron que los aislados fueron moderadamente resistentes con un CE₅₀ de 4.67 a 16.1 µg mL^-1 y resistentes con un CE₅₀ mayores a 28 µg mL^-1. ^{Fernández-Ortuño and Shnabel (2012)}, aplicaron una dosis discriminatoria de 100 µg mL^-1, y encontraron que 85 % de aislados de fresa de Carolina Sur fueron resistentes a tiofanato-metil, similar a los resultados de nuestro estudio. Todos los aislados caracterizados por ^{Fernández-Ortuño y Shnabel (2012)} como resistentes, expresaron la mutación puntual de E198A (cambio de alanina a glutamato en la posición 198).

Los fungicidas Benzimidazoles tienen un mayor efecto en crecimiento de micelio que en la germinación conidial, asociadas con la distorsión de tubos germinativos, el cual es un indicador de la disrupción de microtúbulos celulares (^{Davidse and Ishii, 1995}; ^{Leroux, 2007}). Es probable que estas mutaciones tengan amplia distribución en ambas áreas examinadas en México, pero aún no se han realizado estudios de genotipificación.

Nuestros datos revelan la existencia de poblaciones de B. cinerea resistentes a fungicidas dicarboximidas y benzimidazoles en dos de las áreas más importantes para la producción de fresa en México, tienen condiciones socioeconómicas y tecnológicas contrastantes. Los datos de estudios de sensibilidad en ambas áreas de muestreo indicaron que los aislados del Valle de Zamora-Jacona tuvieron la frecuencia de resistencia más alta a ambas fungicidas, en especial a metil-tiofanato.