Material biológico

En el potrero de recolecta de maguey del ejido Miguel Hidalgo (Charcas, San Luis Potosí), que abastece a la fábrica de mezcal Laguna Seca, se seleccionaron cinco cabezas de maguey de diferente tamaño pero con los rasgos de madurez fisiológica. Las cabezas se llevaron a los patios de la fábrica y se pesaron (Básculas Nuevo León D13, México); cada una se seccionó en tallo y bases de pencas y se pesaron las partes por separado. Posteriormente, en el laboratorio, cada tallo se dividió en tres partes similares para pesarlas (Tecnocor PPN-30, México) y procesarlas de manera individual el mismo día de su recolecta. A la vez, se tomó una muestra de bases de pencas (10 % del peso de la piña), para determinar su contenido de materia seca, con el propósito de referir el rendimiento del concentrado de fructanos con base en el peso fresco y seco de la piña o cabeza de maguey, la forma actual de aprovechamiento.

Extracción del concentrado de fructanos (CF)

Un tercio del tallo se utilizó para estimar el contenido de materia seca. El segundo tercio se sometió a la acción de un extractor de jugos (International EX-S, México) para separar el extracto líquido considerado como jugo primario y el residuo sólido o bagazo. El jugo se filtró con dos coladeras de muselina, se midió el pH con un potenciómetro (Hanna Instruments H198127, Italia) y los sólidos solubles (°Bx) con un refractómetro digital (Reichert AR200, EE. UU.). Este jugo primario se estabilizó con una misma cantidad de agua destilada en baño María a 53 ± 2 °C por 60 min, pues el extracto acuoso se descompone rápidamente, incluso después de un día en refrigeración, como también sucede con el extracto crudo de achicoria (^{Van Arkel et al., 2014}). Inmediatamente, el jugo primario se colocó en recipientes herméticos y se congeló a -15 °C (Torrey CHTC25, EE. UU.). El bagazo del jugo primario se exprimió en un dispositivo de acero inoxidable diseñado para la extracción de jugos a una presión constante de 14 kg·cm^-2 por medio de una prensa hidráulica de 30 t (Urrea 2471, España). El jugo recuperado del bagazo se denominó jugo secundario y, al igual que el primario, se filtró, se midió pH y °Bx, se estabilizó y se congeló. Posteriormente, el bagazo prensado se rehidrató con un volumen de agua destilada igual al jugo obtenido (jugo primario + jugo secundario) y se estabilizó en baño María; luego se prensó y el extracto generado se procesó como los dos anteriores, al cual se denominó jugo terciario. Previamente se estableció que el bagazo rehidratado y exprimido más de dos veces aportaba muy poco (2 %) al extracto total. Debido a la falta de equipo de secado al vacío para muestras grandes, en un equipo de cocción e impregnación en vacío (J. P. Selecta Gastrovac, Barcelona, España) se hizo una evaporación parcial de los jugos primario, secundario y terciario, por separado, para la desecación de los extractos. Las características originales del equipo impidieron llevar los extractos a sequedad total, por lo que fue necesario cambiar la tapa original de metacrilato por una tapa plana de acero inoxidable con una salida de vapores al centro y una camisa sellada, para introducir un termómetro al área de vaporización; además, se adaptó un condensador externo entre la salida de vapores y la línea de vacío. Todos los jugos se evaporaron parcialmente, de manera independiente, a 75 % del vacío total y 42 ± 1 °C, hasta obtener 20 % del volumen original o hasta que el extracto tomara una consistencia densa de aproximadamente 50° Bx; la tasa de condensación resultante fue de 100 mL de agua por 10 min. Posteriormente, los jugos concentrados se vertieron en moldes de silicón (para hornear) con espesor mínimo para llevarlos a sequedad (aproximadamente 95 % de materia seca [MS]) en un horno de aire forzado (Shel-Lab FX-14, EE. UU.) a 53 ± 2 °C, lo cual tardó en promedio 35 h. El extracto seco se retiró de los moldes y quedó en forma de escamas, las cuales se molieron en mortero, tamizaron, pesaron y almacenaron en recipientes herméticos.

El tercio de tallo restante se sometió a extracción como el anterior, pero los jugos descongelados se centrifugaron a 4,000 rpm (Damon PR-6000, EE. UU.) para decantarlos y desecar el sobrenadante y el sedimento por separado, pues se observó que los jugos al descongelarse presentaban un sedimento blanco en el fondo de los recipientes, lo cual podría facilitar la depuración del extracto. Para evaluar la calidad de los fructanos se hizo una mezcla homogénea con los concentrados obtenidos de los jugos primario, secundario y terciario del segundo tercio del tallo, se tomó una muestra y se secó totalmente en un horno de aire forzado a 35 ± 2 °C hasta peso constante. La muestra libre de humedad se colocó en recipientes y se almacenaron en un desecador hasta su análisis. El procedimiento anterior también se siguió en las muestras de concentrados del sobrenadante y sedimento derivados del último tercio del tallo.

Evaluación del rendimiento relativo y absoluto de fructanos

El rendimiento absoluto y relativo de fructanos se calculó con base en los pesos registrados (Ohaus 5120, EE. UU.) de la materia fresca y materia seca, tanto del tallo como de la cabeza completa.

Contenido de humedad del tallo

Una muestra de 100 g del tercio de cada tallo se pesó (Ohaus 5120, USA) y se secó hasta peso constante en un horno de aire forzado a 80 ± 2 °C (Shel-Lab FX-14, EE. UU.), para estimar el contenido de humedad; cada medición se hizo por triplicado.

Contenido de cenizas totales del extracto de fructanos

Las cenizas totales se obtuvieron mediante la calcinación de las muestras. Para ello se pesaron 5 g (Sartorius BP221S, Alemania) del concentrado de fructanos libre de humedad, mismo que se calcinó en una mufla (Lindberg 51844, México) a 550 °C por 2 h. La muestra se enfrió, se colocó en un desecador y se pesó en una balanza analítica (Sartorius BP221S, Alemania). El porcentaje de cenizas totales se obtuvo por diferencia de pesos respecto al peso inicial; cada medición se realizó por triplicado.

Cuantificación de sapogeninas del concentrado de fructanos

La extracción de sapogeninas se basó en la metodología descrita por ^{Zamora et al. (2010)}, para lo cual se hizo una hidrólisis ácida de 30 mg de muestra y se aforó en un matraz volumétrico de 10 mL. En un tubo de ensayo se tomaron 2 mL de la solución y 2 mL de H₂SO₄ (2 N); la mezcla se calentó a 110 °C por 1.5 h en un baño seco (Labnet Internantional Inc. D1200, EE. UU.). Luego de que los tubos alcanzaron la temperatura ambiente se hizo una extracción con 5 mL de acetato de etilo. Los tubos se agitaron en un vortex (Barnstead Thermolyne M37615, Iowa, EE. UU.), se sumergieron en un baño de ultrasonido (Bransonic 1510R-MT, Danbury, EE. UU.) por 1 minuto y se separó la capa orgánica en otro tubo de ensayo. Las sapogeninas se cuantificaron con el método descrito por ^{Baccou, Lambert, y Sauvaire (1977)}, para lo cual se utilizó una curva estándar de 2.5, 5, 10, 15 y 20 µg·mL^-1 de diosgenina (Sigma-Aldrich, EE.UU). Las lecturas de absorbancia se hicieron a 430 nm de longitud de onda en un espectrofotómetro (HP-Agilent Technologies 8453, Alemania).

Cuantificación de carbohidratos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Los carbohidratos presentes en los extractos se cuantificaron de acuerdo con el método descrito por ^{Zuleta y Sambucetti (2001)}. A diferencia de la cromatografía de intercambio iónico de alta resolución con detector de pulsos amperométricos (HPAEC-PAD, por sus siglas en inglés), el método usado no logra separar los componentes con más de cinco grados de polimerización de manera individual, pero sí los mono, di, tri y tetrasacáridos, por lo cual, los fructanos con grado de polimerización mayor de cinco se integraron en una sola área. Para este caso, el estándar usado como referente fue inulina (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Este método se ha utilizado para el análisis de fructooligosacáridos se inulina en productos alimentarios por ser práctico y rápido (^{Van Loo, Coussement, De Leenheer, & Hoebregs, 1995}). En consecuencia se usó en fase reversa, un cromatógrafo (HP-Agilent Technologies serie 1100, Alemania) compuesto por un desgasificador, bomba cuaternaria, compartimiento térmico de columna y detector de índice de refracción. Como fase estacionaria se utilizó una columna de intercambio iónico (HP-Animex 78-C [7.8 mm d. i. x 300 mm] Bio Rad, EE. UU.). Como fase móvil se utilizó agua grado HPLC (Fermont, México) con un flujo de 0.5 mL·min^-1. La temperatura de la columna fue de 75 °C y la del detector de 50 °C con un tiempo de operación por muestra de 20 min. Las muestras se ajustaron a pH 7 antes de su inyección. Los carbohidratos se identificaron con base en la comparación de los tiempos de retención con los correspondientes a los estándares de referencia: inulina, sacarosa, glucosa, fructosa (Sigma-Aldrich, EE. UU.), nistosa y 1-kestosa (Wako Laboratory Chemicals, Japón), todos con pureza mayor de 98 % (Figura 1). Para la cuantificación de carbohidratos se construyó una curva de calibración lineal por cada estándar de referencia (r≥0.994) y se determinó su constante de linealidad (pendiente). El límite de cuantificación para fructosa y glucosa (carbohidratos encontrados en menor proporción en las muestras) fue de 0.02 mg·mL^-1 y 0.07 mg·mL^-1, respectivamente.

Figura 1. Separación e identificación de azúcares del concentrado de fructanos de Agave salmiana con estándares externos por HPLC. 

Análisis estadístico

Los datos derivados del proceso de extracción y de la composición del concentrado de fructanos se representaron con su valor medio y desviación estándar respectiva.

Extracción de fructanos

Con el método de extracción a base de operaciones y procesos simples, como es el uso de un extractor de jugos y una prensa hidráulica, se pudo obtener jugo primario con cerca de 55 % de los fructanos (CF) totales extraíbles, jugo secundario (recuperado del bagazo prensado) con 32 % y jugo terciario (del lavado y prensado del bagazo) con 12 % de los fructanos totales posibles (Cuadro 1). Un segundo lavado del bagazo solo permitió añadir 2 % al concentrado total de fructanos, lo cual se consideró inviable, al tener que evaporar volúmenes de agua similares a los de los jugos anteriores.

Cuadro 1. Concentrado de fructanos (CF) obtenido (%) en cada etapa del método de extracción utilizado, a partir de tallos de Agave salmiana. 

DE: Desviación estándar

Al utilizar únicamente el tallo de la planta como materia prima fue innecesario recurrir a equipos de filtración (resinas de intercambio iónico, carbón activado, nanofiltración, etc.) y procesos costosos para separar los contaminantes presentes en las bases de las pencas (saponinas, clorofilas, ceras), así como los di, tri y tetrasacáridos en vías de polimerización para ser almacenados en el tallo. El uso de agua caliente como solvente fue suficiente para complementar la extracción, al igual que en el proceso de obtención de inulina de la raíz de achicoria (^{Niness, 1999}), y resulta lo más adecuado para obtener un producto alimentario lo más natural posible.

El pH de los jugos primario, secundario y terciario osciló entre 5.6 y 5.8; este pH ligeramente ácido fue mayor que el encontrado típicamente en los fluidos foliares de especies de Agave, por su tipo de metabolismo (metabolismo ácido de las crasuláceas) (^{Medrano & Flexas, 2008}). El pH tiene un papel importante en las reacciones enzimáticas que ocurren a nivel celular en la planta, las cuales continúan durante y después del proceso de extracción, si no son inhibidas. En algunos trabajos se ha neutralizado la acidez natural con NaOH para inhibir la actividad enzimática (^{Gupta, Kaur, & Kaur, 2003}); sin embargo, en este estudio, para evitar tratamientos químicos se recurrió a la inactivación enzimática con agua destilada (que a la vez disuelve los fructanos) a 55 °C por 60 min y a la congelación de los jugos. Estas operaciones fueron críticas, pues la posibilidad de que las reacciones enzimáticas continúen es muy alta (^{Van Arkel et al., 2014}), aún bajo refrigeración. De ahí la importancia de la extracción, estabilización y congelación de los jugos el mismo día de la recolección de la piña de maguey.

La concentración de sólidos solubles de los jugos primario y secundario del tallo oscilaron entre 25.0 y 28.8 °Bx, valores mucho mayores que los 11.7 °Bx encontrados en el jugo crudo de la piña completa de A. salmiana (^{Moreno, 2013}). Esto se debe a que el mayor contenido de fructanos y materia seca se encuentra en el tallo (^{Aguirre et al., 2001}; ^{Michel-Cuello et al., 2008}), y al procesar la piña completa ocurre un efecto de dilución con la mayor humedad de las bases de las pencas. El jugo terciario tuvo de 5.4 a 7.2 °Bx, lo cual corresponde principalmente a los fructanos remanentes, recuperados con el lavado y prensado del bagazo.

El tiempo promedio estimado para desecar 12 L de jugo (primario, secundario y terciario) obtenido del tallo de una cabeza de 57.6 kg, hasta alcanzar 95 % MS, fue de 55 h. Este tiempo fue mucho menor que las 480 h (20 días) promedio requeridas por ^{Franco (2012)} para el mismo propósito, con solo un horno de aire forzado.

Rendimiento absoluto y relativo de concentrado de fructanos

Como se muestra en el Cuadro 2, el tallo de una piña o cabeza de maguey de 57.6 kg (menos de 10 % del peso total) rinde en promedio 1.05 kg de fructanos con 95 % de materia seca. Además, las bases de las pencas de esta cabeza pueden utilizarse como forraje o para producir mezcal; así, dicho rendimiento permite valorar el uso alternativo de la cabeza de maguey y sus partes como materia prima.

Cuadro 2. Rendimiento absoluto y relativo de concentrado de fructanos (CF) del tallo de Agave salmiana. 

DE: Desviación estándar

MS: Materia seca

Del tallo fresco de una cabeza promedio de maguey mezcalero (57.6 kg) se obtuvo un rendimiento promedio de CF (95 % MS) de 21 %, y con respecto al peso seco del tallo, el rendimiento fue de casi 80 %; ambos valores son similares al contenido de inulina con base en el peso fresco (15 a 20 %) y seco (70 a 80 %) de las raíces de achicoria (^{Franck, 2002}; ^{Gupta et al., 2003}). El Cuadro 3 compara el contenido de fructanos de A. salmiana y otras especies. El menor rendimiento de fructanos con base en el peso seco de la cabeza, documentado por ^{Mancilla-Margalli y López (2006)} para sotol (especie del género Dasylirion) y diferentes tipos de magueyes, de cerca de 60 %, es de esperarse, al utilizar las cabezas enteras como materia prima, con todos los inconvenientes ya señalados, referentes a la complejidad de procesos y calidad de los fructanos extraídos.

Cuadro 3. Contenido relativo de fructanos en Agave salmiana y otras especies. 

Calidad del concentrado de fructanos

El Cuadro 4 presenta los resultados de la evaluación de la calidad media del CF (llevado a peso constante); es decir, el contenido relativo de fructanos extraídos del tallo de una planta madura de A. salmiana. Como se mencionó anteriormente, se usó un estándar de inulina como referente, ya que el equipo y el método impide una mayor resolución para fructanos con grado de polimerización mayor a cinco; por ello, el término inulina de esta metodología en realidad corresponde a los fructanos de maguey (agavinas, según ^{López et al., 2014}). Se encontró que el concentrado del extracto íntegro del segundo tercio del tallo tiene 78.31 % de fructanos de maguey con más de cinco grados de polimerización, y que los contenidos de glucosa y fructosa no fueron detectables (< 0.02 %). La composición del concentrado de fructanos del sobrenadante del tercer tercio de tallo fue similar a la composición del concentrado íntegro del segundo tercio, incluso en su recuperación total (95.03 %), y ambos presentaron también aspecto blanquecino. En cambio, la composición del CF del sedimento del tercer tercio de tallo fue diferente hasta en su aspecto, ya que presentó coloración castaña oscura, contenidos de cenizas totales y sapogeninas mayores y menor porcentaje de recuperación (79.31 %), quizá porque contiene compuestos no identificados ni cuantificados con esta metodología. Con respecto al peso del extracto total, la proporción del sedimento es de sólo 5.6 %, por lo que la centrifugación puede ser una práctica viable para depurar un poco más los fructanos de maguey.

Cuadro 4. Calidad del concentrado de fructanos (CF) de Agave salmiana (libre de humedad). 

ND = No detectable (< 0.002 %)