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Introducción
La familia Cactaceae presenta una gran riqueza constituida por cerca de 2000 especies, distribuyéndose desde Canadá hasta la Patagonia (Bravo-Hollis & Scheinvar, 1999). Además, esta familia muestra una alta complejidad taxonómica y variación intra e interespecífica en especies silvestres y cultivadas, obedeciendo en parte a diferentes eventos biológicos como evolución convergente, hibridación, diferentes formas de polinización, aislamiento reproductivo e incremento en niveles de poliploidía (Cota & Wallace, 1996; Palomino et al., 2016). Este último evento es una de las principales causas de especiación para esta familia (Pinkava, 2002).
El género Nopalea (L.) Salm-Dyck pertenece a la familia Cactaceae y está conformado por diez especies (Bravo, 1978). México se considera como el centro de origen y de diversificación, con ocho especies endémicas y una domesticada sin espinas, dispersa en el bosque tropical seco (Griffith, 2004). En el estado de Tamaulipas el género Nopalea se encuentra representado por dos especies N. dejecta y N. cochenillifera, esta última ubicada en la zona centro de Tamaulipas como “Verde Esmeralda o Imperial”. Además, se le puede considerar una especie de suma importancia por su amplia distribución geográfica, encontrándose en México, Brasil, Costa Rica y España. Promoviendo así su amplia diversidad de usos, como fuente de alimento, forraje, biorremediador de suelos y usos medicinales entre otros (Adki, Jadhav & Bapat, 2013; Negrón-Ortiz, 2007; Ramírez-Tobías, Reyes-Agüero, Pinos-Rodríguez & Aguirre-Rivera, 2007; Torres Sales, de Mello Viera Leite & Pereira de Andrade, 2016).
Las plantas de N. cochenillifera (L) son arbustivas, sus cladodios jóvenes son inermes, mientras los viejos presentan algunas espinas cortas; su flor es roja tubular de 5 cm de largo con estambres excertos y es polinizada por colibríes; el tipo de fruta es una baya roja, elipsoide, ovoide y subglobosa de 2.5 cm a 5.0 cm de ancho con escasas semillas; areolas blancuzcas (Bravo, 1978; Lim, 2012).
La poliploidía es un evento con condición hereditaria en donde poblaciones, individuos, tejidos o células presentan un complemento de dos o más juegos cromosómicos por núcleo, considerándose como un mecanismo clave para la evolución de las angiospermas (Castro & Loureiro, 2014; Jiao et al., 2011; Soto-Trejo, Palomino, Villaseñor & Crawford, 2013). Además, crea una variación en la cantidad nuclear de genoma básico (1Cx) ácido desoxirribonucleico (ADN), cambios en el número y estructura en los cromosomas, parámetros claves para el crecimiento de la planta como la duración del tamaño celular, ciclo celular y forma de vida (Bennett 1972; 1987; Gregory, 2005; Murray, De Lange & Ferguson, 2005; Palomino et al., 2016).
Los estudios citológicos han demostrado la frecuencia de la poliploidía en la familia Cactaceae (Cid & Palomino, 1996; Grimaldo-Juárez, García-Velázquez, Ortíz-Cereceres & Ruiz-Posadas, 2001; Pinkava & McLeod, 1971; Powel & Weddin, 2001). El género Nopalea tiene un número cromosómico básico x = 11. Este valor ha sido corroborado con las observaciones de 22 cromosomas en células en metafase en varias especies de Nopalea (Majure, Puente & Pinkava, 2012; Marhold, 2013; Negrón-Ortiz, 2007; Spencer, 1955), sin embargo, también se ha evidenciado que la especie N. lutea o en su sinonimia N. guatemalensis es tetraploide (2n = 44), esta se distribuye en Costa Rica, Guatemala, Honduras y Nicaragua (Majure et al., 2012). El conteo de cromosomas mitóticos y meióticos es el método más usado para determinar la ploidía (Cid & Palomino, 1996; Negrón-Ortiz, 2007; Palomino et al., 2016; Palomino & Heras, 2001). Del mismo modo, la medición del contenido de ADN nuclear por Citometría de flujo (CF) también es un método factible para evaluar los niveles de ploidía (Das, Mohantyht & Das, 2000; Segura et al., 2007). Además, se ha utilizado para observar variaciones inter e intraespecíficas en diferentes grupos de plantas (Bennett, Bhandol & Leitch, 2000; Ohri, 1998; Palomino & Sousa 2000).
La endopoliploidía es definida como la presencia de niveles de ploidía diferentes en un organismo generada por endoreduplicación, evento que es predominante en plantas (Barow, 2006). Se ha corroborado la presencia de diferentes grados de endopoliploidía de acuerdo con el órgano vegetal a estudiar (Cebolla et al., 1999). El patrón endopoliploide es una característica adaptativa que confiere la capacidad de generar células de gran tamaño con altos niveles de ploidía y así almacenar mayor cantidad de agua, otorgando a las plantas una mayor probabilidad de supervivencia en ambientes áridos (De Rocher, Harkins, Galbraith & Bohnert, 1990; Joubès & Chevalier, 2000).
En este trabajo se determinó el contenido nuclear de ADN en picogramos (pg) y en millones de pares de bases de nucleótidos (Mpb), el nivel de poliploidía y el cariotipo en un ecotipo cultivable y dos ecotipos de traspatio de la especie de N. cochenillifera (L.) Salm-Dyck en Tamaulipas, México, con el objetivo de analizar la variación de sus genomas; esta información es necesaria para plantear mejores estrategias de fitomejoramiento, biotecnológicas y de conservación para la especie.
Materiales y Métodos
Material vegetal y sitios de muestreo
Las plantas estudiadas se obtuvieron de una población cultivada de N. cochenillifera ubicada en Gómez Farías, Tamaulipas, sitio localizado a 23°02’ N, 99°09’ O, a una elevación de 350 m s. n. m; otras dos, de poblaciones de traspatio, una ubicada en Villagrán, Tamaulipas 24°28’ N, 99°29’ O a una elevación de 330 m s.n.m. y otra en Ciudad Victoria, Tamaulipas localizada a 23°44’ N, 99°08’ O elevación de 316 m s.n.m. Se recolectaron diez individuos de cada sitio y se mantuvieron en macetas con una mezcla de suelo orgánico y vermiculita durante tres meses en el invernadero del Instituto Tecnológico de Ciudad Victoria para generar el crecimiento de raíces secundarias.
Conteo y análisis de cromosomas mitóticos
Para obtener el nivel de ploidía se cuantificó el número de cromosomas a partir de seis células mitóticas en metafase por población estudiada. Dichas células provenían de meristemos radiculares, los cuales se lavaron con agua corriente y se depositaron en una solución mitostática de 8-hidroxiquinoleina y se mantuvieron en ella, bajo condiciones de oscuridad por 5 h. Este agente actúa impidiendo el avance de la mitosis, por la inhibición en la formación de las fibras del huso acromático. Este procedimiento es importante ya que en la metafase los cromosomas expresan con mayor definición sus formas y tamaños. Enseguida se procedió a fijar el material mediante la inmersión y reposo por un mínimo de 24 h en el reactivo de Farmer recién preparado (alcohol etílico al 96% y ácido acético, en proporción 3:1). La solución fijadora promueve la muerte de las células e impide el crecimiento de microorganismos (bacterias y hongos). El siguiente paso fue hidrolizarlas. Para esto se colocaron en una solución de HCl 1N a 60 °C por 20 min. Nuevamente las raíces se lavaron con agua bidestilada y se procedió a teñirlas con el reactivo de Schiff (Feulgen) durante 30 min en temperatura ambiente y en obscuridad.
El montaje en el portaobjetos se efectuó sobre una gota de propio-orceina al 1.8%, cortando solamente el ápice de la raíz. Posteriormente se disgregó el material vegetativo y se procuró obtener las células en un solo plano. Después de este proceso se llevó al microscopio óptico para observarlas. Al encontrar células mitóticas se procedió a realizar las laminillas permanentes mediante el método del hielo seco y montándolas en bálsamo de Canadá propuesto por Conger & Fairchild (1953). Una vez obtenidas las laminillas permanentes o en fresco se analizaron con detalle en un microscopio óptico utilizando un objetivo de 40x y 100x, seleccionando las mejores células para ser fotografiadas en un Fotomicroscopio Carl Zeiss-Fomi-II.
Determinación del tamaño del genoma y nivel de ploidía
Se utilizaron seis plantas de N. cochenillifera de cada población y se realizaron seis repeticiones por cada planta. Como especie de referencia se utilizó plantas de maíz (Zea mays cv. CE- 777) 2C de ADN = 5.433 pg (Dolezel et al., 1998). El análisis del tamaño del genoma y el nivel de ploidía se realizó en núcleos aislados de la epidermis del cladodio. Se determinó el contenido total de ADN nuclear, el tamaño del genoma en pg y en millones de pares de bases de nucleótidos (Mpb) y los niveles de ploidía mediante citómetro de flujo (CF) modelo Partec CYFlow SL cytometer (Partec, Munster, Germany). La calibración del aparato se realizó con "green beads" (Partec) para corroborar la linealidad del CF. La potencia se ajustó para que el histograma uno represente los núcleos G1 (2C) de N. cochenillifera ubicándose en el carril 100 y así asegurar las condiciones óptimas del CF.
La extracción de los núcleos de las plantas se realizó de acuerdo con la metodología propuesta por Otto (1990), con las modificaciones sugeridas por Dolezel, Greihuber & Suda (2007). En una caja petri conteniendo 3 ml de la solución de Otto-1, se colocaron 500 mg de epidermis de N. cochenillifera previamente lavado por un día, para extraer el mucilago. El material se picó finamente usando una navaja de afeitar y la suspensión se filtró a través de una malla de nylon de 45 µm a 50 µm. Los núcleos suspendidos se centrifugaron a 2000 rpm por tres min, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en 1.5 ml de Otto-1 y se volvió a centrifugar por tres min a 2000 rpm volviendo a re-suspender en 1ml Otto1. Después se tomaron 0.05 ml de la preparación de núcleos y se le agregaron 0.037 ml de una preparación de núcleos de Zea mays (2C= 5.93 pg) que se había obtenido con 50 mg de hoja, empleando el mismo procedimiento de N. cochenillifera. Se adicionaron 2 ml de solución de Otto-2 (0.4 M de Na2 HPO4), agregando 125 µl de RNAasa y una cantidad de 125 µl de yoduro de propidio con una concentración final de 50 µg ml-1. En cada muestra se analizaron al menos 10 000 núcleos. De cada individuo de N. cochenillifera analizado, se realizaron mediciones por triplicado. El tamaño del genoma se calculó mediante la siguiente fórmula:
La composición del genoma se obtuvo: 1pg de ADN= 978 Mpb (Dolezel et al., 2007).
Patrón de endopoliploidía
El patrón de endopoliploidía se corroboró con el parénquima de los cladodios de todas las poblaciones de N. cochenillifera. El número de núcleos se obtuvo por CF, como se describió anteriormente. Como medida de la poliploidía, el valor del ciclo celular se calculó de acuerdo con Barow & Meister (2003).
donde n2C + n4C + n8C son el número de núcleos con el valor C correspondiente (2C, 4C y 8C). se considera que un órgano con un valor de ciclo mayor a 0.1 es endopoliploide (Barow & Meister, 2003).
Análisis estadístico
Las diferencias del contenido de ADN (pg) 1Cx y su composición en Mpb entre los genomas de las tres poblaciones de N. cochenillifera con una réplica aleatoria por población de 35 muestras para Ciudad Victoria (CV), 33 en la población Gómez Farías (GF) y 38 para Villagrán (VG); se evaluaron mediante el análisis de varianza de una sola vía (Anova); si los resultados de estos análisis fueron significativos, se aplicó la prueba de HSD de Tukey-Kramer. Estos análisis se realizaron mediante el paquete estadístico llamado STATISTICA. El modelo consideró las localidades de las poblaciones y las repeticiones en cada planta.
Resultados
Número de cromosomas diploides
En total se analizaron 18 células, de las cuales seis células de la población de Gómez Farías resultaron ser diploides 2n = 2x = 22 con una fórmula cariotípica de 18m + 6 sm (Figura 1A-1B). Mientras que la población de Ciudad Victoria resultó ser tetraploide 2n = 4x = 44 con una fórmula cariotípica de 44 m (Figura 1C-1D). Además, la población de Villagrán resultó ser diploide 2n = 2x = 22, con una fórmula cariotípica de 22 m (Figura 1E- 1F).
Tamaño del genoma y niveles de ploidía
Las tres poblaciones de Nopalea que se estudiaron, mostraron un patrón endopoliploide compuesto de células 2C, 4C y 8C representando tres niveles de ploidía: diploides, tetraploides y octaploides (Figura 2A-2C). Se presentaron tres diferentes porcentajes de núcleos en cada uno de los niveles de ploidía en donde más de 5000 núcleos obtuvieron una cantidad de ADN 2C y 4C, mientras menos de 1000 núcleos presentó una cantidad de ADN 8C (Figura 3). Sin embargo, según el criterio propuesto por De Laat, Gohde & Volgezakg (1987) y De Rocher et al. (1990) se puede establecer que las tres poblaciones son diploides; ya que los picos de los histogramas 2C fue el de mayor frecuencia celular (Figura 2A-2C).
Fuente: Elaboración propia.
Figura 2 Estimación de contenido de ADN nuclear en tres poblaciones de la especie N. cochenillifera mediante el uso de citometría de flujo. (A) análisis simultáneo lineal de núcleos aislados de N. cochenillifera población Cd. Victoria (2n = 22) utilizando como planta estándar Zea mays. El histograma 1, 3 y 5 representan los núcleos G1 (2C), G2 (4C) y 8C de N. cochenillifera. El histograma 2 y 4 representan los núcleos G1 (2C) y G2 (4C) de Zea mays. (B) análisis simultaneo lineal de núcleos aislados de N. cochenillifera población Gómez Farías (2n = 22) utilizando como planta estándar Zea mays. El histograma 1, 3 y 5 representa los núcleos G1 (2C), G2 (4C) y 8C de N. cochenillifera. El histograma 2 y 4 representan los núcleos G1 (2C) y G2 (4C). (C) análisis simultaneo lineal de núcleos aislados de N. cochenillifera población Villagrán (2n = 22) utilizando como planta estándar Zea mays. El histograma 1, 3 y 5 representan los núcleos G1 (2C), G2 (4C) y 8C de N. cochenillifera. El histograma 2 y 4 representan los núcleos G1 (2C) y G2 (4C).
Fuente: Elaboración propia.
Figura 3 Patrón endopoliploide en tres poblaciones de N. cochenillifera diploide (2n = 2x = 22) representando a VG, GF y CV.
De acuerdo con el umbral establecido por Barow & Meister (2003) todas las poblaciones de estudio contaron con patrones de endopoliploidía (Figura 2A-2C) ya que los valores del ciclo celular estaban por encima de 0.1, el más bajo se encontró en la población de CV (0.651), siguiendo la población de VG (0.733) y con el valor de ciclo más alto la población de GF (0.732). Las cantidades de 2C de ADN calculado con base en el cociente del valor de la muestra respecto a la media de los histogramas se observan en la Tabla 1. El promedio del tamaño del genoma para la especie de N. cochenillifera 2C de ADN fue = 4.00 pg con una composición del genoma monoploide 1Cx = 1951 Mpb. El menor contenido de ADN en la población de GF con 2C ADN = 3.90 pg y una composición del genoma 1Cx = 1907 Mpb, siguiendo la población de VG con 2C ADN = 3.91 pg y una composición de genoma 1Cx= 1912 Mpb, por último, el mayor tamaño del genoma correspondió a la población de CV con 4.16 pg y una composición del genoma 1Cx = 2034 Mpb. Hubo diferencia estadística altamente significativas en el contenido de ADN entre la población de CV respecto a la de GF y VG (Prueba de Tukey-Karmer Tabla 1.).
Tabla 1 Contenido nuclear de ADN y cariotipo de N. cochenillifera en tres poblaciones de Tamaulipas, México.
| Localidades | Contenido 2C ADN (pg*) |
Contenido 1Cx ADN (Mpb)** |
Fórmula cariotípica |
Valor de ciclo |
| 1. Cd. Victoria | 4.16 ± 0.05 a | 2034 ª | 44 m | 0.651 |
| 2. Gómez Farías | 3.90 ± 0.06 b | 1907 b | 18 m + 4 sm | 0.733 |
| 3. Villagrán | 3.91 ± 0.039 b | 1912 b | 22 m | 0.732 |
| Promedio | 4.00 | 1951 |
*1pg, 1 picogramo = 978 Mpb (Dolezel et al., 2007).
** Millones de pares de bases de nucleótidos del grupo de cromosomas monoploides (1Cx).
Letras diferentes en el contenido 2C ADN (pg*) y contenido 1Cx ADN (Mpb**) muestra diferencias significativas, como resultado de la prueba de Tukey.
Fuente: Elaboración propia.
Discusión
De acuerdo con la información obtenida del citómetro de flujo se confirma que las poblaciones estudiadas del estado de Tamaulipas, México, son diploides con 2n = 2x = 22. Este estudio ratificó el número cromosómico base x = 11 para el género Nopalea (Tabla 1, Figura 1) coincide con lo que señalan Palomino & Heras (2001) y Negrón-Ortiz (2007), siendo un número común en la mayoría de los géneros de Cactaceae, propuesto por Pinkava, Baker, Parfitt, Mohlenbrock & Worthington, (1985), y por Pinkava (2002). De las diez especies que integra el género, solamente en seis especies se conoce el número cromosómico, de las cuales cuatros son 2n (Majure et al., 2012) y una 4n. Se ha observado que el grado de endopoliploidía varía entre los órganos de la planta y en diferentes tejidos (hoja, fruto, epidermis, raíz, endospermo y embrión) de un mismo individuo (Barow, 2006; Barow & Meister, 2003; Chevalier et al., 2011; Joubés & Chevalier, 2000). La diferencia encontrada para la población de CV entre las células tetraploides en meristemos radiculares y en el contenido de ADN de la epidermis del cladodio se pueda deber a este efecto. El cual indicaría que la mayor cantidad de células que componen el sistema radicular son tetraploides, mientras que las células que componen el parénquima del cladodio son diploides. Aun así, la cantidad células analizadas del sistema radicular no son suficientes para poder definir un grado de polodia. Esto se debió a la gran dificultad de encontrar células mitóticas. Cosendai & Hörandl (2010) muestran dos citotipos 2x y 4x de la especie Ranunculus kuepferi el cual presenta el contenido de ADN nuclear 4.00 pg y 8.20 pg respectivamente, indicando que una población tetraploide puede presentar casi el doble de cantidad de ADN nuclear a comparación de una población diploide. Incluso las medidas obtenidas de ADN nuclear de las poblaciones estudiadas son similares a los valores reportados por Palomino et al., (2016), quienes muestran el contenido de ADN nuclear de Opuntia heliabravoana, heliabravoana diploide 2n = 2x = 22 y un contenido de ADN de 3.81 pg. El valor promedio de las poblaciones estudiadas es de 2C ADN = 4 pg, 1 Cx = 1951 Mpb y patrón endopoliploide con células 2C, 4C y 8C. Este es el primer registro de estos parámetros para la especie N. cochenillifera en México; ya que Negrón-Ortiz (2007) presentó una cantidad de 2C ADN = 1.96 pg y 1 Cx = 959 Mpb para la especie en Costa Rica, no encontrando dicho patrón. Esta diferencia se debe a que ellos utilizaron como órgano de estudio la raíz y otra planta como testigo interno que correspondió a Pisum sativum.
Las poblaciones estudiadas mostraron un patrón endopoliploide según el valor del ciclo celular obtenido. Varios autores han mencionado que este evento es beneficioso para los cactus y suculentas que poseen tamaño de genoma pequeño, siendo favorable para aumentar en las células de parénquima del cladodio la capacidad de almacenamiento de agua (Del Angel, Palomino, García & Méndez, 2006; De Rocher et al., 1990). Del Angel et al. (2006) muestra un patrón similar con 2C, 4C, 8C y 16C en siete especies de Mammillaria y de igual manera Palomino et al. (2016) encontraron un patrón de 2C, 4C y 8C en seis especies del género Opuntia.
Conclusiones
Se muestra el primer registro para México, de los parámetros de contenido 1Cx y 2C del patrón endopoliploide y cariotipo de la especie N. cochenillifera. Se confirma el numero cromosómico base para la familia Cactaceae n = 11. Se encontró que las tres poblaciones estudiadas son diploides, establecido por la mayor frecuencia celular 2C que se presentó en el cladodio de la planta y a la comparación del contenido de ADN con otras especies de esta misma familia. Estos resultados básicos son útiles para establecer estrategias de mejoramiento genético, biotecnológico y de conservación.
