Aislamiento e identificación de los hongos fitopatógenos

Los patógenos fueron obtenidos de plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) variedad Pinto Saltillo con síntomas de marchitez, se recolectaron en campos experimentales de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, las cuales eran cultivadas bajo condiciones de temporal, se tomaron fragmentos de raíces y tallos y fueron sembrados en medio de cultivo PDA e incubados a 26±2°C durante siete días. El hongo F. oxysporum fue purificado mediante cultivos monospóricos y caracterizado fenotípicamente de acuerdo a las características morfológicas descritas por ^{Leslie & Summerell, (2006)}, mientras que R. solani fue purificado por punta de hifa y caracterizado de acuerdo a los criterios de ^{Sneh et al. (1991)}. Los aislamientos fueron conservados a 4°C.

Extracción de DNA de los hongos

Partiendo de cepas axénicas, cada caja Petri con micelio de los hongos se raspó con una espátula tratando de recuperar la mayor cantidad posible, el resultado de cada caja fue depositado en un tubo ependorff, dando un total de cuatro tubos ependorf para cada especie. Al material recuperado, se le agregaron 500μL de buffer de extracción que contenía EDTA 10 mM, Tris HCl 10 mM pH 8.0, SDS 0.5 % y se mezcló por vórtex 15 min. Posteriormente se adicionaron 500 μL de la fase inferior de solución Fenol-Cloroformo (1:1) y se le dio un paso de vórtex por 15 min, centrifugando a 12,000 rpm por 10 min. Se recuperó la fase acuosa en un tubo nuevo y se agregó 1.0 μL de RNAsa (20 mg/mL), incubando por 30 min de a 37°C en el termomix. Se adicionaron 0.33 volúmenes de Isopropanol a -20°C, mezclando suavemente e incubando por 30 min. Para formar la pastilla se realizó la centrifugación a 12,000 rpm por 10 min. Después se decantó el sobrenadante y se lavó la pastilla con 500 μL de etanol al 70 %, posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm por 5 min. Se decantó y la pastilla se dejó secar bajo campana de flujo laminar por aproximadamente 15 min. El DNA fue resuspendido en 25 μL de TE. La integridad y calidad del DNA extraído se verificó en gel de agarosa al 1 %, bajo electroforesis horizontal aplicando un voltaje de 100 volts por 40 min (^{Nicholson et al., 2001}).

Amplificación por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para la amplificación de la región ITS1 e ITS4 (Internal Transcribed Spacer). Se realizó una mezcla de amplificación en un volumen final de 20 μL, compuesto por 13.58 de agua MQ, 2.0 μL de buffer MgCl (10X), 0.32 μL de MgCl₂ (25 mM), 0.4 μL de dNTP´s (10 mM), 0.5 μL de cada iniciador ITS1 (5´TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3´) e ITS4 (5´TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3´) (10μM), 0.5 μL de DMSO, 0.2 μL de DNA Taq-polimerasa 1 U y 1 μL de DNA (40 ng/μL). Las reacciones de amplificación se efectuaron usando un termociclador (Bio-Rad T100™ Thermal Cycler) bajo el siguiente programa: 1 ciclo de 94°C 3 min, seguido de 35 ciclos a 94°C 45s, 53°C por 45s y 72°C 1 min; finalizando con un ciclo de polimerización de 72°C por 7 min. Las bandas amplificadas se observaron en un gel de agarosa al 1.0 % a 90V por 60 min.

Secuenciación de productos de PCR

El producto de PCR fue incrementado y purificado por medio de kit GeneAll^®Expin^TM PCR SV, los cuales fueron secuenciados por el laboratorio Macrogen. Las secuencias obtenidas, se analizaron en la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), usando el programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) para secuencias altamente similares. Cada secuencia obtenida se le depuró la parte inicial y final por razón de aumentar la sensibilidad del análisis.

Biocontrol de R. solani y F. oxysporum con formulados de bacterias endófitas y su efecto en el crecimiento y desarrollo de frijol bajo condiciones de invernadero

Se usaron semillas de frijol variedad Pinto Saltillo libres de cualquier producto químico proporcionadas por el Banco de Germoplasma de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, dos semillas del cultivo en estudio fueron sembradas en macetas de 5 Kg con suelo pasteurizado obtenido en campos de cultivo de frijol de la Universidad antes mencionada. Al momento de la siembra se realizó la inoculación de los fitopatógenos; para el caso de F. oxysporum se empleó una suspensión de 1x10⁶ conidios/mL, para R. solani una suspensión a 1x10⁶ propágulos/mL, preparada al macerar 4 cajas Petri con PDA y crecimiento de R. solani de 14 días de edad en 1 L de agua destilada estéril. Cada especie de hongo se aplicó con una jeringa hipodérmica, depositando un volumen de 25 mL de la suspensión de cada hongo sobre las semillas de frijol. Las bacterias endófitas fueron aisladas y formuladas por la empresa Green Corp Biorganiks de México, S.A. De C.V. Los formulados contienen una mezcla de especies de Bacillus: la diferencia entre los formulados consiste en diferentes acondicionadores en cada una de estas lo que influye en la estabilidad y viabilidad biológica de los prototipos. Se realizaron tres aplicaciones: la primera al momento de la siembra, la segunda después de la emergencia de las plantas cuando alcanzaron alrededor de 15cm de altura y la tercera fue a un intervalo de 15 días posterior a la segunda. Las aplicaciones fueron realizadas con un aspersor manual. Los tratamientos estudiados fueron: (T1) patógeno + bioformulado 1 - 1x10⁶, (T2) patógeno + bioformulado 2 - 1x10⁷, (T3) bioformulado 1 - 1x10⁶, (T4) bioformulado 2- 1x10⁷, (T5) patógeno, (T6) testigo absoluto, cabe mencionar que los experimentos se realizaron por separado, uno para R. solani y otro para F. oxysporum. El experimento fue establecido en un diseño de bloques al azar bajo condiciones de invernadero con siete repeticiones por tratamiento, contando con 42 unidades experimentales, dos plantas por cada unidad experimental, dando un total de 84 plantas para cada experimento. Se optó por usar un diseño de bloques al azar porque las condiciones dentro del invernadero no eran homogéneas ya que el sitio no está acondicionado al 100 %.

Se determinó la incidencia de la enfermedad y fue expresada como porciento de plantas enfermas. La severidad se evaluó con una escala arbitraria de seis clases, donde 0 - Planta con tallos y raíz sanos, 1 - Planta con daño mínimo en tallos y raíces (menos de 10 %), 2 - Planta con daño leve en tallos y raíz (25 %), 3 - Planta con daño medio en tallos y raíz (50 %), 4 - Planta con daño fuerte en tallos y raíz (75 %) y 5 - Planta con tallos muertos (100 %) (^{Castro et al., 2017}). Las variables de incidencia y severidad tuvieron una transformación arcoseno de la raíz cuadrada del valor observado.

Para determinar el efecto de los bioformulados en la promoción de crecimiento y desarrollo de plantas, se midieron algunos parámetros como; altura de planta expresada en cm, diámetro de tallo expresado en mm, además se determinó el contenido relativo de clorofila con un SPAD 502 Plus.

Análisis estadístico

Los resultados fueron procesados por análisis de varianza, la separación de las medias fue mediante la prueba de Tukey con una significancia de p≤0.05. Se utilizó el programa SAS versión 9.5.

Aislamiento y caracterización de los hongos fitopatógenos

Las características morfológicas de F. oxysporum observadas en medio de cultivo papa dextrosa agar fueron micelio algodonoso y de color variable según la edad, desde un rosado a un violeta pálido a las dos semanas. Se observaron en microscopio los microconidios sin septos, ovales, elípticos a reniformes, formados en abundancia en monofialides en forma de botella llamada “cabeza falsa”. Las clamidosporas de posición intercalar o terminal, individualmente o en pares, con una apariencia lisa circular de doble pared. Las macroconidias observadas eran fusoides y alantoides con tres a cinco septos y en forma de gancho. En medio clavel-agar (CLA) se observó micelio hialino, creciendo muy cerca de la superficie del medio, a los 10 días se formaron los esporodoquios en la hoja de clavel. Esta característica corresponde a lo descrito por ^{Leslie & Summerell, (2006)}. Las características de R. solani fueron micelio incoloro cuando joven, pero se volvió amarillento a color marrón claro a las dos semanas de edad, con células alargadas y ramificaciones que crecieron en ángulos aproximadamente rectos a la hifa principal, estaban ligeramente constreñidos en la unión, y tenían una pared transversal cerca de la unión. Ésta característica fue considerada básica para la identificación de Rhizoctonia solani (^{Sneh et al., 1991}). Las secuencias de los hongos comparadas en BLAST identificaron a Fusarium oxysporum strain Af/8/1 con clave de acceso JN624887.1 con 99 % de identidad y a Rhizoctonia solani con clave de acceso JX050236.1 con 99 % de identidad, esto confirma la identificación morfológica de los patógenos.

Biocontrol de R. solani y F. oxysporum con formulados de bacterias endófitas y su efecto en el crecimiento y desarrollo de frijol bajo condiciones de invernadero

Altura de planta y diámetro de tallo

Por otro lado, el análisis del efecto de los bioproductos sobre plantas de frijol inoculadas con R. solani o F. oxysporum reveló que la altura y diámetro de tallo se incrementó en los tratamientos que recibieron aplicaciones de los formulados bacterianos. Los formulados 1 y 2 en ausencia de fitopatógeno sobresalieron por su efecto estimulador del crecimiento de las plantas en estudio. Este efecto estimulador del crecimiento también se apreció en las plantas tratadas con los formulados e inoculados al mismo tiempo con los patógenos (Figura 1). Las plantas inoculadas sólo con el fitopatógeno F. oxysporum o R. solani mostraron un desarrollo más escaso. Es importante mencionar que las plantas crecieron bajo ningún tratamiento químico, por lo tanto no recibieron fertilización por alguna fuente química. Por otra parte estudios recientes realizados por ^{Castro et al. (2017)} demuestran que las bacterias endófitas del genero Bacillus aplicadas como consorcio son capaces de promover el crecimiento vegetal en el cultivo de papa, obteniendo resultados favorables en la altura y diámetro de tallo así como peso fresco de biomasa y de tubérculo. De acuerdo a lo reportado por ^{Santoyo et al. (2015)}, diversos endófitos bacterianos pueden promover el crecimiento de las plantas como consecuencia de los mecanismos directos o indirectos. La promoción directa del crecimiento de las plantas ocurre cuando una bacteria facilita la adquisición de nutrientes esenciales o modula el nivel de hormonas dentro de la planta. La adquisición de nutrients facilitada por los endófitos generalmente incluye nitrógeno, fósforo y hierro. La modulación de los niveles hormonales puede implicar que se sintetiza una o más de las fitohormonas como auxinas, citoquininas y giberelinas. La promoción indirecta del crecimiento de las plantas ocurre cuando las bacterias disminuyen el daño a las plantas después de la infección con un fitopatógeno que incluye algunos hongos del suelo y bacterias. Otros estudios realizados por ^{Ryu et al. (2003)} demostraron que cepas de bacterias endófitas como Bacillus subtilis y B. amyloliquefaciens tuvieron la capacidad de promover el crecimiento significativo en Arabidopsis.

Figura. 1 Efecto de bacterias endofíticas sobre altura de la planta y diámetro del tallo en cultivos de frijol en condiciones de invernadero. [(F. oxysporum; (A) altura, (B) diámetro) (R. solani; (C) altura, (D) diámetro)]. Medias con misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey en p=0.05. Las barras muestran error estándar. 

Contenido de clorofila

Los niveles de clorofila en plantas de frijol se incrementaron notablemente, se demostró el efecto inductor que tuvieron los formulados en la cantidad relativa de clorofila, los formulados 1 y 2 en presencia y ausencia de fitopatógenos manifestaron niveles superiores a los encontrados en los testigos (Figura 2). En este apartado se discute de manera general al no existir reportes donde relacionen el contenido de clorofila respecto al ataque de fitopatógenos. Por lo tanto ^{Turner & Jund, (1991)}, con un modelo de detector de clorofila SPAD502, demostraron que la “unidad SPAD” es un valor proporcional al contenido de nitrógeno, por lo que en este estudio se pretende relacionar el contenido de clorofila en relación al crecimiento vegetal, donde las bacterias endófitas utilizadas al mejorar los niveles de clorofila esto se vea reflejado en el crecimiento vegetal. Los resultados encontrados demostraron que los hongos F. oxysporum y R. solani afectaron significativamente la producción de clorofila, comparados con los tratamientos donde los bioformulados fueron aplicados los cuales indujeron los índices más altos y no se vieron afectados. El contenido de clorofila y la absorción de nitrógeno se han correlacionado con las unidades SPAD en diversas condiciones ambientales como la intensidad luminosa, temperatura, humedad relativa, plagas, densidad de población, fuente de nitrógeno, etc. (^{Hiderman et al., 1992}).

Figura 2 Efecto de la aplicación de bacterias endofíticas sobre el contenido de clorofila, en condiciones de invernadero. [F. oxysporum (A) y R. solani; (B)]. Medias con la misma letra no son significativamente diferentes según el test de Tukey en p=0.05. Las barras muestran error estándar.