Materiales y métodos

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología Agrícola del Centro de Investigación Tibaitatá de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria AGROSAVIA.

Microorganismo. Para determinar el efecto de los agroquímicos sobre el crecimiento micelial y la germinación de los conidios de T. koningiopsis Th003 se utilizaron cultivos del hongo con un crecimiento de siete y 10 días, obtenidos a partir de la siembra de un gránulo del bioplaguicida Tricotec^® WG en agar papa dextrosa (PDA) (Oxoid CM0139), mientras que para determinar el efecto de los coadyuvantes en el establecimiento del hongo en la filosfera se utilizó el bioplaguicida en su formato comercial.

Agroquímicos evaluados. Se evaluaron 27 fungicidas utilizados para los cultivos en los que Tricotec^® WG cuenta con registro de uso, 10 insecticidas y 7 coadyuvantes agrícolas, en la dosis de uso más alta reportada en la ficha técnica de cada agroquímico (Cuadros 1, 2 y 3).

Efecto de los agroquímicos sobre el crecimiento micelial de T. koningiopsis Th003. Se prepararon cajas Petri con agar Dextrosa Sabouraud (Scharlau 01-165-500) suplementado con cada agroquímico, como control se utilizó el mismo agar sin adición de agroquímicos. En el centro de cada caja se dispuso un disco de 5 mm de micelio de T. koningiopsis Th003 tomado del cultivo del hongo en PDA. Las cajas Petri se incubaron durante 120 horas a 25 °C y cumplido este tiempo se realizó la lectura del diámetro de las colonias. Con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de inhibición utilizando la formula: Inhibición (%) = ((X - Y) / X) x 100, donde X = es el diámetro de la colonia de T. koningiopsis Th003 en las cajas del control, Y = el diámetro de la colonia de T. koningiopsis Th003 en las cajas suplementadas con cada uno de los agroquímicos.

Efecto de los agroquímicos sobre la germinación de conidios T. koningiopsis Th003. De un cultivo del hongo en PDA se colectaron los conidios realizando una suspensión que se ajustó a una concentración de 1x10⁷ conidios mL^-1 mediante la técnica recuento en cámara de Neubauer. Posteriormente, se tomó 1 mL que se transfirió a matraces Erlenmeyers que contenían 20 mL de las soluciones de cada agroquímico según las dosis establecidas (Cuadros 1, 2 y 3). Como control se tuvieron los conidios del hongo suspendidos en agua. Las soluciones inoculadas se dejaron en reposo por una hora a 17 °C simulando el tiempo que podrían permanecer en un equipo de fumigación durante su aplicación. Posteriormente, de cada Erlenmeyer se tomaron 100 μL que se dispusieron en cajas Petri con agar agua, esparciéndolos sobre su superficie con un rastrillo Drigalsky. Las cajas se incubaron durante 24 horas a 25 °C y posterior a esto, se realizó la lectura del número de conidios germinados y no germinados mediante el conteo de 100 conidios en un cuadro de agar de 1 cm² tomando de cada caja tres cuadros. El porcentaje de germinación se determinó utilizando la fórmula: Germinación (%) = (Conidios germinados / Conidios totales) x 100. Se consideró como una espora germinada cuando la longitud del tubo germinativo fue de al menos el 50% de la longitud de la espora sin germinar (^{Muy-Rangel et al., 2018}).

Efecto de los coadyuvantes en el establecimiento de T. koningiopsis Th003 en la filosfera. Se prepararon suspensiones de Tricotec^® WG (a una concentración de 1x10⁶ conidios mL^-1) en soluciones de cada coadyuvante, dejándolas en reposo durante una hora, luego se aplicaron en plantas de uchuva (Physalis peruviana) de cinco meses de edad que se encontraban en un cultivo en campo. Como control se aplicó el bioplaguicida preparado en agua en la concentración descrita anteriormente. Siete días después, de las plantas se tomaron 10 hojas, empacándolas en bolsa de papel para su análisis en el laboratorio. Las hojas se cortaron en fragmentos de 1 cm² empleando un sacabocado de acero inoxidable estéril, se tomaron 10 g y se dispusieron en Erlenmeyers con 90 mL de Tween 80 al 0.1% (suspensión madre) dejándolos en agitación constante a 150 rpm durante una hora. Posteriormente, de cada uno se realizó una dilución 1:10, que se agitó en vórtex durante 30 segundos. De cada suspensión madre y dilución se tomaron 100 µL que se dispusieron en cajas Petri con agar Rosa de Bengala + cloranfenicol (Oxoid CM0549) (tres cajas por dilución), la alícuota se distribuyó de forma homogénea con un rastrillo Drigalsky. Las cajas se incubaron a 25 °C durante 5 días y posterior a este se contaron las unidades formadoras de colonia (UFC) expresando los resultados como Log (UFC g^-1).

Diseño experimental y análisis de datos. Los ensayos se establecieron bajo un diseño experimental completamente al azar. La unidad experimental (UE) correspondió a una caja Petri, teniendo 10 repeticiones para la evaluación del efecto de los agroquímicos sobre el crecimiento micelial y tres para la evaluación del efecto sobre germinación de los conidios. Los datos se sometieron a un análisis de varianza y las medias se compararon mediante una prueba LSD de Fisher (*= P>0.05) usando el software estadístico Statistix 10.0.

Resultados

Efecto de los agroquímicos sobre el crecimiento micelial de T. koningiopsis Th003. En presencia de Ciazofamida, Dimetomorf, Fenamidone - Fosetyl-Al, Fosetil - Propamocarb, Fluopicolide - Propamocarb, Hexaconazole, Mandipropamid y Propamocarb - Fenamidona, no se observó inhibición del crecimiento micelial, así como diferencias significativas entre estos fungicidas y el control (Figura 1).

Al exponer el hongo en presencia del medio con Flutriafol, Kasugamicina y Fenhexamid - Tebuconazol la inhibición de su crecimiento estuvo entre el 34 y 48%, mientras que al exponerse a Azoxistrobina - Difenoconazole, Dodine, Fluazinam, Fludioxonil - Ciprodinil, Pyrimethanil - Iprodione, Iminoctadine Tris (Albesilate), Himexazol, Propiconazole y Tebuconazole - Trifloxystrobin la inhibición del crecimiento micelial estuvo entre un 60 y 79% (Figura 1). Entre tanto, en presencia de Thiram - Pirimetanil, Procloraz, Tiabendazol, Spiroxamina y Triadimenol -Tebuconazole el crecimiento de T. koningiopsis Th003 fue inhibido totalmente (Figura 1).

Figura 1 Inhibición del crecimiento micelial de T. koningiopsis Th003 en agar Sabouraud suplementado con fungicidas. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

Con respecto a los insecticidas, solo en presencia de Beta-Cy­uthrin - lmidacloprid Permetrina (inhibición del 23%) y Malathion (inhibición del 44%) se observó reducción del crecimiento del hongo, siendo a su vez los únicos insecticidas que presentaron diferencias significativas con respecto al control (Figura 2).

Figura 2 Inhibición del crecimiento micelial de T. koningiopsis Th003 en agar Sabouraud suplementado con insecticidas. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

En cuanto a los coadyuvantes, Carrier® no inhibió el crecimiento micelial de T. koningiopsis Th003, mientras que los restantes lo hicieron entre un 44 y 70%, siendo en Fluyex^® donde se observó la mayor inhibición (Figura 3).

Figura 3 Inhibición del crecimiento micelial de T. koningiopsis Th003 en agar Sabouraud suplementado con coadyuvantes. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

Efecto de los agroquímicos sobre la germinación de los conidios de T. koningiopsis Th003. En presencia de Dodine, Metalaxil-M - Mancozeb y Thiram - Pirimetanil la germinación de los conidios fue inhibida totalmente, mientras que Iminoctadine Tris (Albesilate) solo la permitió en un 14% y Fluazinam y Plocloraz en un 63% (Figura 4). Entre tanto, en presencia de los demás fungicidas la germinación de los conidios fue ≥ 87%, 13 de ellos sin presentar diferencias significativas con respecto al control.

Figura 4 Germinación de conidios de T. koningiopsis Th003 en exposición a soluciones de fungicidas. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

En cuanto a los insecticidas, los conidios en presencia de Clorfenapir presentaron una germinación del 84%, menor a la obtenida con los demás insecticidas, en los cuales se obtuvieron germinaciones ≥ 97%, sin presentar diferencias significativas con respecto al control (Figura 5). Con respecto a los coadyuvantes, cinco de ellos presentaron diferencias significativas con respecto al control; no obstante, la germinación en presencia de todos ellos fue ≥ 93% (Figura 6).

Figura 5 Germinación de conidios de T. koningiopsis Th003 en exposición a soluciones de insecticidas. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

Figura 6 Germinación de conidios de T. koningiopsis Th003 en exposición a soluciones de coadyuvantes. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

Efecto de los coadyuvantes en el establecimiento de T. koningiopsis Th003 en la filosfera. Las mayores poblaciones de T. koningiopsis Th003 se recuperaron en los tratamientos correspondientes a Agrotin^® SL e HIPOTENSOR con medias de 3.5 y 3.3 log (UFC g^-1) respectivamente, presentando diferencias significativas con los demás tratamientos. El control presentó una media de 2.9 log (UFC g^-1) y junto a Fluyex^® e INEX-A^® con medias de 2.7 log (UFC g^-1) presentaron los menores valores para las poblaciones recuperadas del hongo (Figura 7).

Figura 7 Poblaciones de T. koningiopsis Th003 recuperadas de la filosfera de uchuva siete días después de la aspersión del bioplaguicida Tricotec ^® WG preparado en las suspensiones de los coadyuvantes. 

Discusión

Los fungicidas utilizados para el control de fitopatógenos oomicetos (Ciazofamida, Dimetomorf, Fenamidone - Fosetyl-Al, Fosetil - Propamocarb, Fluopicolide - Propamocarb, Hexaconazole, Mandipropamid, Propamocarb - Fenamidona) no afectaron el crecimiento micelial o la germinación de los conidios de T. koningiopsis Th003 (a excepción de Metalaxil-M - Mancozeb). Los oomicetos poseen una pared celular conformada por celulosa y sitosterol como lípido de membrana (^{Restrepo et al., 2016}) a diferencia de una pared con quitina y una membrana con ergosterol en los hongos (^{Gow et al., 2017}), siendo posible que, ya que algunos de estos fungicidas tienen un efecto negativo sobre la pared de los oomicetos, la ausencia de celulosa y sitosterol en T. koningiopsis Th003 pudo en parte ser la causa de que estos fungicidas no afectaran negativamente su crecimiento.

Entre tanto, los demás fungicidas, utilizados en el control de B. cinerea, Colletotrichum sp., Alternaria sp., Helminthosporium sp., o Rhizoctonia solani, inhibieron el crecimiento micelial, algunos incluso hasta en un 100%, mostrando un efecto tóxico de los principios activos; sin embargo, solo Dodine, Metalaxil-M - Mancozeb, Thiram - Pirimetanil e Iminoctadine Tris (Albesilate) afectaron la germinación de los conidios, hasta en un 100%, mientras que con el resto, la germinación no se afectó severamente, quizás por un efecto de tolerancia a los principios activos evaluados, fenómeno reportado para fungicidas como Azoxystrobin, Clorotalonil, Ciproconazol, Propineb y Tolclofos-metil en diferentes especies de Trichoderma (^{Escudero-Leyva et al., 2022}).

Agroquímicos como coadyuvantes e insecticidas, pueden estimular o inhibir el crecimiento micelial así como la germinación de conidios de hongos antagonistas (^{Rashid et al., 2012}; ^{Sain et al., 2022}), efectos dependen de las propiedades químicas del agroquímico, concentración de uso y de la biología del hongo, en este sentido estudios desarrollados por ^{Sabogal-Vargas et al. (2023)} demostraron que el insecticida clorpirifos en concentraciones de 960, 1.200 y 1.440 mg. L^-1 inhibía el crecimiento micelial de Trichoderma asperellum TCA3, T. asperellum TCA21 y Trichoderma harzianum TCA23 conforme su concentración aumentó, no obstante, la germinación de los conidios de T. asperellum TCA21 no se vio afectada, relacionando la inhibición de la germinación de los conidios en las otras cepas a una acumulación de auto - inhibidores de la germinación, que provocó en estos un estado de dormancia (^{Sabogal-Vargas et al., 2023}).

Para algunos insecticidas y coadyuvantes, el efecto inhibitorio se ha relacionado con la alteración de la carga electrostática de la superficie fúngica y la potencial eliminación de la capa mucosa que cubre los conidios, por la interrupción del metabolismo en la pared celular y su afecto en la permeabilidad de la membrana (^{Clifford y Hislop, 1975}; ^{Rashid et al., 2012}; ^{Fait el at., 2019}); lo que explicaría particularmente porque el crecimiento micelial se inhibió, pero no la germinación de los conidios. El principio activo del bioplaguicida son conidios del hongo y cuando se aplicaron en la filosfera suspendidos en las soluciones de los coadyuvantes, germinaron y el hongo se estableció en la filosfera, razón por la cual, las poblaciones de T. koningiopsis Th003 recuperadas fueron superiores o similares al control; con lo cual se puede proponer que tanto los coadyuvantes como los insecticidas evaluados pueden ser aplicados junto con el bioplaguicida, condición que se aplica con los fungicidas que no afectaron la germinación de los conidios.

La tolerancia y resistencia de un hongo principalmente a los fungicidas es considerado como un proceso evolutivo, donde la exposición a un principio activo ejerce presión de selección sobre una población, matando a la población inicial (silvestre) pero no a la alterada (mutante), de esta forma la sobreexposición acelera los cambios hacia poblaciones tolerantes y resistentes, las cuales han desarrollan mecanismos como la alteración o sobreexpresión del sitio de acción del fungicida, su detoxificación y su exclusión o expulsión desde el sitio de acción (^{FRAC, 2019}).

No obstante, la tolerancia que T. koningiopsis Th003 mostró para algunos agroquímicos, en particular fungicidas, puede deberse al metabolismo del hongo, ya que, en la fabricación del bioplaguicida Tricotec® WG el hongo utilizado no se expone a ningún agroquímico, empleándose para esto un banco de germoplasma y no el hongo recuperado del ambiente, lo cual puede suponer tal como se ha reportado para otras especies de Trichoderma la presencia de genes de tolerancia al estrés en T. koningiopsis Th003 , así como la producción de enzimas degradadoras o proteínas responsables de regular procesos de degradación del agroquímico, permitiéndole tolerarlo y crecer en su presencia (^{Tripathi et al., 2013}; ^{Ramangouda et al., 2023}).

Conclusiones

Los fungicidas utilizados en el control de oomicetos (Ciazofamida, Dimetomorf, Fenamidone - Fosetyl-Al, Fosetil - Propamocarb, Fluopicolide - Propamocarb, Hexaconazole, Mandipropamid, Propamocarb - Fenamidona) no afectaron el crecimiento micelial o la germinación de los conidios de T. koningiopsis Th003, mientras que aquellos utilizados en el control de ascomicetos o basidiomicetos presentaron alguna inhibición, no obstante, en presencia de Thiram - Pirimetanil, Procloraz, Tiabendazol, Spiroxamina y Triadimenol -Tebuconazole, el crecimiento fue inhibió totalmente. Thiram - Pirimetanil, Dodine y Iminoctadine Tris (Albesilate) inhibieron la germinación de los conidios. Insecticidas como Beta- Ciflutrina - Imidacloprid, Permetrina y Malatión inhibieron el crecimiento; sin embargo, no afectaron la germinación de conidios. Respecto a los coadyuvantes a excepción de Carrier^®, inhibieron el crecimiento micelial entre un 44 y 70% pero no afectaron la germinación de los conidios o el establecimiento del hongo en la superficie foliar. De este modo y pensando en el desarrollo de estrategias de manejo integrado, es posible mezclar los coadyuvantes, insecticidas y los fungicidas que no afectaron la germinación de los conidios de T. koningiopsis Th003 con el bioplaguicida.