Material vegetal

Se usaron hojas de S. molle colectadas en la Universidad Autónoma Chapingo (19° 29' 24" N, 98° 53' 26" O, 2 250 m de elevación) ubicada en Texcoco, México, durante los meses de noviembre y diciembre de 2018, caracterizados por tener temperatura máxima promedio de 22 °C, temperatura mínima promedio de 7 °C, nubosidad entre 33 y 44 % y precipitación entre 7 y 24 mm. Las hojas se cortaron en sus primeras semanas de desarrollo con base en el grado de coloración y libres de suciedad y daños por factores físicos o biológicos. El contenido de materia seca se determinó mediante secado en estufa (Thermo Scientific 3478, EUA) a 33 °C por 9 días hasta lograr peso constante.

Extracción de aceite esencial

Se utilizaron dos sistemas de extracción. Uno de ellos fue el aparato Clevenger, donde se realizó un procedimiento de hidrodestilación con 100 g de material vegetal en 450 mL de agua en ebullición. El segundo equipo fue una columna de destilación de operación discontinua tipo Rayleigh (^{Seader et al., 2011}), con sección de agotamiento formada por un recipiente de 50 L y una fase de enriquecimiento formada por cinco platos de ebullición (Figura 1). En este sistema, se vertieron 10 L de agua en el recipiente de agotamiento y se aplicó calefacción con vapor proveniente de caldera para llevar el líquido hasta una condición cercana a ebullición. El material vegetal se alimentó en lotes de 2 kg colocados en pequeños sacos de tela organza.

En ambos sistemas, el aceite esencial se recuperó mediante separación por diferencia de densidad en un recipiente colector, se pesó y se almacenó en recipientes herméticos a 5 °C hasta su análisis posterior. En el aparato Clevenger se realizó la extracción a dos tiempos, 60 y 120 min. En la columna de destilación Rayleigh se evaluaron tiempos de proceso de 20, 40, 60, 80, 100 y 120 min. En cada tiempo se determinó volumen de extracción y composición del aceite. Todas las rutinas se realizaron por triplicado. La operación en aparato Clevenger se usó como referencia para evaluar la operación del destilador tipo Rayleigh.

Figura 1 Representación de columna de destilación discontinua tipo Rayleigh. Los números indican alimentación general de agua (1), agua de enfriamiento a condensadores (2,3), sistema de encendido de bomba de vacío (4), termómetro de registro de temperatura de trabajo (5) y válvulas de control de vapor de calefacción (6, 7). 

Evaluación de la composición del aceite esencial

Se usó un equipo de cromatografía de gases (Agilent Technologies® 7890A, EUA) acoplado a un detector selectivo de masas Ion Tramp 240MS (Agilent Technologies®, EUA), provisto de una columna capilar VF-5ms de 30 m de largo, 0.25 μm de diámetro interno y 0.25 mm de diámetro externo. El gas de arrastre fue helio con presión de entrada de 7.91 psi y caudal de 1 mL∙min^-1. Se usó detector de masas de impacto electrónico con corriente de emisión de electrones de 10 μA y tiempo de ionización de 25 ms. El horno se programó a temperatura inicial de 50 °C por 5 min, con incremento posterior de 5 °C∙min^-1 hasta llegar a 150 °C y, finalmente, la condición térmica se incrementó a razón de 20 °C∙min^-1 hasta 250 °C. La temperatura en el inyector, trampa y línea de transferencia fue de 250 °C. La muestra se preparó diluyendo 2 µL de aceite esencial en un volumen final de 1 mL de hexano grado HPLC. Se hicieron inyecciones al equipo por triplicado. El tiempo de corrida fue de 30 min. Los compuestos se identificaron mediante comparación de los índices de retención (RI) con datos de la literatura y sus espectros de masas con los datos del NIST (National Institute of Standards and Technology) almacenados en la biblioteca del ordenador del sistema de cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS). Los alcanos C8-C22 (Sigma®) se usaron como puntos de referencia en el cálculo de los RI, utilizando el método de Kovats (^{Dool & Kratz, 1963}). Los resultados se expresaron en términos de contabilidad de iones fragmentados en el detector selectivo de masas.

Análisis de datos

Con base en el análisis cromatográfico se identificaron cinco grupos de compuestos terpénicos. Los datos de rendimiento y concentración relativa en los extractos de los equipos Clevenger y Rayleigh para tiempos de extracción de 60 y 120 min se sometieron a análisis de varianza en forma congruente con un arreglo factorial 2², alojado en un diseño completamente al azar, y a pruebas de comparación de medias de tratamiento con el estadístico de Tukey (P = 0.05). Asimismo, los datos de rendimiento y concentración relativa de compuestos en los extractos del equipo Rayleigh, obtenidos a los tiempos de 20 a 120 min, se sometieron a análisis de varianza en forma congruente con un arreglo factorial 6×5 alojado en un diseño completamente al azar y a rutinas de comparación de medias con el estadístico de Tukey (P = 0.05), para evaluar la variación de cada grupo de compuestos en función del tiempo de extracción. Todo el análisis se realizó con el programa SAS (^{SAS Institute Inc., 1999}).

Rendimiento de extracción

Las hojas de S. molle tuvieron materia seca de 35.98 ± 0.41 %. La variabilidad en esta característica se consideró baja y con ello se aceptó que el material vegetal era homogéneo. La Figura 2 muestra que el aumento del tiempo de proceso favoreció la obtención de cantidades mayores (P ≤ 0.05) de aceite esencial, lo cual era un resultado esperado que se tradujo en mayor rendimiento de extracción. El efecto del tiempo fue mayor en la operación con aparato Clevenger, donde el rendimiento incrementó a razón de 0.0109 %∙min^-1, mientras que en el destilador Rayleigh, el cambio ocurrió a razón de 0.0069 %∙min^-1. De acuerdo con el Cuadro 1, el rendimiento de extracción fue similar en los dos destiladores al completarse 60 min de operación, pero con 120 min de proceso, el aparato Clevenger permitió mayor eficiencia de recuperación de aceite que el destilador Rayleigh con valores de 1.63 y 1.03 %, respectivamente. Para el mismo tiempo de extracción y usando aparato Clevenger, ^{Volpini-Klein et al. (2021)} obtuvieron 0.6 % de rendimiento de extracción de aceite a partir de hojas de S. molle colectadas en Naviraí, Brasil. No obstante, aun con mayor rendimiento de extracción, el aparato Clevenger tiene su principal aplicación a nivel laboratorio, en la obtención de muestras pequeñas destinadas al análisis cualitativo de aceites esenciales. En contraste, el destilador Rayleigh permite el procesamiento de cantidades significativamente mayores de material vegetal con el que pueden obtenerse proporciones superiores de aceite, lo cual puede ser útil para la implementación comercial de mayor escala. Si se toma como referencia un tiempo de proceso de 2 h, y con base en los datos del Cuadro 1, se calcula que pueden requerirse más de 12 rutinas de extracción con el aparato Clevenger para obtener la misma cantidad de aceite esencial generada por el destilador Rayleigh.

Figura 2 Variación del rendimiento de extracción de aceite esencial de Schinus molle en aparato Clevenger y destilador Rayleigh en función del tiempo de operación de proceso. Los símbolos corresponden a valores medios (n = 3) y las barras de variación a errores estándar. Letras diferentes indican diferencia significativa (Tukey, P = 0.05) al interior de la operación de cada equipo. 

Composición de aceite esencial

Los aceites esenciales se analizaron cualitativamente por GC-MS. La Figura 3 presenta uno de los cromatogramas correspondiente a una muestra del extracto obtenido en aparato Clevenger con 120 min de proceso. Los porcentajes relativos de los componentes identificados en el aceite esencial de hojas de S. molle se presentan en el Cuadro 2 para los dos equipos utilizados y para distintos tiempos de extracción. En total se encontraron 37 compuestos, de los cuales 31 estuvieron presentes en el aceite obtenido con destilador Rayleigh. Cuatro de los compuestos encontrados solo en el extracto Clevenger, rotulados con número romano en la Figura 3 y en el Cuadro 2, se obtuvieron en los dos tiempos de extracción (60 y 120 min); sin embargo, su identidad no se determinó y se trató de compuestos presentes en baja proporción. Los otros dos compuestos también se obtuvieron solo con el destilador Clevenger con tiempo de extracción de 120 min. Uno de ellos se rotuló con la letra a y se identificó como γ-elemeno. El otro, rotulado con la letra b, no se identificó con precisión y se catalogó como un sesquiterpeno oxigenado. Así, en cuanto a número de compuestos, el perfil fitoquímico del aceite esencial con destilador Rayleigh, operado durante 60 min, fue 88.6 % similar que el obtenido con destilador Clevenger, el cual constituye el sistema de referencia, y 83.8 % similar con un tiempo de operación de 120 min. Por otro lado, la similitud fue de 96.2 % para un tiempo de extracción de 60 min, en virtud de que los compuestos rotulados con número romano tuvieron concentración baja, pero se redujo a 87.2 % con un tiempo de 120 min, lo cual se debió a que el compuesto rotulado con la letra b e identificado como un sesquiterpeno oxigenado, tuvo participación de 10.25 % en el aceite. En este sentido, si el equipo Rayleigh constituye una modalidad susceptible de uso en zonas de desarrollo de S. molle, debido al potencial de extracción de cantidades mayores de aceite esencial, será necesario atender tres aspectos: primero, verificar la identidad de los compuestos que solo se obtuvieron con destilador Clevenger; segundo, evaluar la actividad biológica de esos compuestos para determinar la importancia de su presencia en el aceite extraído; y, tercero, mejorar la operación del destilador Rayleigh para incrementar la similitud con respecto al aceite obtenido con destilador Clevenger.

Figura 3 Cromatograma obtenido por cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) correspondiente a aceite esencial de Schinus molle extraído con aparato Clevenger en un proceso de 120 min. Los números arábigos corresponden a compuestos detectados también con destilador Rayleigh. Los números romanos se asignaron a compuestos identificados solo en extracto de aparato Clevenger. Las letras a y b indican compuestos registrados solo con operación de 120 min en aparato Clevenger. La identidad de los compuestos numerados se especifica en el Cuadro 2. 

Con respecto a los compuestos encontrados en los aceites extraídos con ambos equipos, 16 fueron plenamente identificados. Del resto, aunque nueve no se identificaron con precisión, fueron catalogados dentro del grupo de los sesquiterpenos (tres) y sesquiterpenos oxigenados (seis) con base en su peso molecular. En general, se identificaron cinco grupos de compuestos terpénicos: monoterpenos, monoterpenos oxigenados, sesquiterpenos, sesquiterpenos oxigenados y otros compuestos; el Cuadro 3 indica su composición relativa en las condiciones de extracción evaluadas. Acorde con el Cuadro 4, el análisis estadístico mostró diferencias en la participación relativa general de cada grupo. Entre los compuestos identificados, el grupo de mayor presencia fue el de los monoterpenos (66.16-78.40 %), seguido por los sesquiterpenos oxigenados, luego por los sesquiterpenos y, finalmente, por los monoterpenos oxigenados en pequeña concentración. De forma similar, ^{Volpini-Klein et al. (2021)} identificaron monoterpenos como el principal grupo presente, seguido de sesquiterpenos, en aceite esencial de S. molle a partir de hojas colectadas en Naviraí, Brasil. No obstante, ^{Phiri et al. (2021)} encontraron que el grupo de sesquiterpenos estaba en mayor proporción que los monoterpenos en hojas de S. molle colectadas en Palapye, Botswana, lo cual confirma que la composición puede variar entre regiones.

La operación del destilador Rayleigh se evaluó en rangos de 20 a 120 min. Este factor no afectó la presencia relativa de compuestos terpénicos, aunque el análisis estadístico mostró que hubo interacción significativa entre los factores de variación, dados por el tiempo de extracción y el tipo de compuesto (Cuadro 3). La razón de esto es que los monoterpenos y sesquiterpenos no modificaron su presencia relativa en función del tiempo de extracción, pero sí lo hicieron los monoterpenos oxigenados y los sesquiterpenos oxigenados. Los monoterpenos oxigenados solo se identificaron en los extractos con 100 y 120 min de proceso. En el caso de los sesquiterpenos oxigenados hubo diferencias entre los tiempos de extracción, pero en realidad no se observó una tendencia clara, aunque el contenido en las muestras con 120 min de proceso fue notoriamente menor. Por otro lado, la presencia relativa de compuestos no identificados no varió en función del tiempo de extracción. Si bien el grupo de los monoterpenos fue el de mayor presencia en todos los tiempos de extracción, la identificación del segundo y tercer grupo tuvo un comportamiento muy variable. Las muestras correspondientes a tiempos de extracción entre 20 y 100 min tuvieron como segundo grupo más importante al de los sesquiterpenos oxigenados (6.81-13.85 %) y como tercer grupo al de los sesquiterpenos hidrocarbonados (5.6-10.86 %). En contraste, en la rutina de extracción de 120 min, el orden de presencia se invirtió; el grupo con mayor presencia fue el de los sesquiterpenos hidrocarbonados (8.76-12.43 %) y el tercero pasó a ser del grupo de los sesquiterpenos oxigenados (2.67-4.37 %). La presencia significativa del grupo de los monoterpenos oxigenados se detectó a partir de 100 min de extracción, siendo el anetol el único compuesto identificado de este tipo. Los compuestos con mayor presencia fueron α-felandreno (21.20-28.57 %), limoneno + β-felandreno (19.07-27.78 %), canfeno (3.32-9.93 %), α-pineno (5.74-8.56 %), β-mirceno (2.95-6.91 %) y β-pineno (1.31-3.55 %) que en conjunto representaron de 62.09 al 73.36 % del total del aceite esencial, todos ellos pertenecientes al grupo de los monoterpenos hidrocarbonados.

En el caso del aceite esencial extraído con destilador Clevenger, resalta la presencia del compuesto b obtenido con 120 min de extracción. Este se catalogó como un sesquiterpeno oxigenado; sin embargo, aunque tuvo participación de 10.25 %, la confirmación de su identidad requiere más trabajo de investigación. Los resultados coincidieron parcialmente con información disponible de la región de Mograne (noreste de Túnez), donde los componentes principales del aceite esencial de hojas de S. molle fueron α-felandreno, limoneno + β-felandreno, mirceno y α-pineno (^{Zahed et al., 2010}). Asimismo, ^{Phiri et al. (2021)} encontraron limoneno, elemol, α-felandreno y aromadendreno como los principales compuestos en hojas colectadas en Palapye, Botswana. Por otro lado, ^{Ennigrou et al. (2011)} reportaron α-felandreno, β-felandreno y α-pineno como compuestos mayoritarios en el aceite esencial de hojas de S. molle colectadas en El Ghazala, al norte de Túnez. En Argelia, el aceite esencial de S. molle presentó α-felandreno, β-felandreno, elemol y limoneno (^{Belhamel et al., 2009}). En la región de Évora, en el sureste de Portugal, ^{Martins et al. (2014)} reportaron α-felandreno, limoneno, β-felandreno, β-mirceno y α-pineno como principales compuestos en el aceite esencial de S. molle. Otros estudios señalan diferencias cualitativas más notables; Abdel-Sattar et al. (2010) reportaron p-cimeno, α-terpineno y β-pineno como los principales compuestos volátiles en el aceite esencial de hojas de S. molle y, en Porto Alegre, Brasil, ^{Pawlowski et al. (2012)} informaron que dos variedades de S. molle tuvieron como compuesto mayoritario a α-pineno y también encontraron limoneno y β-pineno. En Tacares, Costa Rica, ^{Díaz et al. (2008)} identificaron β-pineno y α-pineno como compuestos mayoritarios.

Con base en lo anterior, en el presente estudio, los componentes principales del aceite esencial de hojas de S. molle, colectadas en la región central de México, fueron similares a los perfiles fitoquímicos reportados en Túnez y Portugal. El compuesto γ-terpineno se detectó hasta los 120 min de extracción; α-terpinoleno (0.25-0.32 %), en el rango de 40 a 100 min; y γ-muuroleno (0.28-1.70 %) solo en el rango de 20 a 60 min. El grupo con mayor variación fue el de los sesquiterpenos oxigenados, en los cuales hubo compuestos no identificados (compuestos 21, 22, 23; Figura 2) que únicamente se detectaron en un tiempo de extracción, lo que sugiere que este factor no tuvo influencia para esos compuestos y dicha inconsistencia requiere de mayor evaluación experimental para su clarificación. Los compuestos no identificados representaron 8.38 a 11.28 % del total del aceite.

Ennigrou et al. (2011) mencionaron que la composición química del aceite esencial de hojas de S. molle varía considerablemente dependiendo del origen genético, el origen del cultivo, la temporada, la parte de la planta analizada y los métodos de extracción. En forma similar, ^{Volpini-Klein et al. (2021)} mostraron que la composición depende de la época de colecta del material vegetal, pero también del método y tiempo de extracción. Por otra parte, se ha sugerido que las diferencias en los patrones de composición del aceite esencial se deben probablemente a la generación de varias rutas metabólicas en el metabolismo secundario de S. molle (^{Zahed et al., 2010}).

Por otro lado, el número de compuestos del grupo de sesquiterpenos oxigenados disminuyó para el tiempo de extracción de 120 min, ya que de los seis posibles compuestos detectados solo se registró el identificado con el número 25 (Figura 2). Al respecto, ^{Lucchesi et al. (2004)} mencionaron que hay pérdidas de compuestos volátiles y degradación de compuestos insaturados o éster, producto de efectos térmicos o hidrolíticos al momento de la extracción de aceites esenciales usando métodos como hidrodestilación, destilación por arrastre de vapor y extracción Soxhlet. Dichos autores también señalaron que la reducción en el tiempo de extracción no implica que algunos compuestos no se logren extraer, sino que se minimiza la degradación por hidrólisis, transesterificación u oxidación y, por tanto, se aprecian menos productos de degradación en el perfil. En el presente trabajo se detectó presencia de anetol solo en los tiempos más prolongados de extracción de 100 y 120 min. Al respecto, los tiempos de 120 min fueron los primeros en usarse para la extracción, por lo cual no puede descartarse una contaminación con los componentes de otro aceite esencial residual en la columna de destilación. Por otra parte, si bien el uso de destilación Rayleigh permite la obtención de un aceite esencial muy similar al obtenido con el aparato Clevenger, será necesario completar la identificación de los compuestos no presentes en la operación de mayor escala, para valorar el impacto sobre la actividad biológica del producto obtenido.