Ciencia de los alimentos

 

Características del almidón de maíz y relación con las enzimas de su biosíntesis

 

Characteristics of maize starch and relationship with its biosynthesis enzymes

 

Edith Agama-Acevedo* , Erika Juárez-García, Silvia Evangelista-Lozano, Olga L. Rosales-Reynoso, Luis A. Bello-Pérez

 

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del IPN. Km 8.5 carr. Yautepec-Jojutla, Colonia San Isidro, Apartado Postal 24, 62731. Yautepec, Morelos, México. *Autor responsable: (eagama@ipn.mx).

 

Recibido: abril, 2012.
Aprobado: noviembre, 2012.

 

Resumen

Las tortillas de maíz azul difieren en sabor y textura de las de maíz blanco. Estas diferencias podrían atribuirse a la dureza del grano o a la estructura del almidón, la cual está influenciada por los mecanismos de su biosíntesis y repercute en la estructura de sus dos componentes principales. El objetivo del presente estudio fue analizar el almidón de maíz azul y blanco en dos etapas de desarrollo del grano, para asociar sus características morfológicas y fisicoquímicas con la estructura, y esta última con las enzimas que participan en su biosíntesis. El maíz se cosechó a los 20 y 50 d después de la polinización (ddp) y el almidón se cuantificó, y se aisló para ser caracterizado. Se extrajeron y separaron por peso molecular las enzimas de biosíntesis del almidón. El análisis de varianza fue de una vía con un nivel de significancia de p<0.05. El maíz azul presentó mayor contenido de almidón. En el estudio electroforético, los dos maíces presentaron bandas con peso molecular reportado para ADP glucosa pirofosforilasa, almidón sintasa unida al gránulo y tres isoformas de almidón sintasa soluble. Además, se encontraron dos isoformas de la enzima ramificante del almidón en el maíz azul, que podrían alterar el patrón de ramificación de su amilopectina, produciendo estructuras altamente ramificadas con cadenas cortas, por lo que la estructura del almidón a los 50 ddp presentó menor espacio disponible dentro de la estructura granular para la síntesis de amilosa, así como cristales pequeños y menos perfectos que se desorganizaron a menor temperatura y entalpía que los del almidón de maíz blanco. La biosíntesis del almidón de maíz blanco y azul difirió, ya que las isoformas de la enzimas ramificante en cada uno de los maíces produjeron estructuras diferentes, lo cual repercutió en sus propiedades fisicoquímicas.

Palabras clave: amilosa, amilopectina, biosíntesis del almidón, maíz azul y blanco.

 

Abstract

Blue maize tortillas differ in taste and texture from white maize. These differences may be due to grain hardness or the starch structure, which is influenced by its mechanisms of biosynthesis and affects the structure of its two main components. The aim of this study was to analyze the blue and white maize starch in two development stages of the grain, to associate its morphological and physicochemical characteristics with the structure, and the latter with the enzymes involved in its biosynthesis. We harvested maize 20 and 50 d after pollination (DAP); and quantified starch content in the kernel, isolated and characterized it. We extracted and separated the starch biosynthesis enzymes according to their molecular weight, and used a one-way analysis of variance at a significance level of p< 0.05. Blue maize had higher starch content. In the electrophoretic analysis, the two maize varieties had bands of molecular weight reported for ADP glucose pyrophosphorylase granule bound synthase starch and three isoforms of soluble synthase starch. Furthermore, we found two isoforms of the starch branching enzyme in blue maize, which could alter the pattern of branching of amylopectin, producing highly branched structures with shorter chains, so that the structure of starch at 50 DAP had less available space within the grain structure for the synthesis of amylose and small and less perfect crystals, which were disorganized at lower temperature and enthalpy than those of the white maize starch. The white and blue maize starch biosynthesis differed as isoforms of branching enzymes in each maize produced different structures, which affected their physicochemical properties.

Key words: amylose, amylopectin, starch biosynthesis, blue and white maize.

 

INTRODUCCIÓN

El almidón es el principal constituyente del maíz (Zea mays L.) y las propiedades fisicoquímicas y funcionales de este polisacárido están estrechamente relacionadas con su estructura. El almidón está formado por dos polímeros de glucosa: amilosa y amilopectina. Estas moléculas se organizan en anillos concéntricos para originar la estructura granular. La distribución de la amilosa dentro de los anillos concéntricos difiere entre el centro y la periferia del gránulo, ya que sólo ocupa los lugares disponibles que deja la amilopectina después de sintetizarse (Tetlow et al., 2004).

La biosíntesis de la amilopectina involucra la participación de las enzimas almidón sintasa solubles (SSS, por sus siglas en inglés), que unen moléculas de glucosa mediante enlaces α 1-4, produciendo cadenas lineales con diferente grado de polimerización (GP). Las enzimas ramificantes del almidón (SBE, por sus siglas en inglés), unen cadenas de glucanos mediante enlaces α 1-6, originando una molécula ramificada. Una vez formada la amilopectina, la almidón sintasa unida al gránulo (GBSS, por su siglas en inglés, granule bound synthase starch) comienza a unir glucosas para sintetizar únicamente las cadenas de amilosa (Baldwin, 2001). Cada una de estas enzimas presenta isoformas (GBSS I y II; SSS I, II, III y IV; SBE I y II, que a su vez pueden ser del tipo "a" o "b"), las cuales difieren en el mecanismo de acción durante la síntesis del almidón, generando estructuras que difieren en el GP de las cadenas lineales, en la densidad y en la longitud de las ramificaciones; estas isoformas pueden o no, estar asociadas al gránulo del almidón. Para almidón de maíz blanco (silvestre, mutantes y modificados genéticamente) se conoce la función de cada una de estas enzimas e isoformas en la síntesis de la estructura en etapas tempranas del desarrollo del grano y su relación con la estructura del almidón en su etapa de madurez (Smith, 2001; Tetlow et al., 2004; Grimaud et al., 2008).

Hay diferencias entre las características químicas, morfológicas, fisicoquímicas y de digestibilidad del almidón de maíz azul y blanco (Hernández-Uribe et al., 2007; Agama-Acevedo et al., 2008; Utrilla-Coello et al., 2009). Al respecto, Utrilla-Coello et al. (2009) separaron las enzimas biosintéticas del almidón con electroforesis bidimensional y las analizaron con MALDI-TOF; las muestras presentaron siete manchas a PM de 60 kDa con pl entre 5-6, y se identificaron como GBSS1. Dicho estudio se realizó en granos maduros (50 d después de la polinización, ddp), cuando la mayoría de las enzimas que sintetizan el almidón han desaparecido, a excepción de la GBSS (Prioul et al., 2008). El objetivo del presente estudio fue analizar el almidón de maíz azul y blanco en dos etapas de desarrollo del grano después de la polinización, para asociar sus características morfológicas y fisicoquímicas con la estructura, y esta última con las enzimas que participan en su biosíntesis.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Se usaron variedades de maíz azul y blanco sembradas en el campo experimental del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CEPROBI), ubicado en Yautepec, Morelos, México, y se cosecharon a los 20 y 50 ddp. El grano azul es un grano suave y el blanco es duro. Del maíz se retiró manualmente el pericarpio, el pedicelo y el germen, para obtener el endospermo, parte de este fue molido y la pasta resultante se pesó en porciones de 2 g, se congeló con nitrógeno líquido y almacenó a —20 °C para realizar el análisis electroforético de las proteínas. El resto de endospermo se secó 24 h a 40 °C en una estufa de convección (Riossa, modelo HS, México). El polvo obtenido se usó para aislar el almidón y realizar su caracterización.

Contenido y aislamiento del almidón en el endospermo

El contenido de almidón se cuantificó mediante la técnica de Goñi et al. (1997). Se aisló el almidón del endospermo con la metodología propuesta por Utrilla-Coello et al. (2009).

Amilosa aparente y distribución de tamaño de los gránulos de almidón

Se cuantificó por el método de Hoover y Ratnayake (2002). La distribución de tamaño de los gránulos del almidón fue determinado por análisis de difracción de rayo láser (Malvern Instruments, modelo 2000, USA).

Propiedades térmicas

Las propiedades de gelatinización se evaluaron con 2.2 mg de muestra en una charola de aluminio y 7 µL de agua desionizada. Las muestras se calentaron en el calorímetro de barrido diferencial (TA Instruments, modelo DSC 2010, USA) desde 0 a 130 °C a una velocidad de 10 °C/min, y se usó un recipiente vacío como referencia. Las muestras fueron analizadas por triplicado. Para medir las propiedades de retrogradación, las muestras gelatinizadas se almacenaron 7 d a 4 °C. Se aplicó el mismo programa de calentamiento utilizado para gelatinización (Bello-Pérez et al., 2005).

Distribución de las cadenas de la amilopectina

Para obtener la distribución de la longitud de cadenas de la amilopectina se usó la cromatografía líquida de alta resolución de intercambio anicónico acoplada a un detector de pulsos anemométricos (CLARIA-DPA) (Dionex Co., modelo DX500, USA) y el método de Chávez-Murillo et al. (2012). La amilopectina fue desramificada con isoamilsa (59 000 U mL^-1, HBL, Japón) y los productos fueron inyectados automáticamente al equipo.

Extracción y purificación de proteínas

La extracción de proteínas se realizó con el método de Borén et al. (2004). Se pesó 1 g de endospermo y se homogenizó con 10 mL de regulador de extracción (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 1 mM de DTT) y después con regulador de lavado (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8; 10 mM DTT; SDS al 2 %). Tras una centrifugación (Centrifuga Hermle Z 383 K, Alemania), al residuo se adicionaron 30 mL de regulador de lavado y se llevó a ebullición por 15 min con agitación constante. Se congeló (—20 °C) por 1 h, y después se descongeló (Congelador FRIGIDAIRE, modelo GLFC1325FW, USA) y centrifugó a 13 000×g/30 min a 4 °C y se recuperó el sobrenadante, al cual se adicionó un volumen igual de una solución fría (4 °C) de ácido tricloroacético: acetona (30:70 v/v), para precipitar las proteínas.

Electroforesis unidimensional en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Previa cuantificación de proteínas mediante el 2 QUANT KIT (Amersham Biosciences), se prepararon geles de poliacrilamida al 8 %, en los cuales se cargaron 10 µg de proteína por muestra. La electroforesis se corrió a 20 mA por gel en un equipo Mini-PROTEAN Tetra system (Copyright® 2009 Bio-Rad Laboratories). Las proteínas se revelaron con azul de coomassie coloidal.

Análisis estadístico

Para determinar las diferencias estadísticas en la caracterización física, contenido de almidón, amilosa, las propiedades térmicas y distribución de las cadenas de la amilopectina de las dos variedades de maices, se aplicó un análisis de varianza de una vía (p< 0.05). Para diferencias estadísticas significativas, las medias se compararon con la prueba de Tukey (p< 0.05).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Almidón total

El contenido de almidón en el endospermo no presentó diferencias significativas 20 ddp entre el maíz blanco y el maíz azul (71g/100 g) (Cuadro 1), pero cuando ambos maíces llegaron a una madurez fisiológica (50 ddp), la acumulación del almidón en el endospermo fue mayor en el maíz azul (81.7 g 100 g^-1) que en el blanco (76.22 g 100 g^-1).

El contenido de almidón en el maíz tiene influencia en las propiedades funcionales y nutricionales de los productos elaborados con este cereal, como las tortillas. El almidón es el producto final de la fijación de carbono durante la fotosíntesis, su contenido en el endospermo de maíz incrementa proporcionalmente con el llenado del grano, esta comienza 8 ddp y continua hasta los 45 ddp, con su madurez fisiológica (Prioul et al., 2008). Li et al. (2007) analizaron el contenido de almidón en el endospermo de maíz blanco en diferentes ddp y encontraron que a partir de los 12 ddp (2 g 100 g^-1) el contenido de almidón incrementó considerablemente hasta permanecer constante después de 30 ddp (88 g 100 g^-1). Una tendencia destacable encontrada en maíz es que a menor contenido de almidón en el endospermo hay mayor contenido de proteínas, y esto a su vez se asocia al tipo de endospermo, los vítreos contienen más proteína que el harinoso, y el endospermo de tipo harinoso presenta más almidón que el vítreo (Serna-Saldivar, 2010). Pero, se desconoce si hay algún tipo de asociación entre estas dos moléculas, si el cese de la biosíntesis del almidón es por restricción de espacio y si esto afecta su estructura.

Amilosa aparente

El contenido de amilosa aparente 20 ddp presentó diferencias significativas entre el almidón de maíz blanco y azul (20.6 y 22.4 g 100 g^-1) de almidón) (Cuadro 1), pero la diferencia fue más marcada a los 50 ddp entre el maíz blanco (32.9 g 100 g^-1 de almidón) y el azul (27.4 g 100 g^-1 de almidón). Además, en el almidón del maíz blanco el incremento de amilosa aparente de los 20 a los 50 ddp fue mayor que en azul. Esto muestra que existen diferencias en el proceso de biosíntesis de esta molécula en los dos tipos de maíces. Considerando que el maíz blanco es un grano duro y el azul uno suave, los resultados concuerdan con lo reportado por Dombrink-Kurtzman y Knutson (1997), quienes sugieren que en un grano duro el contenido alto de amilosa ocasiona que los gránulos de almidón puedan ser comprimidos fácilmente por su matriz proteica, a diferencia de los granos suaves que tiene mas amilopectina. Li et al. (2007) observaron que el contenido de amilosa aumenta paulatinamente con los ddp encontrándose a los 12 ddp 9.2 g 100 g^-1 de almidón, a los 20 ddp 21.4 g 100 g^-1 de almidón y a los 30 ddp 24 g 100 g^-1 de almidón, el cual permanece sin cambio cuando el maíz llega a su madurez fisiológica a los 45 ddp. Es importante señalar que el contenido de amilosa también depende de la variedad, ya que en maíz el intervalo en el contenido de amilosa es 25-35 g 100 g^-1 de almidón, para almidones normales. La variación de los resultados en este estudio indican que la acumulación de la amilosa dentro del gránulo del almidón difiere entre los almidones, esto podría deberse a factores genéticos de cada grano o a la actividad de la enzima GBSS, responsable de la biosíntesis de amilosa, así como a la disponibilidad de espacio libre dentro de la estructura granular después de sintetizarse la amilopectina, lo cual también involucraría la actividad de las enzimas SSS y SBE.

Distribución de tamaño de partícula

La distribución del tamaño de gránulo mostró una distribución unimodal en las etapas de desarrollo analizadas (Figura 1). El tamaño de partícula de los gránulos de almidón 20 ddp fue 11.9 µm y 13.4 µm en el maíz blanco y azul, aumentando ligeramente a los 50 ddp (13.4 µm maíz blanco y 14.9 µm maíz azul). Los gránulos de almidón de maíz cubren un intervalo amplio en cuanto al tamaño de partícula (2-30 µm) y está en función de la terminación de la síntesis del almidón en la etapa de crecimiento en la que se encuentre el grano de maíz, por lo que se ha sugerido que el desarrollo individual de los gránulos de almidón es paralelo al desarrollo del grano de maíz, considerando que gránulos pequeños (<10 µm) son gránulos inmaduros que no han alcanzado su tamaño final (Dhital et al., 2011). En el caso del almidón de maíz blanco se observó que 20 ddp el área bajo la curva con valores menores de 10 µm fue mayor a la observada 50 ddp; es decir, hubo una población de gránulos pequeños considerable que aumentaron su tamaño pero no el número. En el caso del almidón de maíz azul la población de gránulos pequeños incrementó el número y el tamaño, por lo que el mecanismo de biosíntesis del almidón de maíz azul continuó activamente después de los 20 ddp a diferencia del almidón de maíz blanco.

Distribución de las cadenas de la amilopectina

El promedio de la longitud de cadena de la amilopectina fue similar a los 20 y 50 ddp, así como en las dos variedades de maíz (blanco GP≈20 y azul GP≈19) (Cuadro 2). En ambos almidones de maíz, predominan cadenas pequeñas (GP<24), que caracterizan el arreglo cristalino del tipo A de los almidones de cereales. Independientemente de los ddp, el maíz azul presentó mayor porcentaje de cadenas con GP 6-12 y 13-24, pero menor porcentaje de cadenas con GP>25 respecto al maíz blanco.

Dhital et al. (2011) separaron los gránulos de almidón de maíz en función de su tamaño (9, 13, 26 20 µm), encontrando que la mayoría de las distribuciones de la longitudes de cadenas fueron idénticas en los diferentes tamaños de gránulos. Pero en maíz cosechado a 20 y 45 ddp (con tamaños de gránulos aproximados de 10-16 y 23 µm) las cadenas con GP<12 aumentaron de 16 a 19 %, las de GP 1324 no cambiaron, las de GP 25-36 disminuyeron de 15 a 13 % y las de GP>37 disminuyeron de 21.1 a 20.8 % (Jane, 2007).

Este tipo de estudios en almidones ha derivado ciertos patrones en cuanto estructura-propiedades fisicoquímicas; pero hay reportes en almidones con características estructurales similares y que presentan diferencias en sus características fisicoquímicas y viceversa (De la Rosa-Millan et al., 2010; Palma-Rodríguez et al., 2012). Lo anterior, hace suponer que las longitudes de cadenas de la amilopectina son responsables de estas propiedades y también la organización y distribución de ellas dentro de los anillos concéntricos, que conforman la estructura granular, y las interacciones que pudieran tener con la amilosa.

Propiedades de gelatinización y retrogradación

La gelatinización es un fenómeno que involucra la disociación de las dobles hélices de la estructura cristalina de la amilopectina en presencia de agua (arriba del 70 % en base al peso seco de almidón) por efecto de la temperatura. Mayores temperaturas de pico o promedio (Tpg=73 °C) y entalpías de gelatinización (ΔH_G = 10.5 J g^-1 y 8.2 J g^-1 blanco y azul) a los 20 ddp se encontraron con respecto a las 50 ddp (72 °C y 69 °C y ΔH 9.7 J g^-1 y 7 J g^-1, blanco y azul) (Cuadro 3). Hubo una mayor disminución de los valores en estos parámetros de los 20 a 50 ddp en el almidón de maíz azul. Los resultados podrían estar influenciados por el aumento en el contenido de amilosa, lo cual causa la disminución de la proporción de amilopectina, ocasionando que se requiera menor temperatura y energía para gelatinizar el almidón; sin embargo, el almidón de maíz blanco fue el que aumentó en mayor medida la proporción de amilosa, y se esperaría que su Tp_G y ΔHg fueran menores que las del almidón del maíz azul. Pero algunas cadenas de amilosa forman dobles hélices con cadenas de amilopectina individuales o estan entretejidas entre las moléculas de amilopectina, reforzando de esta manera la estructura granular (Tako e Hizukuri, 2002). El almidón de maíz blanco no presentó diferencias en su temperatura de retrogradación (Tp_R) de los 20 a los 50 ddp, pero si un aumento en la entalpia (ΔH_R), lo contrario ocurrió en el almidón de maíz azul. El proceso de retrogradación del almidón de maíz blanco forma cristales con mayor perfección y en menor cantidad que el almidón de maíz azul. El porcentaje de retrogradación (%R) indica la cantidad de re-arreglo estructural del almidón en un tiempo determinado. Los %R fueron mayores a los 50 ddp independientemente del tipo de maíz, pero el almidón de maíz azul presentó altos %R a los diferentes ddp analizados.

Hyun-Jung y Quian (2009) y Shifeng et al. (2009) mencionan que la amilosa es la principal responsable de la retrogradación, debido a que sus cadenas lineales se unen a través de puentes de hidrógeno formando una malla que empieza a crecer o engrosarse conforme transcurre en tiempo de almacenamiento, por lo que a mayor contenido de amilosa mayor retrogradación. Pero Hyun-Jung y Quiag (2009) más que asociar la retrogradación al contenido de amilosa lo asocian con la longitud de sus cadenas.

Relación de las enzimas de biosíntesis con las características del almidón

El análisis electroforético (Figura 2) muestra bandas con pesos moleculares (PM) reportados para las enzimas que sintetizan almidón en un intervalo de 50 a 188 kDa (Grimaud et al., 2008; Zhang et al., 2004; Mu Foster et al., 1996). Ambos maíces mostraron una banda predominante a 55 kDa, que es el PM reportado para GBSSI. Aunque esta enzima es la responsable de la síntesis de amilosa, su actividad depende la formación de la matriz cristalina dada por la estructura de la amilopectina, lo cual pudo ocasionar diferencias en el contenido de amilosa 50 ddp en los dos tipos de maíz (Cuadro 1). Otras bandas fueron: 64 kDa (SSSI), 72 kDa (SSSIIa), 73 kDa (SBE IIb), 76 kDa (SBEI), 100 kDa reportada como glucosa pirofosforilasa y 188 kDa (SSSIII) (Grimaud et al., 2008).

Estos resultados indican que en ambos maíces se sintetizan cadenas lineales cortas con GP 6-12, cadenas intermedias con GP 13-24, cadenas con GP mayores a 24 (Gao et al., 1998), siendo éstas sustrato para las SBEI y SBEIIb que unen cadenas con GP mayor a 10 y cadenas con GP 3-9 (Guan y Preiss, 1993). Lo anterior concuerda con los resultados de longitud de cadena de los almidones analizados (Cuadro 2). Las bandas encontradas en maíz azul con PM de 85 y 90 kDa corresponden a los reportados para SBEIIb (Mu Foster et al., 1996) y SBEIIa (Grimaud et al., 2008). La diferencia entre estas dos enzimas es que la primera transfiere cadenas más cortas que la segunda (Mizuno et al., 2001), lo cual puede causar que la amilopectina del almidón de maíz azul presente mayor número de ramificaciones que la del almidón de maíz blanco, reflejándose en la formación de cristales pequeños que fueron desorganizados a menor temperatura (Cuadro 3), y en espacios menos disponibles para la síntesis de la amilosa dentro de la estructura granular.

 

CONCLUSIONES

El contenido de almidón y amilosa 20 ddp fue similar en ambos maíces, pero 50 ddp el maíz azul acumuló mayor cantidad de almidón y menor cantidad de la cadena de amilosa. La población de gránulos de almidón menores a 10 µm incrementó en número y tamaño en el almidón de maíz azul. Hay dos isoformas de la enzima ramificante en el almidón de maíz azul, produciendo moléculas de amilopectina altamente ramificadas con cadenas cortas dejando menor espacio disponible dentro de la estructura granular para la síntesis de amilosa. El almidón de maíz azul gelatinizó a mayor temperatura y entalpía que el almidón de maíz blanco. La organización y distribución de las cadenas de la amilopectina dentro de los anillos concéntricos que conforman la estructura granular afectan las propiedades fisicoquímicas del almidón.

 

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el financiamiento otorgado por la SIP-IPN, COFAA-IPN, EDI-IPN y CÁTEDRA COCA-COLA. Dos de los autores (OLRR y EJG) agradecen la beca otorgada por el CONACYT-México.

 

LITERATURA CITADA

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