Artículo de investigación original

 

Síntesis y análisis de la biocompatibilidad y osteoconductividad de un composito hidroxiapatita/colágeno, implantado en el sacro de un perro

 

Enrique Martínez Ramírez*, Alejandro Quiroz Garcés**, René Velasco Villareal**, Guillermo de la Rosa Orea*, Manuel González Pérez*

 

* Postgrado en Ingeniería Biomédica, UPAEP.

** Clínica Veterinaria la Paz.

 

Correspondencia:
Manuel González Pérez.
manuel.gonzalez@upaep.mx
Universidad Popular Autónoma del Estado de
Puebla (UPAEP).
21 Sur 1103, Col. Santiago (72410)
Puebla, Puebla.
Tel. 012222299400 Ext. 7672.
Cel. (045) 2221369107.

 

Artículo recibido: 05/febrero/2011.
Artículo aceptado: 19/noviembre/2011.

 

RESUMEN

Se sintetizó un nuevo biomaterial mediante el método de precipitación húmeda con el fin de obtener un injerto óseo capaz de utilizarse en aplicaciones médicas. Se preparó una solución de CaCl₂ 198 mM y una solución 119 mM de (NH₄)₂HPO₄ con agua destilada; ambas soluciones se mezclaron simultáneamente mientras que una solución de NH₄OH era agregada lentamente mediante goteo, finalmente se agregaron 3 ml de colágeno. El precipitado obtenido fue lavado varias veces con agua destilada, filtrado y secado en una incubadora a 40 C. Las muestras fueron caracterizadas mediante difracción de rayos x (DRX), microscopia electrónica de barrido (SEM), espectroscopia de infrarrojo por transformadas de Fourier (FTIR). Se prepararon tres cubos de composito de 10 x 10 x 10 mm³ cada uno, y fueron implantados en el sacro de un perro hembra para comprobar osteointegración y biocompatibilidad, se realizaron estudios histológicos y radiográficos que mostraron el desarrollo de un callo óseo y la formación de hueso nuevo.

Palabras clave: Hidroxiapatita, colágeno, injerto óseo.

 

ABSTRACT

A new material was synthetized using the wet precipitation method to obtain an osseous insert that can be used in medical applications. A solution of CaCl₂ 198 mM and another one with 119 mM of (NH₄)₂HPO₄ dissolved in distilled water were simultaneously prepared with the slowly and continuous addition of NH₄OH dissolved in water. Finally, 3 ml of collagen was aggregated to the solution. The precipitated was washed out several times with distilled wáter, filtered and dried in an incubator at 40 °C. The samples were characterized by X-ray diffraction, surface electronic microscopy, Fourier transformation based infrared spectroscopy. Three different cubes composites with the volume of 10 x 10 x 10 mm3 each one were prepared and implanted into the dtygre sacrum of a female dog to check the osseous integration and the biocompatibility of the new material. Histological and radiographic studies were developed showed the development of osseous callus and the consequent formation of new bone section.

Key words: Hydroxyapatite, collagen, osteon insert.

 

INTRODUCCIÓN

El interés por las cerámicas se ha incrementado dramáticamente desde hace más de dos décadas; a un punto en donde son indispensables tanto en tratamientos ortopédicos¹, aplicaciones dentales²¹⁵ y otros campos muy amplios de la medicina en general^3,4. En el área dental las cerámicas se han utilizado con gran éxito para la creación de implantes y pegamentos para la fijación de prótesis^2,5. Por otro lado, una gran aplicación que se les ha dado es el recubrimiento de metales que son implantados como soportes de fracturas para mejorar la biocompatibilidad y la adherencia de células⁶. Algunas cerámicas se producen de manera especial para resistir condiciones extremas de temperatura o degradación en presencia de líquidos corrosivos sin presentar deficiencias mecánicas o deformación por un largo periodo de tiempo^7,8.

La hidroxiapatita (Hap) es una cerámica policristalina⁹ de fórmula molecular Ca₁₀ (PO₄)₆(OH)₂, tiene una forma de fosfato cálcico¹⁰ que posee la misma composición química del hueso humano, dicha característica la ha convertido en un material sumamente importante para la creación y recubrimiento de prótesis capaces de tener la misma bio-funcionalidad de un hueso natural; sin embargo, ésta por sí sola carece de resistencia y sus propiedades mecánicas no permiten que sea utilizada directamente como un implante, es por eso que la creación de compositos cuya estructura está conformada por materiales orgánicos e inorgánicos^11,12 juega un papel importante para la creación de prótesis capaces de soportar las duras condiciones^7,8,13 de los sistemas biológicos.

Se ha estudiado una gran cantidad de materiales en el área de ingeniería de tejidos, especialmente para la regeneración de tejido óseo incluyendo materiales naturales y sintéticos^14-16. El colágeno¹⁴ es ampliamente utilizado como biomaterial, ya que mejora la biocompatibilidad de los sistemas en los que se usa, al brindar mayor similitud con los tejidos del cuerpo.

El planteamiento teórico por medio de simulación molecular computarizada de reacciones químicas y bioquímicas¹⁷, se ha aplicado con mucha frecuencia con el fin de ahorrar tiempo y recursos económicos que generalmente se gastaban en los métodos de prueba y error^18-21.

En este estudio se preparó un biomaterial a base de hidroxiapatita/colágeno^22,23. La reacción de síntesis fue estudiada en el simulador molecular HYPERCHEM, el cual posee los métodos cuánticos como el semi-empirical, métodos de la mecánica molecular como el AMBER 3, con los cuales es posible determinar propiedades como la polaridad, energía libre de Gibbs, campos electrostáticos, y la optimización de la geometría de las moléculas en cuestión y así predecir condiciones de experimentación.

Las muestras obtenidas fueron caracterizadas mediante difracción de rayos x (DRX), microscopia electrónica de barrido (SEM), espectroscopia de infrarrojo por transformadas de Fourier (FTIR). Para analizar la biocompatibilidad y osteoconductividad se realizaron pruebas biológicas, la implantación del injerto se realizó en la región sacro de un perro hembra de 10 años y 3 kg de peso, estudios radiográficos e histológicos permitieron observar la formación de un callo óseo cubriendo el implante por completo; este callo es una porción orgánica de la matriz ósea y se forma antes de la maduración del hueso²⁴ e indica la consolidación de una fractura.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Simulación molecular

La simulación molecular es una poderosa herramienta para analizar una reacción química, nos permite saber si la reacción se llevará a cabo o no al analizar la energía total del sistema. La Figura 1 muestra la interacción de las tres moléculas dibujadas en la pantalla principal del programa HYPERCHEM, de los reactivos principales; este software calcula la energía total del sistema, polaridad, campos electrostáticos, entre muchas propiedades más que permiten determinar todos los parámetros necesarios para llevar a cabo una reacción química. En el Cuadro 1 se puede apreciar que la interacción de las tres moléculas presenta una energía mucho más negativa con respecto a las energías individuales de cada reactivo, lo que nos indica que el sistema tiende a ser más estable y por consiguiente que una reacción se efectuará.

Síntesis del composito de hidroxapatita/colágeno

El composito de hidroxiapatita/colágeno^22,23 fue sintetizado por el método de precipitación húmeda, usando CaCl₂, (NH₄)₂HPO₄, NH₄OH y atelocolágeno. Se preparó una solución de CaCl₂ 198 mM y una solución 119 mM de (NH₄)₂HPO₄ con agua destilada; ambas soluciones fueron mezcladas simultáneamente, mientras que una solución de NH₄OH era agregada lentamente mediante goteo, finalmente se agregaron 3 ml de colágeno. El precipitado obtenido se lavó varias veces con agua destilada, filtrado y secado en una incubadora a 40 °C, las muestras fueron caracterizadas mediantes difracción de rayosx(DRX),microscopia electrónica de barrido (SEM), espectroscopia de infrarrojo por transformadas de Fourier (FTIR).

Caracterización

Difracción de rayos x DRX

La Figura 2 muestra el patrón de DRX del compostio de hidroxiapatita/colágeno, en el cual se pueden ver los picos característicos 26.5, 28.5, 31.4, 32.7, 34.5, 39.3°, en la escala 2-theta debido a la estructura de la hidroxiapatita cristalina sintetizada, estos valores son similares a los del biomaterial a base de titanio/hidroxiapatita a 26, 28, 31.9, 32.3, 33, 34.2, 39.9.

Análisis FT-IR

En la Figura 3 se muestran los enlaces orgánico-inorgánicos entre la fase de Hap y la matriz de colágeno gracias a las bandas de amidas presentes: amida I en el rango 1640-1760 y las bandas para amida II en el rango 1644-1550. El estiramiento del grupo fosfato se puede encontrar en el rango de 1100-900 e indica la existencia de una fase apatita. En la preparación del composito la fase apatita precipitada está envuelta en la matriz de colágeno a través de la interacción covalente entre los iones de Ca⁺ de la apatita y los iones R-COO^- de las moléculas de colágeno.

SEM

La micro-fotografía SEM, en la Figura 4, muestra la superficie de la muestra seca. Puede observarse la aglomeración de pequeños agregados, los cuales están compuestos de partículas de hidroxiapatita envueltas en matrices de colágeno.

Biocompatibilidad y osteoconductividad del compostio Hap/colágeno in vivo

Material y métodos

Se moldearon tres cubos con un tamaño de 10 x 10 x 10 mm³. El perro fue sedado por la administración intravenosa de tartrato de butorfanol (0.2 mg/kg) y midazolam (0.02 mg/kg). La anestesia se logró administrando propofol (3 mg/kg), y se mantuvo con 2% de isoflurano en oxígeno administrado a través de un tuvo endotraqueal (Figura 5).

Como se ve en la Figura 6, se realizó una fractura en el sacro del perro y tres piezas del injerto sintetizado se colocaron en la zona.

Resultados

Se realizaron estudios radiográficos cada mes con el fin de observar la respuesta al material, la Figura 7, muestra que después de un mes de haber implantado el injerto se observa la formación de un callo óseo debido a la proliferación de células en la superficie del injerto, para el segundo mes el callo reduce su tamaño, esto se debe principalmente al proceso de remodelación llevado a cabo por las células. Este proceso de remodelación continúa hasta el cuarto mes en el cual la fractura sana completamente.

Análisis histológico

Las secciones teñidas con hematoxilina-eosina muestran, en la Figura 8, un fragmento de tejido óseo maduro en corte transversal cubierto por periostio y compuesto de hueso compacto en el que se identifican conductos de Havers rodeados por láminas concéntricas en las que se observan lagunas y láminas intersticiales dividiendo los conductos. Además se observa hueso esponjoso constituido por numerosas trabéculas óseas en las que se identifican numerosas lagunas ocupadas por osteocitos formando la matriz ósea. Las trabéculas óseas están separadas por cavidades medulares en las que se observan células sanguíneas libres en diferentes etapas de maduración sin que se identifiquen tipos celulares individuales. No se observan osteoblastos ni osteoclastos rodeando las trabéculas que sugieran cavidades de resorción ósea, ni células inflamatorias en ninguna sección. Hacia la periferia se observan cúmulos de tejido adiposo y fibras de músculo estriado en corte longitudinal de características normales.

 

CONCLUSIONES

Se sintetizó un composito a base de hidroxiapatita/ colágeno usando el método de precipitación húmeda, las muestras fueron caracterizadas por FT-IR, DRXySEM.Losespectros de difracción de rayos x muestran la estructura cristalina de la hidroxiapatita. Los estudios de FT-IR muestran la formación de una fase apatita interactuando con el grupo amina de la matriz de colágeno

Se llevaron a cabo pruebas biológicas para examinar la biocompatibilidad y osteoconductividad. Los estudios radiográficos muestran la formación de un callo óseo después de un mes de haber implantado las muestras, al cabo de cuatro meses se puede observar la formación de hueso nuevo y la regeneración de la fractura.

Este biomaterial mostró tener buena biocompatibilidad ya que no se presentó infección ni respuesta inflamatoria. Deben realizarse más pruebas para determinar si este material puede ser utilizado para la regeneración de fracturas más severas y en muchas otras aplicaciones médicas.

 

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos sinceramente al Centro de Servicios de Alta Tecnología (CSAT) UPAEP Centro de Física Aplicada y Tecnología Avanzada (CFATA). Clínica Veterinaria la Paz. Diagnóstico clínico e histopatológico, Dra. Adriana Martínez Hernández.

 

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Nota

Este artículo también puede ser consultado en versión completa en: http://www.medigraphic.com/ingenieriabiomedica/