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Agrociencia
versão On-line ISSN 2521-9766versão impressa ISSN 1405-3195
Agrociencia vol.50 no.8 Texcoco Nov./Dez. 2016
Biotecnología
Microtécnica de enriquecimiento y extracción de ADN de cloroplastos y mitocondrias
1 Fruticultura, Instituto de Recursos Genéticos y Productividad, Colegio de Postgraduados. Km. 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México, México.
2 Genética, Instituto de Recursos Genéticos y Productividad, Colegio de Postgraduados. Km. 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México, México.
3 Fisiología Vegetal, Instituto de Recursos Genéticos y Productividad, Colegio de Postgraduados. Km. 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México, México. (vagh@colpos.mx).
4 Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo, Km. 38.5 Carr. México-Texcoco. 56235. Chapingo, Estado de México, México.
Los protocolos publicados para enriquecimiento de ADN de cloroplasto y mitocondrial están basados en muestras grandes (más de 5 g) que implican costos altos y abundante material de muestra. La reducción en cantidades de muestra de tejido y de reactivos es posible y conveniente. Esta investigación describe una microtécnica eficiente para enriquecimiento y extracción de ADN de cloroplasto y mitocondria desde muestras de 500 mg de pericarpio de frutos de chile Manzano (Capsicum pubescens R. & P.). La eficiencia de la extracción en muestras de fruto fresco fue 20 µg ADN g-1 para cloroplastos, y 33 µg g-1 ADN de mitocondrias. El aislamiento con la microtécnica recomendada redujo costos en 160x para cloroplastos y hasta 8x para mitocondrias. La amplificación por PCR de los genes marcadores de referencia de cloroplasto (rbcL, subunidad grande de la Rubisco) y mitocondria (cox1, citocromo oxidasa) confirmó la identidad de ADN de cada extracción.
Palabras clave: Capsicum pubescens; ADN de cloroplasto; ADN de mitocondria; extracción de ADN
Published protocols for chloroplast and mitochondrial DNA enrichment are based on large samples (more than 5 g) which imply high costs and plenty of sample material. Reduction of tissue sample and reagent quantities is possible and convenient. This work describes an efficient miniprep for chloroplast and mitochondria DNA enrichment and extraction from 500 mg of pericarp samples of Manzano chili fruits (Capsicum pubescens R. & P.). Extraction efficiency from fresh fruit samples was 20 µg DNA g-1 for choloroplasts and 33 µg DNA g-1 for mitochondria. Isolation using the recommended miniprep resulted in costs reduction of 160x for chloroplast and up to 8x for mitochondria. PCR amplification of reference marker genes for chloroplast (rbcL, Rubisco large subunit) and mitochondria (cox1, Cytochrome oxidase) confirmed DNA identity of each extraction.
Keywords: Capsicum pubescens; chloroplast DNA; mitochondria DNA; DNA extraction
Introducción
El análisis de ADN de cloroplastos (cpADN) y mitocondrias (mtADN) puede revelar información sobre procesos evolutivos mediante análisis filogenéticos usando patrones de herencia uniparental y secuencias génicas conservadas a través de generaciones (Ravi et al., 2008; Jo et al., 2011). También puede describir la composición y organización de la información genética dentro de cloroplastos y mitocondrias (Kahlau et al., 2006), y proporcionar la función, orden y secuencia de los genes (Sugiyama et al. 2005; Kahlau et al., 2006). En este sentido, en nuestro laboratorio hemos identificado dos componentes genéticos importantes que modifican significativamente la expresión del picor del chile Manzano (Capsicum pubescens R. y P.). Primero Cruz et al. (2007) mostraron la existencia de heterosis en el picor de este chile, y después mediante técnicas convencionales de mejoramiento Sánchez et al. (2010) mostraron efectos de herencia materna en el picor del fruto. Para confirmar los efectos de la herencia materna en el picor del chile Manzano por un método más preciso, se debe extraer y analizar ADN de cloroplastos y mitocondrias en muchos frutos de este chile. El análisis molecular descendente requiere el aislamiento o enriquecimiento de organelos intactos en forma confiable, precisa y repetible.
Hay estudios acerca del aislamiento y extracción de ADN de cloroplastos y mitocondrias (Douce et al., 1987; Mourad y Polacco, 1988; Rahman y Huber, 1996; Triboush et al., 1998; Millar et al., 2001; Hajek et al., 2004; Jansen et al., 2005; Kahlau et al., 2006; Salvi et al., 2008; Lang et al., 2011; Rowan y Bendich, 2011). Esos métodos priorizaron la integridad estructural de organelos aislados y niveles bajos de contaminantes que aseguren ADN de alta calidad. Algunas estrategias se enfocaron en la intensidad y duración de la homogeneización (Hájek et al., 2004), así como el uso de reactivos de calidad para la extracción, lavado, purificación y lisis. Los amortiguadores adecuados mantienen la integridad del organelo al conservar la presión osmótica y pH adecuados cuando las células se rompen (Millar et al., 2007). Sin embargo, los protocolos de referencia recomiendan muestras de tejido vegetal fresco, desde decenas de gramos hasta kilogramos. Por ejemplo, Rahman y Huber (1996) usaron 100 g de pericarpio de fruto homogeneizado en 150 mL de amortiguador de extracción, Kahlau et al. (2006) usaron 50 g de hoja en 2 L, Shi et al. (2012) usaron 20 g de hoja en 400 mL y Vieira et al. (2014) usaron 25 g de hoja en 400 mL del amortiguador. Estas cantidades de muestra podrían ser difíciles de obtener y algunos protocolos abordan este problema mediante una serie de estrategias para no afectar el rendimiento o calidad del ADN. Mourad y Polacco (1989) usaron 10 g de hojas frescas en 10 volúmenes de amortiguador de extracción, y O’Hara y Capwell (1993) y Triboush et al. (1998) usaron 5 g de tejido en 20-25 mL de amortiguador.
La mayoría de los métodos que describen el aislamiento de organelos utilizan centrifugación en gradientes de densidad. Este tipo de purificación requiere centrifugación después de estratificar el homogeneizado celular en un gradiente de densidad creado por sacarosa viscosa, “percoll” o cloruro de cesio. La separación adecuada requiere ultra centrifugación para obtener una fracción concentrada del organelo (Millar et al., 2007). Los gradientes recomendados tienen deficiencias, como que la sacarosa pueda entrar a la matriz mitocondrial al utilizar un gradiente de sacarosa, lo cual dificulta el análisis proteómico (Nikaido y Rosenberg, 1983; Benz, 1994); y un gradiente de “percoll” en ocasiones es difícil de eliminar (Beavis y Vercesi, 1992; Yang y Mulligan, 1996).
Los protocolos más eficientes consumen altas cantidades de amortiguador, lo cual aumenta significativamente los costos cuando se procesan cientos de muestras, como en los estudios de genotipado. Nuestra investigación se basa en una microtécnica que reduce los costos y produce cloroplastos y mitocondrias intactos para la extracción de ADN en estudios de gran escala. La microtécnica aquí propuesta permite procesar muchas muestras, en este caso de chile Manzano, porque reduce los volúmenes de reactivos y usa equipos comunes de laboratorio.
Materiales y Métodos
Material vegetal
Las muestras para esta investigación provienen de líneas endogámicas de chile Manzano derivadas de mejoramiento y selección previa. Originalmente se cruzaron las variedades comerciales Zongolica y Puebla, y derivó una población F2 por autofecundación. De esta población F2 se seleccionaron dos individuos contrastantes en picor, y de ambos se derivó una línea mediante cinco ciclos de autofecundación. Las líneas resultantes se cruzaron en dos sentidos (i. e. L4×L6 y L6×L4), y se muestrearon las progenies F1. La descripción anterior muestra un experimento común de genotipificado que requiere analizar un número alto de individuos. Todas las plantas de chile Manzano se cultivaron en invernadero, de acuerdo con las técnicas de producción recomendadas por Pérez Grajales y Castro-Brindis (2008). Los frutos se muestrearon al principio de la maduración cuando el pericarpio cambia de color verde al amarillo. Los frutos cosechados se lavaron con jabón y enjuagaron con agua destilada. Una muestra de pericarpio de 500 mg se cortó en trozos pequeños.
Enriquecimiento de cloroplastos
El método propuesto en esta investigación se basa en el de Kahlau et al. (2006). El tejido se mantuvo en tubos de plástico de 2 mL en hielo, al que añadieron bolas de acero y 1 mL de amortiguador de extracción en frío (sorbitol 350 mM, TrisHCl 50 mM pH 8.0, EDTA 5 mM, β ME15mMy0.1%de BSA). El tejido se desbarató con un Tissuelyzer (QIAGENTM, Alemania), fijado a 30 hertz por 3.5 min. El homogeneizado se filtró a través de una malla de nailon (orificio de 0.25 mm) en un tubo de ensayo limpio de 2 mL; luego se desechó la malla y su contenido. Los restos de células y núcleos en el homogeneizado filtrado se centrifugaron 5 min a 500 xg a 4 °C. El sobrenadante se transfirió otra vez a un tubo de ensayo limpio de 2 mL y luego se utilizó para el enriquecimiento del cloroplasto. Todas las muestras y reactivos se mantuvieron en baño de hielo. El sobrenadante del paso anterior se centrifugó 10 min a 2000 xg a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se quitó con cuidado sin tocar el sedimento de cloroplastos en la parte inferior. El precipitado se disolvió y lavó en 500 µL de amortiguador para lavado frío (sorbitol 350 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0, EDTA 25 mM y 0.1 % de BSA). La suspensión se lavó y centrifugó dos veces a 2000 xg por 10 min a 4 °C, con remoción del sobrenadante después de cada centrifugación. La pastilla resultante se suspendió en 500 µL de amortiguador para lavado frío.
Para selectivamente enriquecer la suspensión de cloroplastos se usó el método de centrifugación del gradiente de densidad. El gradiente se construyó preparando dos soluciones de sacarosa grado molecular, 1.75 M y 1.08 M. La sacarosa necesaria se disolvió en los volúmenes adecuados de 50 mM Tris-HCl pH 8.0 y 25 mM EDTA pH 8.0. De la solución de sacarosa de 1.75 M se vertieron 700 µL en un nuevo tubo de 2 mL y luego 900 µL de solución de sacarosa de 1.08 M se colocó suavemente en la parte superior. De la suspensión de cloroplastos se colocaron 300 µL suave y lentamente en la parte superior del gradiente de sacarosa, una gota a la vez para evitar la mezcla. El tubo se cerró y centrifugó 1 h a 7000 xg a 4 °C. Después, un precipitado verde delgado se formó en la pared lateral del tubo de ensayo; esta lámina se recogió con cuidado usando una micropipeta y se colocó en un tubo nuevo. La pastilla se suspendió en tres volúmenes de amortiguador frío de dilución (sorbitol 175 mM, Tris-HCl 50 mM de pH 8.0, EDTA 25 mM). Al final, el tubo se centrifugó a 2000 xg por 10 min a 4 °C.
Enriquecimiento de mitocondrias
Nuestro protocolo se basa en el método de Rahman y Huber (1996) para aislar ADN mitocondrial y se agregaron unos pasos extras para mejorar la precipitación y extracción del ADN. El tejido se mantuvo en tubos de plástico de 2 mL en hielo. El tejido se desmenuzó con un Tissuelyzer (QIAGENTM, Alemania). En el tubo con la muestra de tejido se pusieron bolas de acero y 1 mL del amortiguador de extracción en frío (sacarosa 400 mM, Trizma base 50 mM, EDTA 1 mM, KH2PO4 10 mM, cisteína 4 mM y 1 % de BSA, pH 7.6). El Tissuelyzer se operó 3.5 min a 30 hertz y el homogeneizado se filtró en una malla de nailon (orificio de 0.25 mm) hacia un tubo de ensayo limpio de 2 mL; la malla de nailon y su contenido se desecharon. Los restos de células y núcleos en el homogeneizado se centrifugaron 5 min a 500 xg a 4 °C. El sobrenadante se transfirió con cuidado con una pipeta a un tubo de ensayo limpio de 2 mL y se centrifugó 10 min a 2000 xg a 4 °C para sedimentar y retirar los cloroplastos. Este paso se repitió dos veces. Después el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de ensayo y se centrifugó 10 min a 16 000 xg a 4 °C para obtener el precipitado de mitocondrias. Sin perturbar el sedimento del fondo, se eliminó el sobrenadante. La pastilla de las mitocondrias se disolvió en 500 µL de amortiguador de lavado frío (manitol 400 mM, KHP2O4 10 mM y 0.5 % de BSA, pH 7.2). La suspensión se centrifugó a 16 000 xg por 10 min a 4 °C; la fase de lavado se repitió una vez más, con remoción del sobrenadante después de cada centrifugación.
Para separar selectivamente las mitocondrias de otros orgánulos subcelulares se usó la centrifugación en gradiente de densidad. Dos soluciones de sacarosa a 0.6 y 1.8 M se prepararon mediante la disolución de sacarosa grado molecular en el volumen adecuado de Tris-HCl 50 mM pH 8.0 y KHP2O4 10 mM, pH 8.0. El gradiente se construyó en un tubo de ensayo de 2 mL al depositar 700 µL de sacarosa 1.8 M, seguido por la adición cuidadosa y lenta de 900 µL de sacarosa 0.6 M en la parte superior, sin mezclar, y se agregaron 300 µL de suspensión mitocondrial, una gota a la vez para evitar la mezcla. El tubo se centrifugó 1 h a 22 000 xg a 4 °C. Las mitocondrias se precipitaron en la pared lateral del tubo como una pastilla verde-amarillo. La fracción mitocondrial se recolectó con una micropipeta y se colocó en un nuevo tubo de ensayo. Tres volúmenes de amortiguador de dilución en frío (manitol 175 mM, KHP2O4 10 mM sin BSA, pH 7.2) se añadieron, y el tubo se centrifugó 30 min a 16 000 xg a 4 °C. Los pasos abreviados de ambas microtécnicas se muestran en la Figura 1.
Extracción de ADN
La pastilla obtenida del enriquecimiento de cloroplastos o mitocondrias se disolvió en 500 μL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 8.0, EDTA 20 mM, sal de sodio 2 % N-lauroilsarcosina). La mezcla se mantuvo 15 min a temperatura ambiente para promover la ruptura de organelos. Al final de la incubación se agregó 1 mL de solución de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). El tubo se sacudió en un vórtex y se centrifugó 10 min a 14000 xg a 4°C.El sobrenadante se recogió y mezcló otra vez con una solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). El ADN se precipitó con 2.5 volúmenes de etanol absoluto frío y se mantuvo a -20 °C en la noche. Al día siguiente los tubos se centrifugaron 10 min a 14 000 xg a 4 °C para obtener la pastilla de ADN. El sobrenadante se desechó y el etanol restante se evaporó a temperatura ambiente por 1 h. El precipitado de ADN se disolvió en 30 µL de amortiguador E a 0.1 M (Tris, pH 8.0 y EDTA 1 mM) y se mantuvo a temperatura ambiente por 1 h. La integridad del ADN se comprobó en un gel de agarosa 0.8 %, con 6 µL de muestra por pozo. Las condiciones de separación fueron 90 V y 400 mA por 90 min. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio a 10 % por 15 min y se fotografiaron con luz UV para su documentación. La calidad del ADN se determinó por absorbancia en un Nanodrop (Thermo ScientificTM, Mod. 2000, USA).
Confirmación de integridad y contaminación cruzada
El ADN extraído de las fracciones de cloroplasto y mitocondria se amplificó en un termociclador MaxygeneTM II (Axygen®, USA). Los iniciadores para los genes de referencia se diseñaron con base en información del Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Tres genes se seleccionaron por su ubicación exclusiva en el núcleo (GenBank accesión AY489050.1), cloroplasto (GenBank accesión AB586585.1) o las mitocondria (GenBank accesión EU701225.1) (Cuadro 1). Los iniciadores fueron diseñados según su secuencia de codificación (CDS) con criterios estándar del programa Primer3 v.4 (http://primer3.ut.ee/). La mezcla de reacción de PCR se hizo así: 40 ng de ADN, amortiguador 1x de PCR, MgCl2 2.5 mM, DNTP 0.2 mM y 20 pM de cada iniciador. El programa PCR operó así: 95 °C por 3 min, 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 40 s y 72 °C por 10 min. Al terminar la polimerización en cadena, 6 µL del producto de PCR se depositó en cada pozo, y la separación se hizo en un gel de agarosa a 1.2 % en TAE 1x; las condiciones de funcionamiento fueron 90 V y 150 180 mA por 90 min. El gel se tiñó con bromuro de etidio 10 % por 15 min. El tamaño de banda de PCR se calculó con el programa LabWorks®.
Cuadro 1 Iniciadores para genes de referencia del núcleo, cloroplasto y mitocondria.
| Gen | Location | Name | Sequence | ||
| Ubiquitina | Nucleus | CaUBIf | CTGGAAAGCAGCTTGAGGAC | CaUBIr | TGGCCTTAACGTTGTCGATT |
| Rubisco large subunitb | Chloroplast | CaRBCLf | TCACGCTGGTACCGTAGTAGG | CaRBCLr | CTCATTACCTTCCCGAGCAA |
| Cytochrome oxidasec | Mitochondria | SoCOX1f | TACCAGCCATTCTGGAGGAG | SoCOX1r | CTGCCAGTACCGGAAGTGAT |
Iniciador diseñado desde la secuencia de a Capsicum annum (GenBank accession AY489050.1), b Capsicum sp. (GenBank accession: AB586585.1) y c Solanum nigrum (GenBank accession EU701225.1) sequences.
Resultados y Discusión
Los pasos de la microtécnica para el enriquecimiento de cloroplastos y mitocondrias y la extracción de su ADN fueron reducidos con éxito hasta volúmenes iguales o inferiores a 2 mL. Los extractos de ADN de cloroplasto dieron contenidos promedios de 10.6 µg y una proporción media de absorbancias A260/A280 de 1.84, mientras que el contenido promedio de ADN mitocondrial fue 16.7 µg y la proporción media de absorbancias A260/A280 fue de 1.75. Estos valores muestran una mayor eficiencia para la extracción de ADN mitocondrial que para la extracción de DNA de cloroplasto (la diferencia de rendimiento promedio fue 12 µg ADN g-1 tejido fresco) (Cuadro 2). En geles de agarosa ambas muestras de ADN revelaron bandas claras y definidas sin barrido (Figura 2A).
Cuadro 2 Cantidad y calidad del ADN en cloroplastos y mitocondrias extraídos de 500 mg de pericarpio de frutos en maduración de chile Manzano (Capsicum pubescens R. y P.).
| Organelle | Sample | Average DNA quantity (µg) | Average A260/A280 | Average yield (µg DNA g-1 fresh tissue) |
| P1 | 9.09±0.02 | 1.89±0.02 | ||
| Chloroplast | P2 | 13.32±0.04 | 1.73±0.04 | 21.0±4.23 |
| H1 | 11.24±0.09 | 1.96±0.09 | ||
| H2 | 8.78±0.04 | 1.79±0.04 | ||
| P1 | 15.36±0.09 | 1.85±0.09 | ||
| P2 | 14.72±0.12 | 1.72±0.12 | ||
| Mitochondria | H1 | 15.19±0.16 | 1.76±0.14 | 33.4±6.41 |
| H2 | 21.48±0.06 | 1.69±0.06 |
N=3; ±desviación estándar; P1: línea endogámica 4; P2: línea endogámica 6; H1: híbrido 4×6; H2: híbrido 6×4.
Figura 2 Verificación de la integridad y pureza del ADN extraído de cloroplastos y mitocondrias aislados con el método propuesto, mediante amplificación por PCR de genes de referencia presentes solamente en el núcleo, el cloroplasto y la mitocondria. A) Prueba de integridad del ADN. B) Contaminación nuclear del ADN con el uso de ubiquitina (ubi) como marcador: T, ADN total; T+C, ADN total mezclado con ADN de cloroplasto; T+M, ADN total mezclado con el ADN mitocondrial. C) Contaminación del ADN nuclear, determinada por la presencia de UBI en ADN de cloroplasto y de mitocondria. D) Amplificación de la subunidad grande de la Rubisco (rbcL) y de citocromo oxidasa (cox1) en muestras de cloroplasto (C) y de mitocondrias (M). P 1 : línea endogámica 4, P 2 : línea endogámica 6, H 1 : híbrido 4×6, H2: híbrido 6×4; L: marcador de tamaño.
Los pasos de separación de tejido, homogenización de tejido y separación de organelos por centrifugación del gradiente de densidad en nuestra microtécnica son similares a otros métodos reportados. El aspecto distintivo de nuestro método es la gran reducción en cantidades de reactivos y tamaño de muestra; con eficiencia nosotros creamos un gradiente de sucrosa en tubos de 2 mL. Con base en O’Hara-Mais y Capwell (1993), el ADN extraido de cloroplasto y mitocondria con nuestra técnica mostró una calidad aceptable. Así, nuestras modificaciones a los protocolos citados para aislamiento de mitocondria y cloroplasto proporcionaron ADN de buena calidad.
Los rendimientos de ADN obtenidos con estas microtécnicas son mayores que los reportados por Mourad y Polacco (1988) para ADN de cloroplasto en maíz (0.1-0.2 µg DNA g-1 de tejido), y que los registrados por Triboush et al. (1988) en la extracción de ADN de organelos en girasol (5-10 µg de DNA g-1 tejido). Mientras que el protocolo de maíz usaba 1 kg de hoja, el método de girasol empleaba 5 a 10 g de hojas jóvenes como muestra del material vegetal. Nuestros resultados muestran usar cantidades mayores de muestra no necesariamente produce mejores rendimientos de ADN. Además, el ADN obtenido con nuestras microtécnicas tiene la calidad requerida para los análisis subsecuentes de ADN.
Comparado con el protocolo de Kahlau et al. (2006), nuestra microtécnica para cloroplasto usó 1 % de muestra de tejido, 0.05 % de amortiguador de extracción, 0.13 % de amortiguador de lavado y 40 % de amortiguador de dilución. Comparado con el protocolo de Rahman y Huber (1996), nuestra microtécnica mitocondrial usó 0.5 % de tejido, 0.66 % de amortiguador de extracción y 12.5 % de amortiguador de lavado por muestra (Cuadro 3). Como resultado, los costos de reactivos se redujeron hasta 160 veces al procesar 100 muestras de ADN de cloroplasto, y hasta 8 veces cuando la misma cantidad de muestra se usó para la extracción de ADN mitocondrial (Cuadro 3).
Cuadro 3 Comparación de reactivos y de costo total entre el método de referencia y el método propuesto en esta investigación.
| Organelle | Protocol | Starting tissue quantity (g) | Buffer quantity (mL) | Relative cost per 100 samples (USD) | |||
| Extraction | Wash | Dilution | Lysis | ||||
| Chloroplast | Kahlau et al. (2006) | 50 | 2000 | 400 | 5 | 5 | 1 |
| Miniprep | 0.5 | 1 | 1 | 2 | 0.5 | 0.0058 | |
| Rahman and Huber (1996) | 100 | 150 | 8 | - | - | 1 | |
| Mitochondria | Miniprep | 0.5 | 1 | 1 | 2 | 0.5 | 0.125 |
La amplificación por PCR de los genes de referencia en el ADN extraído de fracciones enriquecidas de organelos se empleó para identificar el nivel de contaminación cruzada procedente de fuentes nucleares. Los productos PCR de ubi, rbcL y cox1 coincidieron con el tamaño del fragmento esperado según el programa Primer3. La contaminación con ADN nuclear en los extractos de ADN de cloroplasto fue mínima, mientras que el extracto de ADN mitocondrial casi no mostró contaminación (Figura 2B-C). Sin embargo, como lo evidencia la amplificación por PCR de rbcL y cox1, en cada fracción enriquecida de organelo (Figura 2D) hay contaminación residual de cada tipo de organelo, pero la cantidad observada de ADN contaminante es claramente menor que el ADN obtenido del organelo enriquecido.
La contaminación cruzada también la reportaron Bathgate et al. (1985), Diekmann et al. (2008), Gillman et al. (2007), Jo et al. (2011), y Shi et al. (2012); se atribuye a la plasticidad en el tamaño de los organelos causada por los procesos frecuentes de fusión y división. Por ello es difícil obtener una separación absoluta de organelos mediante centrifugación de gradiente de densidad.
Conclusiones
Las microtécnicas propuestas en esta investigación para aislamiento de cloroplastos y mitocondrias resultaron confiables para la extracción de ADN y la amplificación por PCR. El tamaño de la muestra inicial se redujo grandemente. Estos métodos se evaluaron solo en muestras de chile Manzano, pero se requerirían pocas o ninguna modificación para enriquecer organelos de otras especies. Los métodos aquí descritos tienen varias ventajas sobre otros: reducción de costos y no se requiere el uso de proteinasa, “percoll” o cloruro de cesio, ni usar ultracentrífuga.
Literature Cited
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Recibido: Junio de 2015; Aprobado: Julio de 2016
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