Introducción

El aguacate (Persea americana Mill.) se clasifica en tres razas botánicas o variedades, de acuerdo a las características morfológicas del fruto: P. americana var. drymifolia, P. americana var. guatemalensis y P. americana var. americana (^{Guzmán et al., 2017}; ^{Ferrer-Pereira et al., 2017}). El aguacate criollo mexicano pertenece a la variedad drymifolia o raza mexicana (^{Ayala & Ledezma, 2014}). Además, variedades comerciales se han generado a partir de cruzas entre las razas, como el aguacate “Hass”, el cual es un híbrido con predominio guatemalensis y rasgos de drymifolia (^{Tremocoldi et al., 2018}) mientras, el aguacate fuerte es un híbrido de las variedades drymifolia x guatemalensis (^{Crane et al., 2013}). El aguacate tiene gran importancia comercial debido al consumo del fruto como alimento a nivel mundial (^{Peraza-Magallanes et al., 2017}; ^{Ferrer-Pereira et al., 2017}).

Por otra parte, el muérdago (Familia Loranthaceae) es una planta hemiparásita de árboles con amplia distribución en zonas urbanas y forestales (^{Díaz-Limón et al., 2016}; ^{Watson, 2017}). En México, el muérdago tiene un alto impacto nocivo sobre el desarrollo y crecimiento de los árboles forestales y frutales y la susceptibilidad a otras enfermedades (^{Azpeitia & Lara, 2006}).

En aguacate de manera particular, se ha observado la afectación principalmente, a árboles var. drymifolia (^{Coria et al., 2015}), a pesar de ser resistente a plagas e incluso ser utilizado como portainjertos de otras variedades (^{Rincón-Hernández et al., 2011}) mientras, las variedades comerciales “Hass” y “Méndez” presentan tolerancia al ataque de muérdago (^{Coria et al., 2015}).

Un mecanismo de defensa de las plantas es la síntesis de sustancias químicas, conocidas como metabolitos secundarios, para la protección contra agentes biológicos invasores, (^{Torres-Gurrola et al., 2011}; ^{Medina-Carrillo et al., 2017}). Se han identificado gran variedad de estos compuestos que sirven para la adaptación y supervivencia de la planta, pero no son esenciales para la vida (^{Wolfender et al., 2015}; ^{Liu et al., 2017}). Algunos autores mencionan la hipótesis de que las plantas que presentan mayor cantidad y combinación de metabolitos secundarios (SM) podrían tener una mayor protección contra patógenos, y que podría deberse a algún compuesto en específico o bien, una combinación de varios (^{Medina-Carrillo et al., 2017}), no obstante, ^{Torres-Gurrola et al. (2011)} rechazan la relación positiva entre la diversidad de compuestos químicos y la defensa contra patógenos.

Derivado de la importancia comercial del aguacate a nivel internacional y del problema que representa el ataque de la planta parásita muérdago contra árboles de aguacate drymifolia, utilizados como portainjertos y poseedores de genes de resistencia a plagas y enfermedades. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el perfil bioquímico de aguacates drymifolia, “Hass” y “Méndez”, con el fin de hacer una exploración a metabolitos secundarios posiblemente relacionados con la tolerancia al muérdago (Familia Loranthaceae).

Material y Métodos

En el presente trabajo, se estudiaron 27 árboles de aguacate var. drymifolia, un árbol de la variedad “Hass” y un árbol de la variedad “Méndez”, procedentes de cuatro localidades de Michoacán, los cuales son 11 de Ziracuaretiro, 10 de Tingambato, seis de Uruapan y dos de Cutzato. El huerto de aguacate tiene una edad de 15 años. El diámetro de las plantas a la base es de aproximadamente 20-25 cm y es manejada bajo un sistema convencional, con riego por microaspersión.

Las hojas maduras fueron colectadas de árboles de aguacate establecidos en huertos comerciales y árboles de traspatio, las cuales, se conservaron a 4 °C hasta su traslado al laboratorio. Se tomaron de 5 a 7 hojas jóvenes y sanas. Se consideró como unidad experimental al árbol de aguacate.

El aislamiento de los metabolitos secundarios se realizó por microextracción en fase sólida (SPME) en un vial de extracción de 10 mL con 200 mg de tejido foliar, al que se eliminó el nervio central y las nervaduras secundarias. El resto de la hoja fue picado finamente con bisturí, y la determinación de los compuestos volátiles se realizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS).

Para la extracción por adsorción de compuestos volátiles, se empleó una fibra de divinilbenzeno/carboxeno/ polidimethilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) de 50/30 µm StableFlex/SS (1cm) (Supelco 57298-U). La desorción se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases marca BRUKER SCION 456-GC con automuestreador CombiPAL, equipado con un inyector de vaporización de temperatura programada (PTV). Además, se utilizó una columna capilar HP-5MS Agilent 60 m x 0.250 mm x 0.25 µm (19091S-436) y detector de masas simple cuádruplo de la marca BRUKER SQ.

La programación de la secuencia de inyección se realizó por precalentamiento de la fibra a 220 °C. Para la adsorción de los compuestos volátiles con la fibra de DVB/CAR/PDMS, se utilizó un aditamento automatizado especial para SPME integrado al automuestreador del cromatógrafo; el cual permitió incubar la muestra foliar picada con la fibra expuesta en el espacio de cabeza a 37 °C durante 10 min con agitación intermitente a 250 rpm y ciclos de 2 s de encendido y 4 s de apagado para lograr la liberación de la mayor cantidad de compuestos volátiles.

Después, la fibra realizó la desorción de los analitos en el inyector PTV a 180 °C durante 2 min. La rampa de temperatura utilizada en el GC fue de 50 °C por 3 min, 120 °C a 5 °C/min por 3 min y 240 °C a 5 °C/min durante 7 min.

Helio grado Ultrapure con un flujo 0.8 mL/min fue utilizado como gas acarreador. Finalmente, la identificación de los analitos se realizó comparando los espectros de masas reportados en la biblioteca NIST (Mass pectral Search Program) Versión 2.0 incluida en el software de equipo.

Resultados y Discusión

En el análisis del perfil bioquímico del tejido foliar de árboles de aguacate var. drymifolia se detectaron 111 diferentes compuestos, en el árbol de la variedad “Hass” fueron 25 compuestos y en el árbol de la variedad “Méndez” fueron 29 compuestos. (Tabla 1).

Se identificó una cantidad mayor de metabolitos secundarios en los árboles de aguacate var. drymifolia, en comparación con reportes previos. ^{Torres-Gurrola et al. (2011)} determinaron el perfil bioquímico de árboles de aguacate drymifolia en tejido foliar, para identificar la relación con la incidencia de insectos formadores de agallas, en el cual, reportaron 33 metabolitos secundarios. En otro estudio sobre la composición química de árboles de aguacate drymifolia, de los bancos de germoplasma en Uruapan, Cupatitzio y Apatzingán, en el Estado de Michoacán, reportan 64 compuestos en 247 árboles evaluados (^{Rincón-Hernández et al., 2011}).

En árboles de aguacate “Hass” se identificaron una cantidad menor de SM (25), en comparación con un estudio previo, en el cual, 34 compuestos fueron detectados en la fracción volátil del extracto hexánico de tejido foliar, de los cuales 32 fueron reconocidos y dos no fueron identificados. (^{García-Rodríguez et al., 2016}).

Por otra parte, hasta este momento no existen reportes en la literatura relacionados con metabolitos secundarios identificados en tejido foliar de árboles de aguacate “Méndez”.

En promedio, cuatro metabolitos secundarios fueron los más abundantes en la variedad drymifolia, de igual manera que en los árboles de las variedades “Hass” y “Méndez”. Las concentraciones relativas de estos compuestos son: estragol 61.2, 68.0 y 81.5 %, cariofileno 19.4, 5.2 y 3.2 %, (+)-4-careno 7.5, 6.8 y 2.7 % y γ-terpineno 6.9, 8.0 y 2.7 % en las variedades drymifolia, “Hass” y “Méndez”, respectivamente (Tabla 1). Estos cuatro compuestos representan 95.0, 88.0 y 90.1 %, en aguacate drymifolia, “Hass” y “Méndez”, respectivamente, del total de metabolitos secundarios identificados en el perfil volátil del tejido foliar de aguacate. La alta similitud de en la abundancia observada de estos cuatro compuestos, entre las variedades de aguacate estudiadas, sugiere que la posible tolerancia a muérdago podría estar relacionada con otros compuestos o factores.

En el trabajo de ^{Rincón-Hernández et al. (2011)} reportan abundancia de estragol en un rango de 75 a 86 %, β-cariofileno, en un rango de 1.4 a 3.1 %, β-pineno, en un rango de 1.3 a 1.8 % y α-pineno, en un rango de 0.8 a 1.5 %, en árboles de la variedad drymifolia.

De manera contraria, en la variedad “Hass”, ^{García-Rodríguez et al. (2016)}, reportaron menor abundancia de estragol, en promedio 1.7 %, en comparación con el 68.0 % reportado en el presente trabajo. En cambio, los compuestos persin (17.9 %), 2-[(8Z, 11Z)-heptadeca-8,11-dienil] furan (15.8 %), escualeno (13.9 %) y nonacosano (11.9 %) presentaron concentraciones medias mayores, mientras que, no fueron identificados en el presente trabajo. La diferencia de abundancia puede deberse al quimitipo de los materiales estudiados en cada estudio (^{García-Rodríguez et al., 2016}).

En los materiales de aguacate var. drymifolia, se observó alta diversidad de abundancia relativa entre los 27 individuos estudiados, principalmente en los compuestos más abundantes. Los rangos de la abundancia de los compuestos estragol, cariofileno, (+)-4-careno y γ-terpineno fueron de 0.39 a 97.00 %, 0.56 a 71.50 %, 0.05 a 27.81 % y 0.60 a 28.63 %, respectivamente. En las variedades “Hass” y “Méndez”, únicamente se estudiaron un individuo de cada uno, de tal manera, que no fue posible determinar los rangos de las concentraciones, no obstante, se estima baja variabilidad en estas variedades comerciales, debido a que, se propagan de manera clonal (^{García-Rodríguez et al., 2016}). Por otra parte, en la variedad “Hass” se identificaron cuatro metabolitos secundarios, 1,3,4,5,6,7-hexahidro-2,5,5-trimetil 2H-2,4aetanonaftaleno (0.84 %), α-cubebeno (0.33 %), 2,4,6-ácido octatrienoico (0.24 %) y α-felandreno (0.21 %), los cuales, no se detectaron en las variedades drymifolia y “Méndez” (Tabla 1).

Existen escasos reportes relacionados con actividades de defensa de los SM. El compuesto estragol tiene actividad antibacteriana, antioxidante (^{Iscan, 2017}), anticancerígena, genotóxica (^{Alhusainy et al., 2012}; ^{Basaglia et al., 2014}) e inductor de callo para la regeneración de plantas in vitro (^{Ibrahim et al., 2011}), mientras, el compuestos cariofileno tiene actividad antibacteriana y antifúngica (^{Selestino-Neta et al., 2017}). No hay reportes de las actividades de los compuestos careno y γ-terpineno.

También, en el aguacate variedad “Méndez”, se identificó el compuesto timol (0.06 %), el cual, no se detectó en árboles de las variedades drymifolia y “Hass” (Tabla 1). La abundancia relativa de estos compuestos fue menor al 1 %, no obstante, al no encontrarse en var. drymifolia, susceptible al ataque del muérdago, los metabolitos secundarios y su combinación, son una oportunidad de estudio en trabajos posteriores, para identificar la posible relación con la tolerancia.

La tolerancia de los árboles de aguacate variedades “Hass” y “Méndez” al ataque del muérdago podría explicarse por la presencia de los metabolitos secundarios 1,3,4,5,6,7-hexahidro-2,5,5-trimetil 2H-2,4aetanonaftaleno, α-cubebeno, 2,4,6-ácido octatrienoico, α-felandreno y timol o bien, la combinación de varios compuestos, los cuales no se encuentran en los árboles de la variedad drymifolia (^{Torres-Gurrola et al., 2011}).

En los árboles de aguacate var. drymifolia, se identificaron 80 compuestos, con concentraciones relativas en un rango de 0.0003 a 1.335 % (Tabla 1), no detectados en los árboles de las variedades “Hass” y “Méndez”. La susceptibilidad o tolerancia de los árboles de aguacate, podría depender no solo del perfil bioquímico del individuo sino también de otros factores complejos como la combinación de compuestos, procesos fisiológicos, la presencia de enfermedades, deficiencias nutrimentales y las diferentes etapas de vida de la planta.

Otro grupo particular de 27 metabolitos secundarios, con concentraciones relativas menores a 2 %, estuvieron presentes en dos o tres de las variedades en estudio (Figura 1). Estos compuestos pueden ser de especial atención porque, 2,5-bis benzaldehído y β-guaieno tuvieron 21.7 y 6.8X, respectivamente, veces más abundancia en “Hass” vs. drymifolia. Además, otros 15 compuestos presentaron de 0.2 a 4.3X veces más abundancia en aguacate “Hass” vs. drymifolia (Tabla 2).

Figura 1 Concentración relativa de metabolitos secundarios identificados en aguacates drymifolia, Hass y Méndez. 1) o-cimeno, 2) Copano, 3) 2,5-bis benzaldehido, 4) Óxido de cariofileno, 5) 1,3,4,5,6,7 hexahidro-2,5,5-trimetil 2H- 2,4a-Etanonaftaleno, 6) β-felandreno, 7) Metil eugenol, 8) α-terpineno, 9) β-cubebeno, 10) Anetol, 11) α-cubebeno, 12) α-copaeno, 13) 2,4,6-ácido octatrienoico, 14) 2-careno, 15) β-copaeno, 16) α-felandreno, 17) Eucaliptol, 18) β-guaieno, 19) 2-metil-naftaleno, 20) 6-etil-1,2, 3,4-tetrahidro-naftaleno, 21) 1-metil-naftaleno, 22) Isolongifoleno, 23) Humuleno, 24) 2,6-ácido difluoro-3-metilbenzoico ácido dodecil éster, 25) Isoledeno, 26) 1,2,3,4-tetrahidro-1,6,8-trimetil-naftaleno, 27) β-cadineno, 28) (±) cadineno, 29) Timol, 30) α-elemeno, 31) (-) - aristoleno, 32) δ-selineno. 

De manera similar, el compuesto 2,5-bis benzaldehído presentó 19.7X veces más abundancia en aguacate “Méndez” vs. drymifolia y otros 23 compuestos presentaron de 0.2 a 5.9X veces más abundancia en aguacate “Méndez” vs. drymifolia (Tabla 2).

La diferencia de abundancia del compuesto 2,5-bis benzaldehído entre las variedades comerciales y var. drymifolia mencionada, sugiere la posibilidad de explorar más a detalle la relación de este metabolito secundario con la tolerancia al ataque del muérdago familia Loranthaceae.

No hay reportes de estos metabolitos relacionados con tolerancia a muérdago, no obstante, en el trabajo en árboles de aguacate “Hass”, reportado por ^{García-Rodríguez et al. (2016)}, identificaron el SM α-cubebeno (4.83 %) en mayor abundancia relativa que en el presente trabajo (0.33 %), el cual presenta actividad antioxidante, antibacterial (^{Nivas & Gaikwad, 2014}) y atrae escarabajos portadores de hongos patógenos para la planta (^{Kendra et al., 2016}). Además, los compuestos α-felandreno y β-copaeno (Tabla 2) tienen actividad antimicrobiana (^{De Santi et al., 2017}), β-guaieneo tiene actividad antiséptica (^{Camacho-Romero et al., 2017}) y β-felandreno tiene propiedad antibacterial, antifúngico y antioxidante (^{Gupta et al., 2017}; ^{Fathy et al., 2017}). En relación a los compuestos 2,5-bis benzaldehído, 1,3,4,5,6,7-hexahidro-2,5,5-trimetil 2H-2,4aetanonaftaleno, y 2,4,6-ácido octatrienoico no existen reportes de alguna actividad en plantas.

Es importante señalar que la mayoría de los trabajos sobre los SM en aguacate, se llevaron a cabo en las partes del fruto, como la semilla, pulpa y cáscara (^{Ikhuoria & Maliki, 2007}; ^{Rodríguez-Carpena et al., 2011}; ^{Ceballos & Montoya, 2013}; ^{Dabas et al., 2013}; ^{López-Cobo et al., 2016}; ^{Figueroa et al., 2018}; ^{Melgar et al., 2018}) y con enfoque en actividades relacionadas con la salud humana (^{Yasir et al., 2010}).

Conclusiones

En el perfil volátil identificado en los árboles de aguacate drymifolia, “Hass” y “Méndez”, los metabolitos secundarios estragol, cariofileno, (+)-4-careno y γ-terpineno presentaron las concentraciones relativas más altas. Sin embargo, al estar presentes en los tres tipos de materiales, estos compuestos fueron descartados como agentes protectores contra el ataque de muérdago.

En árboles de la variedad drymifolia, se identificó una mayor cantidad de metabolitos secundarios en comparación con las variedades “Hass” y “Méndez”. Este es el primer reporte de un alto número de metabolitos secundarios en el material drymifolia.

Los metabolitos secundarios, 1,3,4,5,6,7-hexahidro-2,5,5trimetil 2H-2,4a-etanonaftaleno, α-cubebeno, 2,4,6-ácido octatrienoico y α-felandreno se detectaron en árboles de aguacate “Hass” pero no en árboles de las variedades drymifolia y “Méndez”, mientras el compuesto timol fue identificado solo en la variedad “Méndez”.

El compuesto 2,5-bis benzaldehído se observó con abundancia relativa más alta en los árboles de aguacates “Hass” y “Méndez”, 21.7 y 19.7X más, respectivamente, en comparación con la var. drymifolia. Para determinar el efecto de estos compuestos presentes en “Hass” y “Méndez” exclusivamente, es necesario que se realicen actividades de asilamiento y caracterización sobre el establecimiento y desarrollo de germinación de semillas de muérdago bajo condiciones in vitro.

Este trabajo es el primer acercamiento al perfil volátil en hojas de aguacate var. drymifolia susceptible y árboles de las variedades “Hass” y “Méndez” tolerantes al ataque del muérdago (familia Lauranthaceae) y puede contribuir al mejor entendimiento de los sistemas de defensa del cultivo contra agentes parásitos y optimizar las estrategias de control.