Muestreo y procesamiento de la muestra

El muestreo se realizó en otoño del 2019 en la presa San Antonio Huasca de Ocampo, Hidalgo donde se encontraron plantas jóvenes ya que sólo presentaban bulbos globosos unidos a hojas; una parte de las plantas colectadas se fraccionaron en hoja (Ho) y bulbo (B) y a otra parte solo se les retiró la raíz, esta última fue considerada como hoja+bulbo (Ho+B). Posteriormente, los especímenes se sometieron a secado (40 °C por 48 h), molienda y tamizado en una malla con tamaño de poro de 425 µm, las muestras se codificaron y guardaron en un recipiente hermético en la oscuridad hasta su uso.

Análisis proximal

El análisis proximal de las fracciones de las plantas se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita por la Associaciation Official of Analytical Chemists (^{AOAC, 2002}), para lo cual, se cuantificó el contenido de cenizas (No. 923.03), grasas totales (No. 920.39), proteínas totales (No. 960.52), fibra cruda (962.09). Además, se cuantificaron los carbohidratos solubles por diferencia del porcentaje del resto de los componentes.

Composición química

La composición química de las muestras se llevó a cabo de acuerdo a las normas estandarizadas TAPPI (por sus siglas en inglés, Technical Association of Pulp and Paper Industry), se determinó el contenido de pentosanos (T 233 cm-84, 1984), holocelulosa (T 211 om-93, 1993), celulosa (T 212 cm-12, 2015), α y β- celulosa (T 203 cm-99, 2015).

Obtención de extractos

Para la obtención de los extractos se planteó un diseño factorial mixto, los factores evaluados fueron: fracción de la planta (Ho, B y Ho+B), método de extracción (maceración y Soxhlet) y polaridad del solvente (hexano, etanol y agua) (Tabla 1).

En el caso del extracto hexánico y etanólico se tomaron 10 g de harina de E. crassipes tamizada y se adicionaron 150 mL del solvente, mientras que, para obtener el extracto acuoso, la harina de E. crassipes residual del proceso de extracción por Soxhlet con hexano se reutilizó, con la finalidad de aprovechar el residuo y determinar si aún presentaba fitoquímicos con propiedades biológicas, por lo cual, una vez que la muestra se secó a 40 ^ºC por 24 h, se pesaron 10 g de esta harina y se adicionaron 150 mL de agua.

A partir de lo anterior, el proceso de extracción por maceración se llevó acabo durante 2 h a 180 rpm (agitación orbital), al cabo de este tiempo las muestras se mantuvieron en oscuridad por 8 días a 4 ^ºC. Mientras que, el proceso de extracción por Soxhlet se llevó a cabo a una velocidad de 6 flujos/h durante 20 h para hexano (H), 6 h para etanol (E) y 6 h para agua (A). Posteriormente, se realizaron filtraciones sucesivas con papel filtro estándar y filtro whatman No. 4.

Todos los extractos se sometiron a rotaevaporación para su concentración y finalmente se llevaron a sequedad en una estufa de aire forzado a 40 ^ºC por 48 h. Las muestras se conservaron a 4 ^ºC hasta su análisis.

Perfil Fitoquímico

A partir de los extractos obtenidos mediante extracción Soxhlet y maceración se determinó la presencia de alcaloides, sanoninas, flavonoides totales, fenoles totales, taninos, triterpenos, quinonas, cumarinas y carotenoides siguiendo las recomendaciones de ^{Sarker et al. (2006)}, para su posterior cuantificación.

Cuantificación fitoquímica

A partir de los extractos obtenidos mediante extracción Soxhlet y maceración se cuantificó el contenido de alcaloides de acuerdo al protocolo de ^{Shamsa et al. (2007)}; el cual consistió en remover las clorofilas con éter etílico, para posteriormente separar los alcaloides de los compuestos fenólicos empleando cloroformo, para finalmente determinar el contenido de alcaloides obteniendo la absorbancia a 420 nm. Los resultados se expresaron en mg cinconina/100 gramos de extracto seco (ges). Mientras que, para el contenido de flavonoides totales se tomaron 0.5 mL de extracto y se adicionó 0.5 mL de una solución etanólica de AlCl₃ al 2 %. Se incubó 1 h a temperatura ambiente y se leyó a una absorbancia de 420 nm. Los resultados se expresaron en mg catequina/100 ges (^{Kumazawa et al., 2004}).

Para determinar el contenido de fenoles totales se tomaron 50 µL de extracto, se adicionaron 800 µL de agua y 100 µL de Folin-Ciocalteu; se dejaron reposar 8 min y posteriormente se adicionaron 50 µL de Na₂CO₃ al 20 %. Se incubó durante 1 h en oscuridad y se leyó la absorbancia a 760 nm. Los resultados se expresaron en mg ácido gálico/100 ges (^{Singleton y Rossi, 1965}). Por otra parte, se cuantificó el contenido de taninos por medio del protocolo propuesto por ^{Gbadamosi y Kalejaye (2017)}; para lo cual, se tomaron 5 mL de extracto y se disolvieron en 20 mL de metanol:agua al 50 %, la mezcla se homogenizó en baño María a 80 °C por 1 h, se filtró y se adicionaron 20 mL de agua con 2.5 mL de Folin-Ciocalteu, 10 mL de Na₂CO₃ al 17 % y se aforó a 100 mL; se mantuvo en reposo 20 min y se leyó la absorbancia a 760 nm. Los resultados se expresaron en mg ácido tánico/100 ges. En cuanto, al contenido de saponinas a 2 mL de extracto se adicionaron 7 mL del reactivo Liebermann-Burchard, se agitó y se dejó en reposo durante 20 min; se leyó la absorbancia a 528 nm. Los resultados se expresaron en mg saponina triterpénica/100 ges (^{Lozano et al., 2012}). Para el caso del contenido de cumarinas se tomaron 24 mg de extracto seco al cual se le adicionaron 50 mL de metanol:agua (80:20), se realizó una segunda dilución, tomando 8 mL de la solución y se aforó a 25 mL con metanol:agua (80:20) y se leyó la absorbancia a 275 nm. Los resultados se expresaron en mg cumarinas/100 ges (^{Soares e Silva et al., 2012}). Finalmente, el contenido de caroteoides se cuantificó, para lo cual a 0.1 g de extracto se le adicionó 1 mL de una solución acetona:etanol (1:1), se dejó reposar 24 h a 4 °C; se filtró y se transfirió a un embudo de separación adicionando 5 mL de hexano y 2.5 mL de agua, se dejó reposar 30 min y se leyó a 470 nm. Los resultados se expresaron en -caroteno/100 ges. Los resultados se expresaron en μg de β-caroteno equivalente/100 g, empleando el coeficiente de extinción molar de 2500 del β-caroteno. Se emplea como blanco hexano (^{Campos et al., 2006}). Donde: A= Absorbancia de la muestra, V= Volumen total del extracto, A^1% _1cm= Coeficiente de absortividad del β-caroteno (2500), Pmx = Peso de muestra en gramos.

Actividad bacteriostática

La actividad bacteriostática se llevó acabo mediante el método de difusión en agar, para lo cual, se empleó la bacteria Gram-negativa Salmonella sp. y la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aureus. Para este fin, se preparó un pre-inóculo en caldo nutritivo a 37 °C durante 24 h con agitación a 200 rpm. A continuación, se inocularon placas con agar nutritivo y 150 µL del pre-inóculo ajustado a una densidad óptima de 0.2 ( λ = 600 nm), se dispersó homogéneamente usando un asa de Digralsky. Se impregnaron en discos de 6 mm de diámetro previamente esterilizados 5 µL del extracto (100 mg/mL), los cuales se depositaron simétricamente en placas de Petri usando pinzas esterilizadas, y se incubaron durante 24 h a 37 ± 2 °C para determinar el halo de inhibición. El control positivo para las bacterias fue gentamicina (160 mg/2 mL). Los resultados se expresaron como la zona de inhibición (mm) producida por el extracto (^{Tovar-Jiménez et al., 2012}).

Análisis estadístico

El análisis de los datos multivariado se llevó a cabo empleando el software estadístico Statistica versión 7.0 con la finalidad de derminar su diferencia estadísticamente significativa con un nivel de confianza del 95 %.

Análisis químico-proximal

El análisis proximal (Tabla 2), muestra que el mayor componente presente en la harina de E. crassipes, son los carbohidratos (~40 %), seguido del contenido de proteína siendo mayor en Ho (~33 %) y Ho+B (~23 %) que en B (~17 %); en cuanto al contenido de fibra cruda es mayor en B (~21 %) que en Ho (~16 %) y Ho+B (~19 %); para el contenido de cenizas es mayoritario en B (~20 %) que para Ho (~12 %) y Ho+B (~16 %) y finalmente para el contenido de grasas se obtiene (~1 %) para todas las fracciones evaluadas. El análisis estadístico indica que existe diferencia estadísticamente significativa entre cada fracción de la planta y componente evaluado (R² _ajustada:0.9997; p<0.05). Los resultados obtenidos difieren a lo repotado por ^{Gabriel et al. (2018)} ya que mencionan que E. crassipes presenta ~40 % de carbohidratos, proteína del ~10 al 20 %, fibra cruda del ~28 al 35 %, cenizas ~15 % y grasas del ~1 %, estas diferencias se pueden deber a las condiciones del sitio de muestreo y procesamiento de la muestra, época del año y la edad de la planta como lo menciona ^{Tovar-Jiménez et al. (2019)}, cabe mencionar que aunque ya se ha estudiado los componentes del lirio acuático en diferentes zonas geográficas de México es importante conocer su composición químico proximal ya que existen pocos estudios donde se relaciona la época del año con la zona geográfica esto con la finalidad de generar estrategias de aprovechamiento de esta especie, en este sentido, no se encontraron reportes donde se haya analizado las diferentes fracciones del lirio durante otoño en la zona de muestreo de este estudio, así como el estado de madurez de la planta, observando que en general el contenido en proteína, fibra cruda y cenizas es mayor a lo reportado por la literatura (^{Gabriel et al., 2018}; ^{Tovar-Jiménez et al., 2019}).

En la Tabla 2 se muestra el análisis químico realizado a la harina de E. crassipes donde se observa que el componente mayoritario es la holocelulosa en las fracciones evaluadas (~61 %), seguido del contenido de celulosa, siendo mayor en la fracción Ho+B (~47 %) y B (~43 %) mientras que para Ho (~29 %). Con respecto al contenido de α-celulosa es mayoritario para Ho+B (~45 %) y B (~41 %) y menor en Ho (~26 %), la cuantificación de β-celulosa es mayor en Ho (~1.8 %) respecto a B (~1 %) y Ho+B (~1.5 %), finalmente en cuanto al contenido de pentosanos en todas las fracciones evaluadas se encuentra alrededor del 9.7 %. El análisis estadístico indica que existe diferencia estadísticamente significativa entre las fracciones de la planta (R2_ajustada= 0.9989; p<0.05), excepto para el contenido de pentosanos (p>0.05). Los resultados obtenidos coinciden con lo reportado por ^{Das et al. (2016)} y ^{Lara-Serrano et al. (2016)} quienes indican que el contenido de celulosa se encuentra en un rango del 10 al 30 %, cabe mencionar que la celulosa es la suma de α-celulosa y β-celulosa (^{Yuan et al., 2010}) y que las principales diferencias se deben al estado de madurez de la planta, época y zona de muestreo. En cuanto al contenido de pentosanos se reportan valores de 23.7 %, lo cual, es superior a lo encontrado en este trabajo, esto se puede deber a las condiciones y tiempo de reacción para su determinación, al igual que, el estado de madurez de la planta como lo menciona ^{Purbowatiningrum et al. (2017)}. No obstante, la composición del lirio acuático sugiere que es una fuente importante de nutrimentos y que para el procesamiento de la planta es importante tomar en cuenta la época del año, zona geográfica y la fracción de la misma.

Perfil fitoquímico

Los resultados para el análisis cualitativo de metabolitos secundarios presentes en E. crassipes se muestran en la Tabla 3, donde se observa que los extractos obtenidos por maceración y Soxhlet empleando agua fueron positivos para flavonoides y taninos en todas las fracciones de la planta evaluadas, al igual que en los extractos etanólicos obtenidos por Soxhlet. En el caso de alcaloides no se detectó su presencia, mientras que para saponinas y fenoles fueron positivos en lo extractos acuosos, también se detectó la presencia de fenoles en los extractos etanólicos obtenidos por Soxhlet. En cuanto a los triterpenos fueron positivos en los extractos acuosos obtenidos por maceración en las tres fracciones de la planta evaluadas, así como, en los extractos hexánicos y etanólicos de bulbo; y en el extracto etanólico Ho+B, de igual forma, los extractos etanólicos de Ho, B y Ho+B obtenidos por Soxhlet fueron positivos.

Se detectó la presencia de quinonas en los extractos etanólicos y acuosos, resultado del proceso de maceración, al igual que, en los extractos hexánicos, etanólicos y acuosos obtenidos por Soxhlet. Para el caso de cumarinas sólo fue negativo en los extractos acuosos obtenidos por los dos métodos de extracción, así como, en el extracto etanólico empleando Soxhlet y la fracción B. Finalmente, los carotenoides no se detectaron en el extracto acuoso emplendo maceración y B, además de los extractos acuosos empleando Soxhlet, Ho y Ho+B, así como en el extracto etanólico de bulbo obtenido por Soxhlet.

Los resultados de este estudio coinciden con lo reportado por ^{Prabakaran y Mani (2017)} quienes determinaron la presencia de flavonoides, saponinas y triterpenos en el extracto etanólico, mientras que, para el extracto en agua reportan taninos, saponinas, flavonoides, triterpenos y alcaloides, al igual que Kandukuri et al. (2019) quienes reportan alcaloides, saponinas, taninos y triterpenos en extractos etanólicos. ^{Baral et al. (2011)} encontraron saponinas, alcaloides, taninos y triterpenos en extractos con agua. Asimismo, reportan alcaloides en el extracto hexánico (^{Baral et al., 2011}). Por otra parte, ^{Hamid et al. (2013)} utilizaron un solvente no polar reportando alcaloides, flavonoides, fenoles y saponinas en un extracto clorofórmico, mientras que ^{Anusiya et al. (2020)} reporta flavonoides, taninos y saponinas en extractos obtenidos con benceno.

En general, las variaciones de fitoquímicos detectados mediante el método Soxhlet pueden deberse a la concentración del extracto, la época y zona de muestreo y a la edad de la planta. Asimismo, de acuerdo con los resultados obtenidos, se observa mayor variedad de metabolitos en los extractos acuosos en comparación con los extractos hexánicos y etanólicos para los dos métodos de extracción, seguido de los extractos etanólicos obtenidos por el método Soxhlet. Aunado a esto, factores como la temperatura, luz, agitación y concentración de fitoquímicos juegan un papel muy importante en cuanto a su detección (^{Khalid et al., 2020}), ya que se determinó mayor variedad de metabolitos en los extractos mediante Soxhlet (caliente) que en maceración (frío), asimismo los resultados positivos en Ho o B que fueron negativos en Ho+B pueden atribuirse a la concentración presente en cada fracción. No obstante, a pesar de la escasa detección de metabolitos en extractos hexánicos y etanólicos se procedió a la cuantificación de fitoquímicos con la finalidad de comprobar su ausencia.

Cuantificación de fitoquímicos

Los resultados de la cuantificación de fitoquímicos se muestran en la Tabla 4, donde se observa que independientemente de la fracción de la planta y método de extracción el contenido de flavonoides y fenoles totales es superior al resto de los componentes.

El contenido de fenoles totales fue mayor en el extracto acuoso de la fracción hoja obtenido por maceración (749.20 mg ácido gálico/100 ges). De acuerdo con lo reportado en la literatura, los resultados son superiores a lo obtenido por ^{Surendraraj et al. (2013)} quienes emplearon un extracto obtenido por maceración de la fracción hoja de E. crassipes (200 mg ácido gálico/100 gms). De igual manera, los resultados obtenidos para el extracto acuoso de las hojas del lirio acuático usando el método de extracción Soxhlet es superior (301 mg ácido gálico/100 ges) a lo reportado por ^{Rorong et al. (2012)} quienes cuantificaron el contenido de fenoles totales (0.1 mg ácido gálico/100 gms) en un extracto acuoso a partir de las hojas del lirio acuático ocupando el método de maceración.

Respecto al contenido de flavonoides, se observa en la Tabla 4 que el extracto hexánico de la fracción Ho+B obtenido por el método maceración fue mayor (218.39 mg catequina/100 ges) en comparación con el método Soxhlet para la misma fracción (146.64 mg catequina/100 ges), pero similar a lo obtenido en el extracto etanólico para la fracción hoja (217.57 mg catequina/100 ges). ^{Lenora y Senthilkumar (2017)} mencionan que el extracto hexánico de la planta completa de E. crassipes obtenido por método soxhlet presentan flavonoides (10 mg ácido gálico/ g), al igual que lo menciona ^{Rorong et al. (2012)} en un extracto metánolico al 80 % (3.3 mg ácido gálico/g) y ^{Liu et al. (2017)} para un extracto etanólico (16 mg ácido gálico/g).

En cuanto al extracto acuoso, la fracción Ho presentó la mayor concentración de taninos (5.62 mg ácido tánico/100 ges) cuando se obtiene por el método Soxhlet seguido del extracto acuoso obtenido por maceración de la fracción Ho+B (4.43 mg ácido tánico/100 ges). ^{Mohamed et al. (2019)} y ^{Adelakun et al. (2016)} mencionan que el extracto etanólico de la planta completa de E. crassipes presenta taninos (3.13 µg ácido tanico/mg extracto, 0.27 µg ácido tanico/mg extracto, respectivamente).

En relación a los resultados de saponinas se encontró que el extracto acuoso de la fracción B obtenido por el método Soxhlet presenta mayor contenido de este fitoquímico (6.73 mg saponina triterpénica/100 ges). Los resultados obtenidos coinciden con lo reportado por ^{Adelakun et al. (2016)}, quienes emplearon la planta completa y determinaron la presencia de saponinas (1.27 µg /mg muestra seca).

Por otra parte, el resultado del contenido de carotenoides demostró que el extracto etanólico de la fracción Ho obtenido por Soxhlet es el que presenta un alto contenido (10.56 mg β- caroteno/100 ges) en comparación con el resto de extractos evaluados. ^{Kandukuri et al. (2009)} indican que el extracto metanólico E. crassipes presenta carotenoides (1.8 mg de carotenoides/g). Finalmente, para el contenido de cumarinas los resultados muestran que el extracto obtenido por maceración de la fracción Ho presenta mayor concentración (0.97 mg cumarina/100 ges). El análisis estadístico indica que existe diferencia estadísticamente significativa entre los métodos de obtención del extracto y las fracciones de la planta evaluadas (R² _ajustada:0.9996; p<0.05).

En general, estas variaciones en el contenido de fito-químicos pueden ser atribuidas a las condiciones climáticas (temperatura, luz), forma de obtención de los extractos (relación muestra: solvente, velocidad de agitación, polaridad de los solventes, procesamiento de la muestra), la edad y fracciones de la planta a evaluar (^{Azwanida, 2015}; ^{Adelakun et al., 2016}). Por lo anterior, se puede evidenciar que la fracción Ho es una fuente importante de fitoquímicos antimicrobianos, lo cual coincide con lo reportado ^{Surendraraj et al. (2013)} y ^{Rorong et al. (2012)}, sin embargo, es importante determinar su potencial para identificar la fracción más viable para este fin, así como la estrategia a seguir para obtener los mejores resultados bajo las condiciones del estudío.

Actividad bacteriostática

Los resultados de la actividad bacteriostática se muestran en la Tabla 5, donde en general, se observa que los extractos etanólicos y acuosos fueron más eficaces para in-hibir el crecimiento de los microoganismos pátogenos para humanos. El extracto etanólico de la fracción Ho+B obtenido por maceración (halo de inhibición: 18.53 mm) presentó la mayor inhibición de la bacteria S. aureus, al igual que el ex-tracto acuoso obtenido por Soxhlet (halo de inhibición: 18.40 mm). Igualmente, el extracto etanólico y acuoso obtenido por Soxhlet de la fracción Ho (halo de inhibición:11.97 mm, 11.93 mm, respectivamente) y Ho+B (halo de inhibición: 11.50 mm, 11.40 mm, respectivamente) son los que presentan mayor inhibición contra Salmonella sp. El análisis estadístico indica que existe diferencia estadísticamente significativa entre los métodos de obtención del extracto y las fracciones de la planta evaluadas (R² _ajustada:0.9963; p<0.05).

En general, los resutados son similares a los obtenido por ^{Fareed et al. (2008)}, ya que mencionan que los extractos acuosos y etanólicos de hojas de E. crassipes presentan actividad antimicrobiana contra las cepas S. aureus y Salmonella cholerasuis, asimismo, ^{Joshi y Kaur (2013)} evaluaron la actividad bacteriostática de extractos etanólicos y acuosos de la planta E. crassipes obtenidos por el método Soxhlet concluyendo que presentan potencial contra la bacteria gram (+) del género Staphylococcus. Mientras que, ^{Baral et al. (2011)} concluyen que los extractos etanólicos obtenidos generalmente menos sensibles a tener daños en su estructura celular ocasionados por los diferentes mecanismos de acción de los fitoquímicos que cuando se encuentran en la fase exponencial, lo que sugiere que la principal función de los fitoquímicos no es causar daño grave a la pared celular, y por el contrario predomina un proceso autolítico por parte de enzimas celulares de la bacteria, lo que puede inducir lisis celular y un debilitamiento de la membrana como lo menciona ^{Khameneh et al. (2019)}. Asimismo, las bacterias pueden liberar potasio cuando están expuestas a sustancias tóxicas para ellas como los fitoquímicos y de esta manera les permite retardar el daño a su estructura celular; sin embargo, la presencia de flavonas y flavonoles son los causantes de inhibir este proceso e inducir daño celular (^{Meghashri y Gopal, 2012}).