Origen de los consorcios de HMA y Trichoderma spp

Los consorcios de HMA fueron aislados de la reserva ecológica Cuxtal, ubicada en el estado de Yucatán, México en los 20° 52’ 07.44” LN y 89° 36’ 51.64” LO, donde predomina la vegetación selva baja tropical caducifolia (^{Herrera-Parra et al. 2021a}). Forman parte de la colección de hongos micorrízicos arbusculares del departamento de ecología de la facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Yucatán y la identificación se realizó considerando características morfotaxonómicas (^{Schenck y Pérez 1990}, ^{Schüßler y Walker2010}). Las especies de Trichoderma también se obtuvieron de la misma entidad, de sitios sin actividad agrícola en los últimos 30 años (^{Candelero et al. 2015}). Inicialmente la identificación de los hongos se realizó mediante características de cultivo y morfología del hongo (^{Barnett y Hunter, 1972}), posteriormente las cepas fueron identificadas mediante análisis molecular y sus secuencias se encuentran en el GenBank con número de acceso: Th02-01-T harzianum-C1 (MF952887), Th09-06 -T atroviridae (MF078647), Th43-13 -T virens (MF078644) y Th43-14 - T. harzianum (MF078649). Los que forman parte de la colección de hongos del laboratorio de fitopatología del Tecnológico Nacional de México campus Conkal.

Inoculación en semillero de C. chinense

El consorcio de HMA estuvo conformado por las especies: Glomus ambisporum G.S. Sm. & N.C. Schenck, Claroideoglomus claroideum C. Walker & A. Schussler y Funnelisformis geosporum C. Walker & A. Schüßler (antes G. geosporum), las cuales colonizan las raíces y promueven el crecimiento de Capsicum spp. (^{Herrera-Parra et al. 2021}b). Las esporas se extrajeron de macetas de propagación (^{Gerdemann y Nicolson 1963}). Posteriormente se esterilizó sustrato mediante arrastre de vapor durante tres días por 1 hora a 100 °C. Con este sustrato se llenaron charolas de germinación de 72 cavidades, donde se depositaron 54 esporas por cavidad que integró el consorcio de HMA (18 esporas por cada especie). Enseguida se sembró una semilla de chile habanero cv. Calakmul por cavidad, previamente desinfestada con hipoclorito de sodio al 1% durante dos minutos, seguidos de dos lavados con agua destilada estéril. El consocio de Trichoderma estuvo integrado por las especies: Trichoderma harzianum-C1 Rifai T. atroviride P. Karst, T. virens J. H. Mill, Giddens & A. A. Fostery T. harzianum-C2 Rifai Se reactivaron en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) DIBICO^®. Posteriormente se prepararon concentraciones de 1 x 106 esporas mL^-1 (^{Cubillos et al. 2009}), las cuales se inocularon en semillas de chile habanero cv. Calakmul al momento de la siembra en las charolas que contenía sustrato estéril comercial Sunshine^®. Adicionalmente, se realizaron tres inoculaciones a los 10, 20 y 30 días después de la germinación. Para obtener plántulas inoculadas con ambos consorcios, primero se inoculó el consorcio de HMA a las semillas y se dejaron transcurrir 30 días para realizar tres inoculaciones con el consorcio de Trichoderma spp., a los 31,36 y 41 días después de la inoculación con los HMA. Las charolas se mantuvieron en invernadero a 28 ± 2 °C, con humedad relativa promedio de 64%. El riego se realizó con base a las lecturas de tensiómetros, estableciéndose como nivel mínimo 15 cbares.

Obtención de la fase infectiva del nematodo (J2) de M. incógnita

Se muestrearon plantaciones comerciales de C. chinense, con agallas de M. incognita. De las agalladas se extrajeron masas de huevos y se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1%. Los huevos se incubaron a 28 ± 1 °C hasta la eclosión de los J2 (^{Herrera-Parra et al. 2021a}). De las raíces agalladas se extrajeron hembras adultas para identificar la especie mediante caracteres morfotaxonómicos (^{Ayoub 1977}).

Evaluación de consorcios de HMA y Trichoderma spp. como antagonistas de M. incógnita

Con el suelo esterilizado se llenaron bolsas negras de vivero de 5 kg de capacidad. Previo al trasplante, se realizó un orificio de tres centímetros de diámetro y cinco centímetros de profundidad, con la ayuda de un tubo de policloruro de vinilo que cumplió con estas características, y se inoculó con 1 mL de agua que contenía 1 000 huevos larvados y 300 J2 de M. incognita enseguida se trasplantó una planta de C. chinense de 47 días de edad inoculadas con los consorcios. El manejo nutrimental de las plantas consistió en una fertilización con equilibrio químico 2:1:1 con urea (Magro, 46-00-00, Fertinova), nitrato de potasio (Ultrasol, 12-00-46, SQM) y fosfato monoamónico (MAP, 12-61-00 Greenhow) aplicada dos veces por semana. Se evaluaron cinco tratamientos: 1) HMA + Mi, 2) Trichoderma spp. + M. incognita (TRI + Mi), 3) HMA + Trichoderma spp. + M. incognita (HMA + TRI + Mi), 4) Nematicida oxamil 24% (Vydate®, Dupont) + M. incognita, en dosis de 1 mL L^-1 de agua aplicado al suelo al momento del trasplante (Oxamil + Mi) y 5) un control + M. incógnita, (control + Mi). En cada tratamiento hubo 15 plantas que constituyeron las repeticiones y las unidades experimentales, distribuidas en un diseño experimental completamente al azar en condiciones de invernadero con temperatura de 28 ± 2 °C, humedad relativa de 64% e intensidad lumínica de 450 luxes en promedio. Los tratamientos se evaluaron después de 166 días después de la siembra (dds), como variables de control del nematodo, se consideró como severidad; el índice de agallamiento de la enfermedad (^{Taylor y Sasser 1983}) y como índice de reproducción del nematodo; número de huevos y hembras por gramo de raíz. También, se midieron variables de crecimiento de las plantas: altura, biomasa aérea seca, área foliar, peso seco de raíz, volumen de raíz se determinó por el método descrito por ^{Bohm (1979}) para lo cual se introdujo la raíz de cada planta en una probeta graduada con agua tomando el dato del volumen de agua desplazado por las raíces. Y número y peso total de frutos. Adicionalmente, se estimó el porcentaje de colonización de HMA en cinco plantas por tratamiento (^{Phillips y Hayman 1970}). Para confirmar la colonización por Trichoderma, en los tratamientos donde se inoculó se tomaron secciones de raíces del cultivo de 0.5 cm de largo y se sembraron en cajas de Petri con medio de cultivo de papa-dextrosa-agar y la presencia del hongo en este medio de cultivo, se consideró como persistencia del mismo. Con un analizador de gases en infrarrojo (Estados Unidos, Nebraska, LICOR LI-6400) se evaluó el intercambio de gases: fotosíntesis (A_N) (μmol m^-2 s^-1), conductancia estomática (gs) (mol m^-2 s^-1), carbono intercelular (Ci) (μmol mol-1), transpiración (E) (mmol m^-2 s^-1) y eficiencia del uso del agua (μmol CO₂/mmol H₂O) (^{Cristóbal-Alejo et al. 2022}).

Análisis estadístico de datos

Con la información que se generó, se realizaron análisis de varianza (ANDEVA) y para el caso de los datos relacionados con el índice de agallamiento y colonización por los HMA estimados en porcentaje, se transformaron mediante la función de arco seno. Se realizó comparación múltiple de medias con el método de Tukey (P ≤ 0.05), con el paquete estadístico Statistical Analysis System, versión 9.3.

Efecto de consorcios de HMA y Trichoderma spp. en la intensidad de daño y reproducción de M. incógnita

En las variables índice de agallamiento y reproducción del nematodo, se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos (P < 0.001). El menor índice de agallamiento del nematodo se obtuvo con el tratamiento HMA + Mi, las plantas mostraron hasta un 60.00% de raíces libres de agallas, con relación a las plantas de los tratamientos HMA + TRI + Mi, Oxamyl + Mi y el control, donde el índice de agallamiento fue de 75.50 a 83.00%. Con el tratamiento TRI + Mi se tuvo un 18.00% de raíces sanas, con relación al control y presentó el mismo efecto que con los tratamientos, HMA + TRI + Mi y Oxamyl + Mi (Tabla 1). La inoculación solo con HMA o Trichoderma spp, confirieron un efecto protector en Capsicum spp. en etapas tempranas de crecimiento y disminuyeron la severidad de la enfermedad con índices de agallamiento del 74.00 al 82.91% (^{Herrera-Parra et al. 2018}, ^{Herrera-Parra et al. 2021a}). El tratamiento de HMA+TRI+MI, no causó el efecto esperado en la disminución de la severidad en la enfermedad causada por el nematodo, como ocurrió en el tratamiento HMA + Mi, es posible que el consorcio de Trichoderma spp. haya limitado su colonización en la rizosfera por competencia inter e intra específica por el consorcio utilizado. Al respecto, se ha señalado que los metabolitos que producen este hongo, al tener un efecto antimicrobial, pueda incidir en su efectividad como agente de control biológico o como promotor de crecimiento vegetal (^{Vinale et al. 2008}, ^{Tucci et al. 2011}) y el efecto benéfico lo causó el consorcio integrado por los HMA. En general se observó que la inoculación en consorcio de HMA y Trichoderma spp., causaron supresión del nematodo con lo que se redujo el índice de agallamiento en C. chinense en etapa de producción del cultivo. La mejor supresión del nematodo lo causó el tratamiento con el consorcio de HMA con efectos superior al tratamiento nematicida (Tabla 1). La reducción en el índice de agallamiento se ha asociado con la producción de fenoles, flavonoides y ácidos orgánicos contenidos en los exudados radicales, que se producen cuando los HMA están en interacción simbiótica con las raíces, lo que paraliza a la fase infectiva del nematodo (J2), y disminuye la penetración de éstos en la raíz (^{Diagne et al. 2020}). En reportes previos, Trichoderma spp. inmovilizó a los J2, debido a la producción de metabolitos secundarios como: viridina, gliotoxina, gliovirina, peptaiboles, trichodermina, suzukacilina y alameticina, incluso el hongo puede parasitar huevos y J2 del nematodo (^{Zin y Badaluddin et al. 2020}, ^{Moo-Koh et al. 2022}) lo que disminuye su población y con ello menor severidad en las raíces.

En el índice de reproducción del nematodo en las plantas del tratamiento control + Mi, tuvieron mayor número de huevos (1900.40 ± 46.63) y hembras por gramo de raíz (58.60 ± 1.14). Una reducción significativa de la reproducción del nematodo se logró con el tratamiento HMA + Mi, con reducciones en la formación de huevos de 48.16 y 72.78% y de hembras por gramo de raíz de 26.29 y 36.86%, en relación a los tratamientos de Oxamyl + Mi y el control + Mi, respectivamente. También, el tratamiento HMA + TRI + Mi tuvo efecto igual al Oxamyl + Mi, disminuyó 59.00% la formación de huevos y un 35.83% de hembras, con relación al control + Mi (Tabla 1). Estos resultados sugieren que los consorcios de microorganismos evaluados, HMA, HMA+ Trichoderma spp., establecieron interacciones positivas que limitaron el parasitismo del nematodo como ocurrió en cultivos de Cicer arietinum L., Ocidium bacilicum L. inoculados con consorcios de HMA, Trichoderma spp., Bacillus spp., que tuvieron reducciones de M. incognita del 46.00 al 95.00% (^{Rizvi et al. 2018}, ^{Tiwari et al. 2021}). Varios modos de acción están implicados en el control de nematodos: competencia entre HMA y J2 para ocupar sitios en la raíz y por fuentes carbonados, activación de mecanismos de defensa de la planta asociados con la activación de genes que codifican quitinasas, implicadas en la desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, que se producen durante la hipertrofia y muerte celular inducida por nematodos al parasitar raíces, como la glutation S-transferasa o la superóxido dismutasa, fitoalexinas, involucradas en la biosíntesis de la lignina, precursora de metabolitos secundarios aromáticos que afectan la viabilidad de huevos y movilidad de J2 (^{Poveda et al. 2020}, ^{Moo-Koh et al. 2022}).

Con el tratamiento TRI + Mi, consorcio de Trichoderma spp., se obtuvo el menor efecto de supresión del nematodo, con relación a los tratamientos que incluyeron consorcios microbianos Oxamyl + Mi (Tabla 1). Al respecto, la mayoría de los estudios reportan los resultados de las evaluaciones individuales de Trichoderma spp. o de sus metabolitos (^{Herrera-Parra et al. 2018}, ^{Cristóbal-Alejo et al. 2021}). Pero, cuando se realizan inoculaciones duales o en consorcio pueden inhibir el crecimiento de hongos, incluyendo otras especies de Trichoderma (^{Moo-Koh et al. 2018}), lo cual puede estar asociado a la incompatibilidad entre especies que integran el consorcio evaluado; además, las cepas entran en competencia por nutrientes y espacios para asegurar su supervivencia, lo que también limitan su capacidad en el biocontrol del nematodo.

Colonización total

Los tratamientos que presentaron mayor colonización micorrízica (P < 0.001) fueron HMA + Mi con 90.36% y HMA + TRI + Mi con 93.97%. Este último, incluyó la inoculación de Trichoderma spp., y no limitó la colonización mocorrízica del cultivo. En los tratamientos TRI + Mi, Oxamil + Mi y control + Mi no hubo colonización micorrízica. En estudios con S. melongena, parasitada M. javanica, también la colonización fue alta (68.20%) y no fue afectada por la inoculación de consorcios integrados por G. mosseae, Gi. gigantea y P. fluorescens (^{Sharman et al. 2021}). Lo cual puede estar asociado al origen de los microorganismos que se inoculan en consorcio, y la compatibilidad que existe al aislarse del mismo lugar de origen.

Efecto de consorcios de hongos micorrízicos arbusculares y Trichoderma spp, en el crecimiento, producción y fisiología de C. chinense

Hubo diferencias significativas entre tratamientos (P < 0.001) para el crecimiento. Los HMA y la combinación con las cepas de Trichoderma favorecieron el crecimiento de las plantas con efectos en su mayoría igual al obtenido con el tratamiento Oxamil + Mi. La mayor altura de plantas (66.30 ± 1.49) se obtuvo con el HMA + Mi, su efecto en la promoción de crecimiento fue mejor al resto de los tratamientos y al control + Mi. Los tratamientos HMA + TRI + Mi y Oxamil + Mi, tuvieron la misma capacidad para favorecer el crecimiento en altura de las plantas hasta 61.60 cm en promedio y fueron estadísticamente diferentes al resto de los tratamientos. Un efecto significativo para incrementar la biomasa foliar se logró con HMA + Mi y HMA + TRI + Mi, las plantas incrementaron un 24.23% de biomasa con relación al Oxamil + Mi y el control + Mi, con 24.04 gramos en promedio. El área foliar incrementó 81.60% con los tratamientos HMA + Mi, HMA + TRI + Mi, Oxami + Mi, con relación al control + Mi (Tabla 2). Los efectos benéficos de los HMA, están asociados con las hifas extrarradicales que funcionan como una extensión de las raíces y exploran mayor área y espacios porosos del suelo, donde toman y translocan a la planta nutrimentos como fósforo, nitrógeno y potasio (^{Vergara et al. 2019}). Adicionalmente, Trichoderma produce ácido cumárico, glucurónico y cítrico que facilitan la disponibilidad de fósforo, zinc, magnesio, manganeso y sideróforos que actúan como compuestos quelantes de hierro (^{Sood et al. 2020}) lo que contribuyen a la nutrición y crecimiento del cultivo; además, produce metabolitos secundaros identificados como HYTLO1, ácido harziánico y 6-pentil pirona (^{Marra et al. 2022}) asociados a la promoción de crecimiento que se refleja en plantas con mayor vigor y producción de biomasa.

Con el tratamiento HMA + Mi se obtuvieron raíces con un volumen de 88.50 cm³, y raíces un 43.98 y 35.59% de mayor tamaño que las del control + Mi y tratadas con Oxamil + Mi y HMA + TRI + Mi, respectivamente (Tabla 2). El crecimiento de raíces está asociada con la capacidad de los HMA para modificar el crecimiento y morfología de la raíz, lo que incrementa su área y compensa el daño que realizan la población del nematodo (^{Diagne et al. 2020}). En el caso de Trichoderma, se reporta la producción del ácido 3-indol acético y cisteínas que estimulan la elongación de raíces, lo que mejora la superficie de la raíz, la colonización por este hongo y potencializa la absorción de agua y nutrientes (^{Nieto-Jacobo et al. 2017}, ^{Sood et al. 2020}).

El mayor número de frutos se obtuvo con los tratamientos HMA + Mi, HMA + TRI + Mi y Oxamil + Mi, hasta un 70.00% más de frutos que en las plantas del tratamiento con TRI + Mi y el tratamiento control + Mi. Así mismo, el mayor peso de frutos se produjo con HMA + Mi, HMA+ TRI+ Mi y tuvieron un 42.37% más frutos que el tratamiento nematicida (Oxamil + Mi) y hasta un 79.26% más que el TRI + Mi y el control + Mi (Tabla 3). En estudios previos, se reportaron los beneficios de la aplicación en consorcio de estos microorganismos. Así, con la inoculación de T. harzianum y G. mosseae incrementaron rendimiento de frutos de S. lycopersicum (8.2 kg planta^-1), sin afectaciones en la actividad antioxidante, flavonoides totales y el contenido de vitamina C (^{Nzanza et al. 2012}). Con el consorcio integrado por G. mosseae, Gi. gigantea y P. fluorescens reportaron incrementos de 259.00% de producción de frutos de S. melongena, parasitado por M. javanica (^{Sharman et al. 2021}).

Los análisis de varianza para las variables fisiológicas mostraron diferencias significativas entre tratamientos (P ≤ 0.01). La mayor tasa fotosintética (18.0 μmol m^-2 s^-1) se obtuvo con el tratamiento HMA + Mi, estadísticamente similar al tratamiento HMA + TRI + Mi (17.7 μmol m^-2 s^-1), pero superó al tratamiento con Oxamil + Mi (16.3 μmol m^-2 s^-1) y control + Mi (12.6 μmol m^-2 s^-1); la menor tasa fotosintética se obtuvo en las plantas con TRI + Mi (2.6 μmol m^-2 s^-1) (Tabla 4). Esto indicó que la inoculación de consorcios de HMA, potenció la asimilación de carbono, no así la inoculación con Trichoderma. Considerando que los tratamientos con HMA también incrementaron la mayoría de las variables de crecimiento y las características de los frutos, se sugiere que a pesar de la presencia de nematodos los mecanismos que utiliza la planta durante la simbiosis con HMA mejora la síntesis de fotoasimilados, los cuales son canalizados en las diversas formas de crecimiento de la planta (^{Parihar et al. 2020}, ^{Bernardo et al. 2021}).

Cabe mencionar que el tratamiento TRI + Mi tuvo la conductancia estomática (0.03 mol m^-2 s^-1) y la tasa de transpiración (0.9 mmol m^-2 s^-1) más bajas, incluso por debajo de las plantas control, esto sugiere que los estomas de las plantas con nematodos inoculadas con Trichoderma mantienen un flujo de intercambio de gases tanto de CO₂ como de H₂O relativamente bajo, lo cual se reflejó en una mayor concentración de carbono intercelular (307 μmol mol^-1) (Tabla 4), esto indicó que probablemente incrementó la acumulación de carbono en los espacios aéreos subestomáticos a consecuencia de una baja eficiencia en la carboxilación durante la fotosíntesis, lo que disminuyó el intercambio de gases planta-atmosfera. En ocasiones los microorganismos endófitos como Trichoderma spp. pueden serdemandantes y comprometer los productos del metabolismo primario de la planta (^{Woo et al. 2023}).

La eficiencia del uso del agua (EUA) fue estadísticamente superior en las plantas del tratamiento HMA + Mi (3.3 μmol CO₂/mmol H₂O), los demás tratamientos fueron estadísticamente similares entre ellos; sin embargo, el tratamiento TRI + Mi fue estadísticamente inferior a todos (1.8 μmol CO₂/mmol H₂O) (Tabla 4). Estos resultados sugieren que a pesar de la presencia de nematodos las plantas inoculadas con HMA pueden mejorar la EUA como una consecuencia de fijar más moléculas de carbono por cada molécula de agua que liberan durante la transpiración (^{Oljira et al. 2020}). Los HMA y Trichoderma spp., inoculados en consorcios mantuvieron este efecto de control y redujeron el índice de agallamiento en C. chinense en etapa de producción del cultivo.