Introducción

La vainilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) es una de las tres especies del género Vanilla que se cultivan comercialmente, con 98 % de la producción comercial mundial, y es la de mayor importancia por las propiedades organolépticas de su fruto (^{Besse et al., 2004}).

El fruto de la vainilla al ser cosechado carece de aroma, por lo que debe someterse a un beneficio para adquirir aroma, brillo, color y textura. De manera general, este proceso consta de cuatro pasos: escaldado, soleado/sudado, secado y acondicionado (^{Odoux & Grisoni, 2011}). De acuerdo con ^{Dunphy y Bala (2011)}, los principales elementos que definen la calidad del fruto beneficiado son: a) perfil genético del fruto, b) origen geográfico, suelo, clima y condiciones de crecimiento (riego y nutrición), c) estado de madurez a la cosecha, d) condiciones del proceso de beneficio, y e) balance entre los compuestos del aroma, específicamente entre el contenido de vainillina y el de compuestos menores (ácido p-hidroxibenzoico, ácido vainillínico y p-hidroxibenzaldehído) (^{van Dyk, Barry-McGlasson, Williams, & Gair, 2010}). La combinación de estos elementos contribuye a forjar las características organolépticas de la vainilla.

Los frutos verdes de la vainilla contienen diferentes precursores del aroma, la glucovainillina es uno de los más importantes y se acumula en los frutos desde las 15 a las 30 semanas después de la polinización (^{Havkin-Frenkel, Podstolski, Witkowska, Molecki, & Mikolajczyk, 1999}). Tradicionalmente, los productores realizan la cosecha cuando la parte distal del fruto se torna amarilla, lo que consideran como un índice de cosecha adecuado. Sin embargo, no existen trabajos que muestren que la calidad del fruto cosechado bajo este índice sea superior, ni tampoco se ha probado la influencia de la edad a la cosecha en la calidad organoléptica del fruto de vainilla beneficiado.

Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar la calidad del fruto de vainilla a los 224, 252 y 273 días de edad (32, 36 y 39 semanas, respectivamente), y su relación con el perfil de aroma de la vainilla beneficiada.

Materiales y métodos

La plantación comercial de la vainilla estudiada en este trabajo se ubica en la localidad de Puntilla Aldama, perteneciente al municipio de San Rafael, Veracruz, México (20° 14’ 4.49’’ latitud norte y 96° 54’ 13.75’’ longitud oeste, a 12 msnm). La temperatura promedio de esta localidad es de 22.5 °C y su humedad relativa de 90 % (^{Servicio Meteorológico Nacional [SMN], 2017}). El cultivo se estableció en el año 2000 bajo el sistema de malla sombra con tutores vivos de zapote reventador (Pachira aquatica) y pichoco (Erythrina coralloides), en un suelo tipo luvisol. Dentro de las principales actividades de manejo, se realizaron podas frecuentes al tutor para controlar el porcentaje de sombra y el encauzamiento de la vainilla sobre las ramas del tutor, limitando la altura del binomio a dos metros. Adicionalmente, se tomaron datos de temperatura de la estación meteorológica de Martínez de la Torre (DGE)-VER ubicada a 24.8 km de la plantación.

Durante el periodo de floración, entre abril y mayo de 2015, se seleccionaron una o dos flores por planta sana de V. planifolia y se polinizaron manualmente, dando un total de 100 flores. Los tres tratamientos se definieron por la edad del fruto a la cosecha: 224, 252 y 273 días después de la polinización (ddp) (32, 36 y 39 semanas, respectivamente); para lo cual se estableció un diseño completamente al azar.

La cosecha se realizó durante diciembre de 2015, enero y febrero de 2016. A los 273 ddp, la mayoría de los frutos mostraban amarillamiento en la parte distal (Figura 1). Por otro lado, se recolectaron frutos de vainilla como referencia, donde se tomó como índice de cosecha el cambio de color de la parte distal del fruto.

Figura 1 Frutos de Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews cosechados a los a) 224, b) 252 y c) 273 días después de la polinización. 

Por cada fecha de cosecha se tomaron 30 frutos para su beneficio o curado, y 10 frutos más para realizar evaluaciones de calidad en estado verde. El peso promedio de cada fruto verde fue de 9 a 15 g, con un tamaño de 15 a 20 cm. El proceso de beneficio de todos los frutos, incluyendo los de referencia, se realizó en el “Beneficio la Alternativa” en la localidad Primero de Mayo, Papantla, Veracruz.

El beneficio inicia con el matado del fruto de vainilla (inmersión en agua a 70 °C de 5 a 6 s), posteriormente, los frutos se acomodan en cajones de madera y se cubren para mantener la temperatura alta (45 a 65 °C) por 12 h, a esta actividad se le denomina sudado y proporciona las condiciones para la producción de compuestos aromáticos. Después del sudado, los frutos se exponen al sol hasta alcanzar 45 °C, y nuevamente se colocan en los cajones para que suden. Esta operación cíclica se repite entre 20 y 30 veces, hasta obtener un fruto beneficiado entero sin daños físicos, flexible, color café rojizo a café oscuro brillante, con 25 a 30 % de humedad y aroma agradable. Finalmente, la vainilla beneficiada se almacena en bolsas de plástico hasta su comercialización (^{Mariezcurrena, Zavaleta, Waliszewski, & Sánchez, 2008}).

Variables evaluadas

Las variables evaluadas en todos los frutos fueron: materia seca (%), humedad (%) y azúcares solubles totales (%; glucosa, fructosa y sacarosa); adicionalmente, en frutos beneficiados se midió la concentración de los cuatro compuestos principales del aroma (p-hidroxibenzaldehído, ácido p-hidroxibenzoico, vainillina y ácido vainillínico), expresados como mg ·kg^-1.

Materia seca (MS) y humedad (H): Se pesaron 500 mg de fruto y se colocaron en charolas dentro de una estufa (Lab-Line Imperial^®, AM, Inc, USA) con aire forzado a 80 °C por 48 h, hasta llegar a peso constante. Posteriormente, con el porcentaje de humedad se calculó el contenido de MS.

Azúcares solubles totales (AST): Se cuantificaron con la metodología de ^{Mustafa, Mustafa, Mustafa, y Mhemet (2003)}, con algunas modificaciones. Se tomó una porción de la parte media de cada fruto, se molió finamente con un molino de carga (Krups Gx4100 de 25,000 rpm), se pesaron 100 mg y se adicionaron 3 mL de etanol a 80 % (v/v); la muestra se incubó en baño María a 80 °C por 10 min. Este proceso se repitió sucesivamente cinco veces, y los extractos obtenidos se colocaron en una estufa a 55 °C por 24 h hasta sequedad. Posteriormente, el residuo se resuspendió con 2 mL de agua destilada. Esta muestra se almacenó a -20 °C hasta su análisis.

Para cuantificar los azúcares, se tomó 1 mL de cada extracto y se filtró en cartuchos de limpieza (Cromabond C18ec, 3 mL ·500 mg^-1, 60Å, 45 µm). Para ello, se acondicionó el cartucho con 6 mL de metanol y luego 6 mL de agua grado HPLC, posteriormente, se hizo pasar 1 mL de muestra y se realizó un lavado con 3 mL de agua grado HPLC para asegurar la elución de todos los azúcares. Ambos filtrados se mezclaron y se llevaron a un volumen de 5 mL; de aquí se tomó 1 mL y se filtró con un acrodisco (Titan, 0.45 μm). El filtrado se colocó en un vial y se analizó por HPLC (High Performance Liquid Chromatography; Series 200, Perkin Elmer^TM) con automuestreador y detector de índice de refracción. Se utilizó una columna Pinnacle II Amino de 5 mm 150 x 4.6 mm (Restek^TM), y la fase móvil fue una solución de acetonitrilo:agua (80:20, v/v) con tiempo de corrida de 14 min.

Para las curvas de calibración, se diluyeron por separado 0.05 g de fructosa, glucosa y sacarosa al 99.5 % (todos de Sigma-Aldrich, USA) en 10 mL de metanol:agua (1:9, v/v) y se realizaron las diluciones correspondientes (0.15 a 5 mg ·mL^-1). Las condiciones del cromatógrafo fueron 35 °C, flujo de 1 mL ·min^-1 y volumen de inyección de 10 µL. Los resultados se reportaron como porcentaje de azúcares en base seca.

Compuestos del aroma: Se cuantificó el p-hidroxibenzaldehído, ácido p-hidroxibenzoico, ácido vainillínico y vainillina de acuerdo con el método de ^{Cicchetti y Chaintreau (2009)}, con algunas modificaciones. Se pesaron 0.05 g de muestra molida y se agregaron 18 µL de solución etanol-agua destilada (1:1) (alcohol etílico absoluto anhidro grado HPLC); esta solución se preparó 24 h antes y se mantuvo en refrigeración (4 °C). Posteriormente, la mezcla se agitó por 30 min en una parrilla digital (6 stir, Thermo Scientific^TM, Cimarec^TM, USA) y nuevamente se refrigeró por 24 h. Transcurrido este tiempo, la muestra se agitó 5 min y se filtró 1 mL con acrodisco (Titan, 0.45 μm). El filtrado se colocó en un vial de 2 mL y se llevó al HPLC con detector UV a 254 nm. Para el análisis se utilizó una columna tipo Silica C18 de 5 µm 240 x 4.6 mm (ACE^®), con tiempo de corrida de 20 min y volumen de inyección de 10 µL.

Para la cuantificación, se prepararon soluciones estándar de ácido p-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído y ácido vainillínico (ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzóico) de 0.1 a 10 µg ·mL^-1, y vainillina (3 metoxi- 4-hidroxibenzaldehído) (Sigma-Aldrich^®, USA) de 0.5 a 45 µg ·mL^-1.

Resultados y discusión

El fruto de vainilla alcanza su tamaño final entre las 10 y 15 semanas después de la polinización, y no se observan cambios significativos en su apariencia hasta que inicia el amarillamiento y dehiscencia de la parte distal (^{van Dyk et al., 2014}). Por ello, los productores no pueden estandarizar un índice de cosecha, sino hasta que observan el cambio a color amarillo, lo que ocasiona que la calidad aromática de la vainilla beneficiada sea muy variable.

El contenido MS y humedad mostró diferencias notables en frutos verdes; por ejemplo, el contenido de MS fue significativamente mayor (P ≤ 0.05) en frutos de 224 y 273 días en comparación con los de 252 ddp (Cuadro 1). Es interesante notar que el contenido de MS en los frutos de referencia del productor es similar al de 224 días. Aunque la edad del fruto pudiera considerarse un parámetro confiable para determinar un índice de cosecha, los cambios de clima en la zona pueden afectar las reservas de MS, lo cual puede explicar, en parte, porque los productores tradicionalmente evitan cosechar en enero.

De acuerdo con el SMN (2017), durante el periodo de cosecha de los frutos de 224 días, la temperatura media fue de 21.2 °C (diciembre de 2015), mientras que cuando se cosecharon los frutos de 252 días, la temperatura descendió drásticamente a 17 °C (enero de 2016), y para febrero la temperatura incrementó nuevamente. Además, en este periodo se presentó poca precipitación, con promedio mensual, de diciembre a febrero, de 68.4 y 95.0 mm para los años 2013 a 2015, respectivamente; lo que pudo provocar estrés en el fruto, mermando sus reservas.

^{Van Dyk et al. (2014)} evaluaron frutos de vainilla y encontraron que a los 105 ddp el contenido de MS fue de 10 % y el de vainillina de 0 %; mientras que a los 280 ddp los valores fueron de 18 % y 1.5 %, respectivamente. Lo anterior sugiere que a mayor contenido de MS habrá más reservas que contribuirán al desarrollo de aroma y sabor del fruto beneficiado. Es importante destacar que, aun cuando el contenido de humedad se reduce en más de 50 % de fruto verde a beneficiado, las diferencias que existen entre el contenido de MS y humedad entre edades del fruto a la cosecha desaparecen en la vainilla beneficiada.

El propósito del beneficio es crear condiciones para la interacción sustrato-enzima para la biosíntesis de vainillina y otros compuestos del aroma, así como la deshidratación de los frutos como un método de conservación y retención de los compuestos del aroma formados (^{Frenkel, Ranadive, Vázquez, & Havkin-Frenkel, 2011}). De acuerdo con la NOM-182-SCFI-2011 (^{Secretaría de Economía, 2011}), la humedad de la vainilla beneficiada debe estar entre 25 y 38 %, rango en el cual se encuentran los tratamientos evaluados, sin diferencia estadística significativa (P > 0.05) (Cuadro 1).

Generalmente, los carbohidratos son los constituyentes más abundantes en los frutos después del agua. En vainilla verde, los frutos de 224 ddp tuvieron una concentración significativamente mayor (66 %; P ≤ 0.05) de estos compuestos, en comparación con los de 252 ddp, mientras que dicha diferencia fue menor en los frutos de 273 ddp y los de referencia del productor (Cuadro 2). Los coeficientes de variación más altos se reportaron en el contenido de fructosa y glucosa de fruto verde, quizás por la combinación de la alta variabilidad entre los frutos y la baja concentración de azúcares. El resto de las variables presentaron un coeficiente de variación menor a 20 %, lo cual indica la confiabilidad de los datos experimentales.

Es posible que el descenso de la temperatura y la poca lluvia, durante la cosecha a los 252 ddp, haya influido en la disminución de las reservas de azúcares como consecuencia del estrés. A pesar de esas diferencias, es notable que el contenido de sacarosa, en frutos verdes, representó, en los tres estados de madurez, más del 80 % del total de los azúcares, seguido de la glucosa y fructosa (Cuadro 2). Estos resultados coinciden con los reportados por ^{Palama et al. (2009)}, quienes encontraron que los frutos de vainilla de tres meses de edad acumulan más glucosa, mientras que los de ocho meses contienen más sacarosa, como sustrato de reserva.

En frutos beneficiados, se puede observar un descenso significativo en el contenido de sacarosa, con el consecuente incremento en fructosa y glucosa, sin diferencias estadísticas significativas (P > 0.05) atribuibles a la edad del fruto (Cuadro 2). Lo anterior debido a que durante el beneficio se presentan diferentes reacciones enzimáticas y no enzimáticas, aceleradas por la alta humedad y temperatura (45 a 65 °C). Dichas reacciones catalizan la hidrólisis y la conversión de glucosa y fructosa. Además, es importante considerar que el fruto verde tiene ciertas reservas de almidón, el cual también contribuye a incrementar la glucosa y los AST (^{Havkin-Frenkel et al., 2004}; ^{Röling et al., 2001}). Por su parte, los frutos de referencia (sin control de la edad) son los que tienen un contenido de azúcares significativamente menor en comparación con los frutos beneficiados (Cuadro 2).

Aunque el aroma es el parámetro más importante en la comercialización de la vainilla beneficiada, no es el factor decisivo para evaluar la calidad. La aceptación y precio de la vainilla dependen del balance aromático, tamaño, apariencia, color y humedad del fruto (^{Secretaría de Economía, 2011}; ^{Sinha, Sharma & Sharma, 2008}). Su aroma es una mezcla de más de 200 compuestos volátiles, que incluye hidrocarbonos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, lactonas, ácidos, terpenoides, éteres, y compuestos fenólicos y carbonílicos. De esos compuestos, la vainillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído), como compuesto más abundante, el p-hidroxibenzaldehído, el ácido vainillínico (ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzóico) y el ácido p-hidroxibenzoico son reconocidos como indicadores de calidad comercial debido a sus concentraciones altas y su participación cualitativa y cuantitativa en el aroma, ya que representan 97 % del total (^{Kumar-Keekan et al., 2010}; ^{Odoux & Grisoni, 2011}).

El perfil de aroma, de los cuatro compuestos más abundantes en frutos beneficiados, mostró diferencias estadísticas significativas (P ≤ 0.05), con excepción de la vainillina. Los frutos beneficiados de 252 ddp presentaron las concentraciones más bajas de ácido p-hidroxibenzoico, ácido vainillínico y p-hidroxibenzaldehído (Cuadro 3), que puede ser la consecuencia de un contenido de MS menor (Cuadro 1) y que refleja una relación con los compuestos menores.

Es notable que los intervalos establecidos en la NOM-182-SCFI-2011 (Cuadro 3), no sean similares a los datos obtenidos, siendo más evidente esta discrepancia en el p-hidroxibenzaldehído, con valores hasta cinco veces más altos que los establecidos en la norma. De la misma forma, ^{Toth et al. (2011)} reportaron alta variabilidad en el contenido de compuestos menores en vainilla mexicana, y lo atribuyeron a que son compuestos de transición. Lo anterior no ocurre con la vainillina debido a que es un compuesto final de la biosíntesis, por lo que su contenido es poco variable.

El análisis entre la MS de los frutos verdes y los compuestos del aroma mostró una correlación significativa entre MS y p-hidroxibenzaldehído (P ≤ 0.05), y altamente significativa (P ≤ 0.0001) entre la MS y la concentración de vainillina (Cuadro 4). De igual manera, en frutos de vainilla cosechados en el ciclo anterior (año 2014), se observó una correlación significativa (P ≤ 0.01) de 0.783 entre el contenido de MS y la vainillina (datos no reportados); lo cual soporta el planteamiento de que la acumulación de MS puede proponerse como un índice de cosecha confiable, más que cambios en el color del fruto o la edad fenológica. De esta forma, los productores podrían registrar la MS de los frutos antes de las 32 semanas, para asegurar mayor contenido de vainillina y mejor balance aromático debido a la acumulación de compuestos menores (^{van Dyk et al., 2014}).

Conclusiones

Aunque el beneficio define la calidad final de la vainilla, los resultados obtenidos muestran que el porcentaje de materia seca tiene una correlación alta con el contenido de vainillina, compuesto mayoritario del aroma. Además, el menor contenido de materia seca y de azúcares solubles totales en frutos verdes, influye en la concentración de compuestos menores (ácido p-hidroxibenzoico, ácido vainillínico y p-hidroxibenzaldehído), que fue significativamente menor en frutos de 252 días de edad, cosechados cuando descendió la temperatura; lo anterior dio como resultado vainilla beneficiada con menor balance aromático.