Materiales y métodos

Incidencia del moho gris en frutos. A partir de cuatro cultivos comerciales, uno en el municipio de Ubaté (vereda La Patera), otro en el municipio de Sutatausa (vereda Hato viejo) y dos en el municipio de Granada (vereda La Veintidós sector Alto y La Veintidós sector bajo), se colectaron de cada uno, muestras de 100 frutos de uchuva asintomáticos, se empacaron en bolsas de papel y se trasportaron en neveras de icopor para su análisis en el Laboratorio de Microbiología Agrícola de AGROSAVIA. Los frutos se dispusieron en cámaras húmedas con una humedad relativa ≥ 90% (HR) en recipientes plásticos sellados de 14.5 x 24 x 36.5 cm (cada uno sobre una copa plástica de 1.70 onzas) y se almacenaron en un cuarto a 22 °C durante siete días, a continuación, se registró la incidencia del moho gris de acuerdo con los signos característicos de la enfermedad.

Evaluación de alternativas de manejo en campo. Se estableció el experimento en campo con 220 plantas de uchuva de la variedad Corpoica-Dorada (^{Sánchez et al., 2016}) en la vereda La Veintidós sector alto del municipio de Granada, departamento de Cundinamarca, Colombia (1.800 msnm). Durante la etapa de semillero, las plántulas de uchuva fueron inoculadas con B. amyloliquefaciens Bs006 (principio activo del bioproducto Natibac^® SC), mediante la aspersión al sustrato al momento de la siembra, a los 7 y 21 días después de la siembra. En campo, la bacteria se aplicó en drench al momento del trasplante, 7 y 15 días después de este a una concentración de 1x10⁸ UFC mL^-1, como estrategia para promover el crecimiento de las plantas y aumentar su tolerancia al estrés biótico y abiótico (^{Beltrán-Acosta et al., 2023}). La fertilización química se realizó siguiendo un esquema establecido de acuerdo con el análisis químico del suelo. Los análisis postcosecha de la fruta se realizaron en el Laboratorio de Microbiología Agrícola del Centro de Investigación Tibaitatá de AGROSAVIA.

Cuando se inició la formación de frutos de uchuva (aproximadamente 6 meses después de la siembra), se realizaron aplicaciones foliares de T. koningiopsis Th003 (Tricotec^® WG), de la levadura R. mucilaginosa Lv316 (Nalev^® WG) y B. amyloliquefaciens Bs006 (Natibac^® SC); de un tratamiento denominado Eco correspondiente a tres aplicaciones de un bioestimulante que contiene oligosacarinas y glutatión (Kendal^®) y tres del extracto de S. glutinosa (EcoSwing^®) y de un tratamiento químico que correspondió a tres aplicaciones de un fungicida a base de Azoxistrobina - Difenoconazole y tres de un fungicida a base de Thiram - Pyrimethanil (Cuadro 1).

El experimento se estableció bajo un diseño de bloques completos al azar con tres repeticiones, donde la unidad experimental (UE) consistió en dos surcos de 5 plantas cada uno (10 plantas por UE) y un total de 30 plantas por tratamiento. Cada tratamiento se separó por un surco de plantas sin tratar. Como testigo se tomaron frutos de un cultivo sembrado simultáneamente en el mismo predio, pero en un área diferente, con la misma variedad y esquema de fertilización, pero sin aplicaciones de fungicidas para el control de enfermedades foliares. La variable evaluada fue la incidencia del moho gris.

Las aplicaciones se hicieron en la mañana mediante aspersión con bomba de espalda, realizando cinco aplicaciones con una frecuencia de 15 días. Después de la tercera aplicación, semanalmente se tomaron 30 frutos maduros de cada repetición por tratamiento, se empacaron en bolsas de papel y fueron trasportados en neveras de icopor para su análisis en el laboratorio. En este, de cada repetición se tomaron 18 frutos con cáliz ubicándolos en una cámara húmeda en las condiciones anteriormente mencionadas durante siete días, adicionalmente se tomaron 15 frutos a los que se les retiró el cáliz y se dispusieron en iguales condiciones.

Seguimiento de las poblaciones de antagonistas en la filosfera. Después de la primera aplicación de los tratamientos y previo a las siguientes aplicaciones se tomaron de forma aleatorizada 10 hojas por repetición (30 hojas por tratamiento). Las hojas se guardaron en bolsas de papel, se etiquetaron y transportaron en nevera de icopor para su análisis en el laboratorio. En este, las hojas de cada repetición se cortaron en trozos de 1cm de diámetro utilizando un sacabocado de acero inoxidable estéril, se tomaron 10 g del material vegetal y se dispusieron en un Erlenmeyer con 90 mL de Tween 80 al 0.1% (suspensión madre) dejándolos en agitación constante a 150 rpm durante una hora. A continuación, de cada uno se realizó una dilución 1 en 10, se homogeneizaron en un agitador vórtex y se tomaron 100 µL disponiéndolos en cajas Petri (tres replicas por dilución), que contenían agar rosa de bengala para T. koningiopsis Th003, agar extracto de malta para R. mucilaginosa Lv316 y agar Luria Bertani para B. amyloliquefaciens Bs006, respectivamente. La alícuota se distribuyó homogéneamente con un rastrillo Drigalsky de acero inoxidable. Las cajas se incubaron a 28 °C durante 48 horas para la bacteria y a 25 °C para la levadura y el hongo durante 48 horas y 5 días respectivamente; pasado este tiempo se realizó el recuento de unidades formadoras de colonia (UFC) y los resultados fueron reportados como UFC/g de foliolo [expresado como Log (UFC/g)].

Análisis de datos. Por tratamiento se totalizaron los frutos sanos y que presentaban signos y síntomas del moho gris, y se determinó el porcentaje de incidencia utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de incidencia = (Frutos con moho gris / Frutos totales) *100. Los datos se analizaron mediante un análisis de varian­za y comparación de medias mediante la prueba LSD de Fisher (*= P>0.05) empleando el software estadístico Statistix® 10.0. La eficacia en el control de la enfermedad se calculó empleando la fórmula de Abbott: Porcentaje de eficacia= ((Cd - Td) / Cd)) *100. Donde: Cd = Incidencia en el tratamiento control y Td= Incidencia por tratamiento (^{ANDI y ICA, 2015}).

Resultados y discusión

Incidencia del moho gris en frutos a partir de infecciones quiescentes de B. cinerea en cultivos comerciales. El cáliz en la uchuva encierra y protege el fruto del ambiente (^{Fischer y Lüdders, 1997}; ^{Nocetti et al., 2020}), sin embargo, esta exposición lo hace susceptible a las infecciones quiescentes de B. cinerea, además su senescencia durante la maduración del fruto y un ambiente favorable durante la postcosecha, hacen que estas infecciones se activen y desarrollen la enfermedad (Figura 1). Esta condición se observó en este estudio, donde la incidencia del moho gris a partir de las infecciones quiescentes de B. cinerea en los frutos colectados superó el 88% alcanzando hasta el 100% en el cultivo de la vereda La Veintidós sector bajo (Figura 2 y 3), demostrando que el 80% de la fruta cosechada y con potencial destino de exportación puede estar infectada por B. cinerea.

Figura 1 Superior, frutos sanos de uchuva (Physalis peruviana). Inferior, frutos con signos de moho gris (Botrytis cinerea) en campo, observando la presencia del micelio y conidios de Botrytis cinerea con una tonalidad grisácea sobre el cáliz y la baya en su interior. 

Figura 2 Incidencia del moho gris (Botrytis cinerea) en frutos de uchuva cosechados en cultivos de tres municipios de Cundinamarca. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

Figura 3 Frutos de uchuva con signos de moho gris (Botrytis cinerea) después de su almacenamiento en cámaras húmedas. 

Aunque para uchuva aún no se cuentan con estudios epidemiológicos que permitan establecer un modelo de infección para B. cinerea, se ha demostrado en otros sistemas productivos donde el moho gris es una de las principales limitantes en su producción, la importancia de las infecciones quiescentes en las pérdidas que la enfermedad puede provocar en la postcosecha. Por ejemplo, investigaciones desarrolladas en mora (Rubus sp.), han demostrado que este patógeno produce infecciones quiescentes en todos los estados fisiológicos de desarrollo de fruto, provocando en frutos maduros una incidencia del moho gris de entre el 60 y el 80% (^{Molina et al., 2004}); de la misma forma que ^{Petrasch et al. (2019}) y ^{Rivera et al. (2013}) lo han descrito en fresa (Fragaria sp.) y arándano (Vaccinium corymbosum), respectivamente.

Evaluación de alternativas de control en campo. Para las dos primeras cosechas se observó la mayor incidencia del moho gris con valores de entre 60 y el 84% (Figura 4), este período de tiempo se caracterizó por precipitaciones con un promedio de 194 mm/día, que pudieron favorecer la incidencia de la enfermedad; no obstante, pasada esta condición ambiental y a excepción del control que durante todo el período de evaluación presentó una incidencia media del 83%, la incidencia en los tratamientos disminuyó, destacando las aplicaciones de Tricotec^® WG y Nalev^® WG con una incidencia media del 48 y 51%, respectivamente.

Figura 4 Incidencia semanal del moho gris (Botrytis cinerea) en la fruta cosechada por tratamiento. Líneas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

No obstante, el tratamiento químico que presentó una incidencia media del 55% mostró hacia el final del periodo de evaluación la menor incidencia con un 10% (Figura 4), coincidiendo con las aplicaciones del fungicida a base de Thiram - Pyrimethanil, botricida que en Colombia no presenta un uso frecuente en uchuva (a diferencia de Azoxistrobina - Difenoconazole), pero si en cultivos de rosa (Rosa sp.). Es probable que la baja exposición al fungicida, las poblaciones de B. cinerea en el cultivo de uchuva no presentaran resistencia; no obstante, para confirmarlo, es necesario desarrollar estudios que permitan determinar la resistencia de poblaciones de B. cinerea en cultivos de diferentes localidades a este y otros fungicidas.

De acuerdo con la reducción en la incidencia, se estableció la eficacia en el control del moho gris, observando que todos los tratamientos presentaron algún nivel de control; sin embargo, con las aplicaciones de T. koningiopsis Th003 y R. mucilaginosa Lv316 se obtuvieron eficacias del 42 y 39% respectivamente, siendo los tratamientos más destacados (Figura 5).

Figura 5 Eficacia de los tratamientos en el control del moho gris (Botrytis cinerea) en frutos de uchuva después de 75 días de evaluación en campo. 

Resultados similares en el control de B. cinerea se han reportado en el cultivo de mora, donde al aplicar estos mismos bioplaguicidas y bajo un esquema similar de aplicación, se obtuvo una eficacia en el control del 60%, superior al obtenido con las aplicaciones de Procloraz (58%) o Carbendazim (27%) (^{Zapata y Cotes, 2013}). Con respecto al control de B. cinerea por T. koningiopsis y R. mucilaginosa, es necesario considerar que este patógeno es susceptible a la ausencia de nutrientes, factor que limita la germinación de conidios, formación del tubo germinal e infección (^Elad,1996), por tanto, la aplicación de estos antagonistas, con modos de acción como competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo y antibiosis, pudieron reducir la infección del patógeno en el cáliz (^{Freimoser et al., 2019}; ^{Moreno-Velandia et al., 2020}).

De otra parte, las aplicaciones de la rotación de Kendal^® y el extracto de S. glutinosa con una eficacia del 34% (Figura 5) demuestra ser una alternativa a considerar en el manejo de la enfermedad, un ejemplo de esto fue la reducción del 65% en la incidencia del moho gris obtenida mediante sus aplicaciones alternadas con Tricotec^® WG en el cultivo de mora (^{Zapata y Beltrán, 2019}) o en el control del mildiu velloso en mora en rotación con bioplaguicidas a base de Trichoderma harzianum y Bacillus subtilis, un extracto de semillas de cítricos y fungicidas a base de cobre (^{Boyzo-Marín et al., 2015}).

Las oligosacarinas y glutatión presentes en Kendal^® son considerados como moléculas bioestimulantes que actúan como elicitores asociados con la estimulación de respuestas de defensa en las plantas (^{Guevara et al., 2010}; ^{Garcia-Brugger et al., 2006}), mientras que el extracto de S. glutinosa contiene α-pineno y β-pineno, compuestos que tienen acción inhibitoria sobre la germinación de los conidios y el crecimiento micelial (^{Camargo-Piñeres et al., 2021}). Esta combinación de estos mecanismos coadyuva para el control del patógeno en las plantas tratadas.

Por otro lado, con las aplicaciones de los fungicidas (tratamiento químico) se obtuvo una eficacia del 29% (Figura 5) y considerando que con las aplicaciones de Thiram - Pyrimethanil se observó menor incidencia al final del bioensayo, es necesario integrar en futuros estudios la rotación de productos, con el objetivo de implementar estrategias de manejo del moho gris. Es conveniente evaluar la integración de las alternativas evaluadas en este trabajo, aplicándolas de acuerdo con las condiciones ambientales para obtener de ellas un mejor resultado y contribuir a reducir el riesgo de poblaciones resistentes de B. cinerea a fungicidas.

Por otra parte, al retirar el cáliz del fruto previo a su almacenamiento, la incidencia del moho gris no superó el 2% (Figura 6), lo que permite suponer que las infecciones quiescentes de B. cinerea en su mayor proporción se producen en el cáliz y de este el patógeno pasa al fruto, o bien se genera un microclima favorable para el hongo; a diferencia de las infecciones en mora o fresa, donde las infecciones quiescentes se producen en estructuras florales como los estambres, carpelos o el receptáculo floral (^{Molina et al., 2004}; ^{Petrasch et al., 2019}). De acuerdo con esto, se podría retirar el cáliz de la fruta para reducir el riesgo de infecciones quiescentes; sin embargo, una de las condiciones del mercado y particularmente en Europa es la presencia del cáliz en fruto, por lo cual, no se considera viable dicha alternativa.

Figura 6 Incidencia acumulada después de 75 días de evaluación para el moho gris (Botrytis cinerea) por tratamiento en frutos de uchuva sin cáliz. Columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (*= P>0.05). 

Seguimiento de las poblaciones de antagonistas en la filósfera. La filósfera es un hábitat hostil para los microorganismos, la baja disponibilidad de nutrientes, temperaturas extremas e intensidad de la radiación solar son condiciones que dificultan el establecimiento de los antagonistas, por esto una condición inherente en un antagonista aplicado a la filósfera es su capacidad para adaptarse, colonizarla y permanecer en ella, ya que de otra forma no efectuará la actividad de control por la que fue seleccionado (^{Andrews, 1992}; ^{Andrews y Harris, 2000}). En este estudio se observó que los antagonistas colonizaron la filósfera de uchuva, ya que sus poblaciones permanecieron constantes durante el período de evaluación, obteniendo 1x10³ UFC g^-1 para T. koningiopsis Th003 por muestreo, mientras que para R. mucilaginosa Lv316 y B. amyloliquefaciens Bs006 se obtuvieron 1x10⁵ UFC g^-1 (Figura 7).

Figura 7 Seguimiento de la población de antagonistas aplicados en plantas de uchuva durante el periodo de evaluación (del 7 de octubre al 21 de diciembre del 2022). 

Resultados similares han sido reportados por autores como ^{Sylla y colaboradores (2013}), quienes al aplicar semanalmente bioplaguicidas a base de Trichoderma harzianum y B. amyloliquefaciens para el control de B. cinerea en fresa, obtuvieron recuentos de la filósfera de 1x10² UFC g^-1 para el hongo y de 2x10⁴ UFC g^-1 para la bacteria; mientras que ^{Elad y colaboradores (1994}) al aplicar las levaduras Rhodotorula glutinis y Cryptococcus albidus para el control de B. cinerea en jitomate recuperaron de la filosfera poblaciones de 8x10³ UFC cm^-2.

Conclusiones

Con la aplicación en campo de bioplaguicidas a base T. koningiopsis Th003 y R. mucilaginosa Lv316, se obtuvo una eficacia en la reducción de las infecciones quiescentes de B. cinerea del 42 y 39% respectivamente, comparado con el 29% obtenido con las aplicaciones alternadas de los fungicidas a base de Azoxistrobina - Difenoconazole y Thiram - Pyrimethanil. Estos resultados plantean como una opción viable y eficiente la integración de los bioplaguicidas en estrategias de manejo integrado del cultivo, contribuyendo así a reducir el número de aplicaciones de fungicidas en campo.