Material vegetal

Se utilizaron dos cultivares de Stevia rebaudiana: ‘Morita II’ y ‘Silvestre’. El primero fue una donación del Centro de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, Yautepec, Morelos, México. En segundo se adquirió en un vivero del Valle Central de Costa Rica. Ambos cultivares se trabajaron en el invernadero del Centro de Investigación en Biotecnología (CIB) del Instituto Tecnológico de Costa Rica. Estos materiales se utilizaron como plantas madre para la micropropagación debido a su calidad y sanidad.

Aunque ambos cultivares de stevia tienen características dulces, existen diferencias físicas y químicas entre ellas (Figura 1). ‘Morita II’ presenta hojas ovaladas, color verde claro, crece mejor en zonas de clima tropical y es más exigente en cuanto al manejo del cultivo. Por otra parte, ‘Silvestre’ tiene hojas alargadas y dentadas, tonalidades de verde más oscuro y se adapta a diferentes condiciones agroambientales (^{Thiyagarajan & Venkatachalam, 2012}).

Figura 1 Hojas de dos cultivares de Stevia rebaudiana: A) Morita II y B) Silvestre 

Introducción y multiplicación

Para su propagación in vitro, se utilizaron como explantes segmentos nodales que contenía brotes axilares (2 a 3 cm) de las plantas madres. Para ello, los explantes se lavaron con agua y jabón antibacterial, luego se sumergieron en una solución de Agrimycin^® (5 g∙L^-1) y Benlate^® (5 g∙L^-1) por 60 min. Pasado este período, se desinfectaron con hipoclorito de calcio (1.8 % i.a.) durante 10 min y se llevaron a la cámara de transferencia de flujo laminar.

En condiciones asépticas, se eliminó el hipoclorito de calcio y se realizaron tres lavados con agua destilada estéril. Por último, los explantes se colocaron en una solución estéril con antioxidantes (ácido cítrico y ácido ascórbico, 100 g∙L^-1 de cada uno) antes de colocarse en el medio de cultivo (frascos tipo Gerber^® de 5.5 x 5.5 cm). El material se multiplicó cada tres o cuatro semanas pasando cada explante a un tubo de ensayo (14 x 2.2 cm) con 10 mL de medio semi-sólido fresco que contenía el medio base descrito por ^{Murashige y Skoog (1962)} enriquecido con 30 g∙L^-1 de sacarosa, 2 mg∙L^-1 de pantotenato de calcio (PACA) y 0.5 mg∙L^-1 de ácido giberélico (AG₃).

Prueba de medios líquidos

Para el crecimiento en medio líquido, se realizó una prueba de medios utilizando el SIT RITA^® (^{Alvard, Cote, & Teisson, 1993}) con 200 mL de medio de cultivo. Para esta prueba se utilizó el cultivar ‘Morita II’ con un mes de subcultivo in vitro. Cada RITA^® se inoculó a una densidad de 10 mL por explante. Al medio base se le adicionaron diferentes concentraciones de sacarosa, kinetina (K, como regulador de crecimiento) y un supresor microbiológico (methylisothiazolone [2-methyl-4-isothiazolin-3-one, MIT] y methylchloroisothiazolinone [5-chloro-2-methyl-4- isothiazolin-3-one, CIT], reactivos químicos Gamma, Laboratorios ARVI S.A.) (Cuadro 1). Cada ensayo se realizó por triplicado y se evaluaron después de tres semanas. Las variables estudiadas fueron elongación (cm), sobrevivencia en invernadero y respuesta morfológica de la planta ante cada medio de cultivo (cantidad de hojas y número de brotes).

Sistemas de inmersión temporal

Para la propagación masiva de stevia se evaluaron tres SIT: RITA^® (^{Alvard et al., 1993}), BIT^® (^{Escalona et al., 1999a}) y SETIS^® (Duchefa Biochemie B.V.) (Figura 2). El sistema BIT^® consiste en dos frascos de cultivo de 2 L de capacidad, uno donde se colocaron los explantes y el otro como reservorio para el medio de cultivo a utilizar. Los frascos se conectan entre sí por una manguera que va desde la tapa hasta el fondo del recipiente, lo cual permite la recirculación del medio de cultivo de un frasco a otro. En la tapa del recipiente hay un filtro hidrofóbico (0.22 μm) para garantizar la esterilización del aire de entrada. En general, el sistema BIT es fácil de operar y construir, se puede mantener por largos períodos permitiendo una buena ventilación y el contacto de los explantes con el medio de cultivo (^{Georgiev, Schumann, Pavlov, & Bley, 2014}).

Figura 2 Sistemas de inmersión temporal evaluados: A) BIT^®, B) RITA^® y C) SETIS^®. 

Por otra parte, RITA^® consiste en un solo recipiente de polisulfona con capacidad máxima de 500 mL. En la tapa tiene dos orificios con manguera; en uno de ellos se acopla un filtro hidrofóbico (0.22 μm) y en el otro una válvula de apertura y cierre de aire. En el interior del recipiente se coloca una malla donde se establecen los explantes.

El sistema SETIS^® consta de dos recipientes horizontales acoplados uno sobre el otro con una capacidad de 3 L. Cada uno presenta una abertura de 80 mm con empaques de silicón y tapas de rosca, se conectan entre sí por una manguera en la parte inferior del recipiente. En sus extremos superiores, un orificio conectado a un filtro permite la entrada de aire estéril.

Los tres SIT se conectaron a electroválvulas, que permiten la entrada o no de aire, y éstas a un temporizador programable con el cual se define la frecuencia y tiempo de inmersión, dada la regulación por un manómetro.

En todos los sistemas se trabajó con la mitad de la capacidad, a una densidad de 10 mL por explante (^{Alvarenga-Venutolo & Salazar-Aguilar, 2015}). El material mantenido in vitro se inoculó con un mes de subcultivado, para ello se introdujeron explantes de 0.5 a 1 cm de longitud (no brotes apicales).

En el Cuadro 2 se detallan las condiciones de cultivo de cada sistema. El tiempo y la frecuencia de inmersión se trabajaron con el programa ya establecido en los laboratorios del Centro Nacional de Innovaciones Biotecnológicas (CENIBiot-CENAT), San José, Costa Rica, donde se realizaron estos ensayos.

Evaluación de las plantas obtenidas en los sistemas de inmersión temporal

Después de un mes de cultivo en los diferentes sistemas, se retiró el material vegetal y en cada tratamiento se evaluó número de brotes y elongación (cm) por explante considerando que todos los explantes dispusieron de 10 mL de medio y el mismo tiempo de inmersión (2 min).

Aclimatación en invernadero

Inmediatamente después de la evaluación de las plantas obtenidas de los SIT, éstas se llevaron a invernadero y se cultivaron en cámaras de humedad construidas con vasos desechables. El sustrato empleado fue tierra y granza de arroz (60:40), y antes de la siembra se le agregaron tres gotas de una solución enraizadora (5 mg∙L^-1 de ácido indolbutírico). Al finalizar el período de aclimatación, se midió el porcentaje de sobrevivencia de las plantas con base en el SIT de proveniencia.

Manejo de material en campo

Después de un mes del cultivo en invernadero, cuando las plantas alcanzaron de 10 a 15 cm de longitud, se procedió al traslado a campo. La siembra en campo se trabajó en conjunto con agricultores comercializadores de la zona de San Ramón de la Virgen de Sarapiquí, Costa Rica (10° 21’ 16.9’’ latitud norte y 84° 07’ 00.79’’ latitud oeste, de 200 a 400 msnm). La zona presenta suelo descrito como Inceptisol Dystrandep, temperaturas de 24 a 30 °C y precipitación anual de 5,000 mm.

En el campo, la distancia entre plantas e hileras fue de 30 y 80 cm, respectivamente; lo que resultó en una densidad de 65,000 plantas∙ha^-1. Al momento de la siembra el material se fertilizó con abono orgánico (estiércol de ganado vacuno, 100 g∙planta^-1); a los ocho días se hizo una aplicación de la fórmula NPK (10:30:10, 5 g∙planta^-1), y a los dos meses se realizó una segunda aplicación de abono orgánico. Adicionalmente, se aplicaron 2 mL∙L^-1 abono foliar (Nitrofoska^®) y 2 mL∙L^-1 de ácidos húmicos bajos en potasio (Agroroots^® 10-30-10).

Al cabo de 15 días del trasplante se evaluó el porcentaje de sobrevivencia, y a los tres meses se cosechó la biomasa a 15 cm del suelo (parte aérea) para permitirle a la planta rebrotar. En total se recolectaron muestras de 10 plantas por cultivar de stevia (por triplicado) de la misma edad y procedencia. Posteriormente, se determinó la biomasa producida (tallos y hojas) con base en el peso fresco y peso seco.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico y la comparación de medias de los resultados de los SIT se utilizó el programa ^{Minitab 17 (2010)}, con la prueba Kruskal-Wallis (P ≤ 0.05). Los datos obtenidos en campo se analizaron estadísticamente con el programa Infostat (^{di Rienzo et al., 2017}) y se realizó un análisis de varianza de una vía (P ≤ 0.05).

Introducción y multiplicación del material in vitro

Los brotes axilares proliferaron después de dos a tres semanas de su cultivo en el medio base. Algunos investigadores han enriquecido el medio con kinetina para incrementar el número de brotes, pero en muy baja concentración (^{Espinal-de Rueda, Delvalle, Cifuentes, & Ramia, 2006}); sin embargo, al igual que ^{Alvarenga-Venutolo y Salazar-Aguilar (2015}), en este estudio se utilizó AG₃ como único regulador de crecimiento. El AG₃ induce una gran variedad de efectos fisiológicos, entre ellos la elongación de tallos debido a la activación de los meristemos intercalares (^{George, Hall, & de Klerk, 2008}). Los resultados obtenidos parecen confirmar este efecto, ya que las plantas presentaron rápido crecimiento vertical, tomando ventaja del espacio de cultivo. Esta característica es evidente al cambiar de recipiente (de frasco a tubo de ensayo) durante la multiplicación, observándose una mayor elongación y grosor de los brotes. Dichos resultados podrían explicarse con base en la altura del tubo de ensayo, lo que les permitió a las plantas direccionar su crecimiento verticalmente, ya que el medio de cultivo fue igual en ambos casos. Estos resultados concuerdan con los observados por ^{Sánchez-Chiang y Jiménez (2010)}, quienes recomiendan seleccionar el recipiente dependiendo de la frecuencia y tiempo de subcultivo.

Prueba de medios líquidos

En cuanto a los medios de cultivo evaluados utilizando RITA^®, se observaron diferencias estadísticas significativas entre los medios (P ≤ 0.002). El medio de cultivo 1 (medio base, 30 g∙L^-1 de sacarosa, sin supresor microbiano y sin citoquinina) permitió la mayor elongación de los explantes, seguido por el medio 3 (igual al anterior pero con 1 mL∙L^-1 de supresor) (Figura 3). No obstante, cuando las plantas obtenidas in vitro se llevaron al invernadero, las provenientes del medio 3 presentaron mayor porcentaje de sobrevivencia durante la aclimatación (92 %) que las del medio 1 (80 %), que presentó el mejor crecimiento in vitro (Figura 4). Además, se pudo observar que el supresor microbiano permitió mantener niveles bajos de contaminación bacteriana durante todo el proceso de micropropación, lo que de acuerdo con los resultados fue una ventaja a la hora de llevar las plantas al invernadero.

Figura 3 Efecto del medio de cultivo (sacarosa, pantotenato de calcio y ácido giberélico; ^{Murashige & Skoog, 1962}) en la longitud del tallo de explantes de Stevia rebaudiana cv. ‘Morita II’. Medio 1: 30 g∙L^-1 de sacarosa; medio 2: 40 g∙L^-1 de sacarosa; medio 3: 30 g∙L^-1 de sacarosa + supresor microbiano; medio 4: 30 g∙L^-1 de sacarosa + kinetina; medio 5: 30 g∙L^-1 de sacarosa + supresor + kinetina. 

Figura 4 Porcentajes de sobrevivencia de plántulas de Stevia rebaudiana cv. ‘Morita II’ en el invernadero. Medio 1: 30 g∙L ^-1 de sacarosa, medio 2: 40 g∙L ^-1 de sacarosa, medio 3: 30 g∙L ^-1 de sacarosa + supresor microbiano, medio 4: 30 g∙L ^-1 de sacarosa + kinetina y medio 5: 30 g∙L ^-1 de sacarosa + supresor + kinetina. 

El supresor microbiano se utilizó debido a que en ambos materiales de Stevia rebaudiana apareció una bacteria endógena gram negativa en la tercera semana, identificada por secuenciación de ADN como Burkholderia fungorum (datos no mostrados). Este supresor sirve para retrasar la aparición de contaminantes en el cultivo in vitro, lo que permite no desechar gran cantidad de material vegetal y poder llevar más plantas al invernadero.

Las bacterias son los contaminantes in vitro más comunes y ocasionan serios problemas, además de ser difíciles de detectar y eliminar (^{Orlikowska, Nowak, & Reed, 2017}). Su distribución puede ser localizada o sistémica, por xilema o floema, y por lo general no se manifiestan en los primeros subcultivos, ya que la alta presión osmótica, el pH y ciertas hormonas de los medios de cultivo pueden inhibir su crecimiento. Debido a estos factores inhibitorios, muchos microorganismos requieren un período de adaptación a las nuevas condiciones antes de manifestar su presencia, lo que ocurre por lo general en la fase de multiplicación (^{Hernández & González, 2010}).

Los resultados de este estudio muestran que Stevia rebaudiana no es una planta exigente en cuanto al medio de cultivo, ya que el medio base enriquecido con 2 mg∙L^-1 de PACA y 0.5 mg∙L^-1 AG₃ permitió la micropropagación de los explantes, lo que coincide con lo reportado por ^{Alvarenga-Venutolo y Salazar-Aguilar (2015)}. Sin embargo, estos resultados son contrarios a los obtenidos por ^{Sivaram y Mukundan (2003)}, quienes encontraron las mayores tazas de multiplicación y crecimiento utilizando citocininas y auxinas en el medio de cultivo. En el presente estudio, la adición de kinetina al medio de cultivo causó crecimiento heterogéneo (en roseta, explantes hiperhidratados, apariencia vidriosa y translúcida tanto de los tallos como de las hojas) (Figura 5), siendo característico de este regulador de crecimiento cuando se encuentra en concentraciones altas (^{George et al., 2008}).

Figura 5 Plántulas de Stevia rebaudiana obtenidas del medio de cultivo adicionado con kinetina. 

Sistemas de inmersión temporal

Todos los tratamientos evaluados en los SIT (BIT^®, SETIS^® y RITA^®) produjeron plantas vigorosas con niveles bajos de hiperhidricidad, mayor número promedio de hojas y brotes, en general, una mayor tasa de multiplicación que aquellos explantes cultivados en medio semi-sólido.

Los SIT son sistemas automatizados que basan su funcionamiento en el contacto del medio de cultivo con los explantes por intervalos de tiempos regulares y el bombeo de aire limpio a través de un filtro. Este método permite que el exceso de líquido en los explantes se drene por gravedad al finalizar el bombeo y éstos se mantengan húmedos (^{Santos-Pino et al., 2011}; ^{Steinmacher, Guerra, Saare-Surminski, & Lieberei, 2011}). El flujo de aire está regulado por temporizadores electrónicos que controlan la frecuencia y los tiempos de inmersión, y válvulas solenoides que permiten encender/apagar el sistema.

De acuerdo con la comparación de medias, ‘Morita II’ mostró mayor longitud de tallo en las plantas cultivadas en el sistema BIT^® (11.65 cm), comparado con SETIS^® (9 cm) y RITA^® (2.85 cm). Asimismo, en ‘Silvestre’ se observó la mayor longitud de tallo con BIT^® (13.50 cm). En ambos casos las diferencias fueron estadísticamente significativas (P ≤ 0.05) (Figura 6).

Figura 6 Longitud del tallo de dos cultivares de Stevia rebaudiana: ‘Morita II’ y ‘Silvestre’, según los sistemas de inmersión temporal evaluados. 

En general, la composición de los gases en el envase de cultivo está influenciada por el volumen del recipiente, el volumen del medio y la ventilación (^{Georgiev et al., 2014}). En los SIT, el control de la fase gaseosa depende del volumen del recipiente, de los gases producidos por los explantes y de la frecuencia de inmersión por medio del flujo de aire (^{Basail-Pérez et al., 2012}). Adicionalmente, ^{Ziv (2005)}, al medir la concentración de gases dentro de los SIT, mostró que es tan importante la concentración de O₂ como de CO₂ en el recipiente de cultivo.

El recipiente BIT, que mostró los mejores resultados en elongación de las plantas, presentó mayor volumen relativo para el intercambio y acumulación de gases. Lo anterior debido a que se usa un recipiente vertical, y el espacio entre los explantes y la parte superior del recipiente es mayor en comparación con el disponible en los otros sistemas evaluados, permitiendo una mayor disponibilidad de gases y espacio para la elongación de los explantes (Figura 2).

Brotación

En ‘Morita II’, la mediana de BIT^® fue ocho brotes por planta, mientras que en SETIS^® fue de tres brotes, observándose diferencias significativas entre los dos sistemas evaluados (P ≤ 0.05). Para ‘Silvestre’, el número de brotes en ambos casos fue de dos (P = 0.42). Ambos cultivares presentaron elongación similar de plántulas en BIT^®; sin embargo, de acuerdo con los resultados de brotación, ‘Morita II’ produce más brotes que ‘Silvestre’.

Estos resultados parecen indicar que ‘Silvestre’ es más sensible a la presencia del AG₃, ya que éste induce la elongación de tallos (^{George et al., 2008}). Resultados similares fueron reportados por ^{Escalona et al. (1999b)}, quienes observaron que el AG₃ promovió mejor elongación y uniformidad de brotes en piña (Ananas comosus).

De acuerdo con ^{Thiyagarajan y Venkatachalam (2012)}, la mayor brotación de stevia en medio sólido se debe al uso de reguladores de crecimiento como kinetina (0.5 mg∙L^-1) y bencilaminopurina (1.0 mg∙L^-1), logrando hasta un 85.7 % de regeneración. El medio de cultivo utilizado en esta investigación solo se suplementó con AG₃, y en las pruebas iniciales de medios la presencia de citocininas causó efectos negativos, por lo que los resultados parecen indicar que el efecto de la brotación se debe al SIT. ^{Vilchez y Albany (2014)} atribuyen el aumento del número de brotes de guayabo al tipo de SIT evaluado (RITA^® y BIT^®).

Tiempo y frecuencia de inmersión

El tiempo y frecuencia de inmersión son dos factores fundamentales para lograr el mayor coeficiente de multiplicación y la mejor calidad de plantas. Aunque en este estudio no se analizaron, los parámetros empleados son recomendado por ciertos investigadores para plantas magnófitas. ^{Castro y González (2002)} evaluaron diferentes frecuencias y tiempos de inmersión. En su caso, las frecuencias de 12 h y 3 min de inmersión mostraron mayor número de brotes en relación con frecuencias menores y 1 min de inmersión.

Por otra parte, en cultivo de plátano bajo SIT, los tiempos de inmersión fueron más prolongados, ya que la morfología de la especie es muy diferente a la de stevia. En plátano se evaluaron tiempos de inmersión de 5, 10 y 15 min, demostrando al cabo de 21 días que esto influyó significativamente en todas las variables evaluadas, siendo 10 min el tiempo que permitió mayor coeficiente de multiplicación, diámetro del pseudotallo y menor grado de oxidación (^{Basail-Pérez et al., 2011}).

Al finalizar este estudio, se pudieron observar diferencias entre los SIT evaluados, entre los cuales se destacan algunas ventajas, pero también se mencionan desventajas en cuanto al uso del equipo, que pueden ser útiles para la búsqueda de mejoras. La capacidad de RITA^® es menor en comparación con los otros dos sistemas evaluados, aunque su diseño permite mayor facilidad de introducción de los explantes al frasco de cultivo. Por otra parte, la malla donde se colocan los explantes tanto en RITA^® como en SETIS^® dificulta la recuperación del material si este presenta raíces al final del período de multiplicación. La distribución del medio de cultivo es más homogénea en RITA^® y en BIT^®; sin embargo, el costo de adquisición de BIT^® es mucho menor. ^{Vilchez y Albany (2014)} reportan resultados similares.

Aclimatación en invernadero

Después de un mes de cultivo en los SIT, las plantas se llevaron al invernadero para su aclimatación. Es importante mencionar que el crecimiento in vitro es heterótrofo y el in vivo autótrofo. El ambiente in vitro presenta alta humedad relativa, bajo o nulo intercambio gaseoso, escasez de CO₂ durante casi todo el período, producción de etileno y baja densidad fotosintética, lo que induce perturbaciones en las plantas desarrolladas bajo esas condiciones.

Las plantas obtenidas in vitro tienen hojas delgadas, tallos débiles, raíces débiles y poco funcionales, conexión tallo-raíz incompleta y tasa fotosintética baja (^{George et al., 2008}). Por ello, la aclimatación es un factor importante en la posterior supervivencia de la planta, ya que es una etapa crítica dentro del proceso y es en la que se produce la mayor pérdida de plantas. Es importante iniciar el proceso de aclimatación reduciendo gradualmente la humedad relativa para permitir, además del cierre estomático, una mejor formación de cutícula y disminuir la pérdida de agua (^{Nava et al., 2011}).

En este trabajo, la mayor mortalidad de plantas en invernadero se presentó durante la primera etapa de aclimatación, debido, en parte, a las características que presentan las plantas recién salidas del cultivo in vitro y a las condiciones del invernadero, cuya infraestructura no permite regular apropiadamente la humedad relativa, temperatura ni luminosidad. Otra de las principales limitantes durante este periodo fue el ataque por mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum), que se controló con trampas cromáticas color amarillo y el insecticida Actara^® (Tiametoxam), 2.5 mg∙L^-1 cada 15 días. El contenido alto de azúcar en esta especie la hace muy atractiva para estos insectos. Una vez pasada esta primera etapa, las plantas que sobrevivieron llegaron hasta el traslado a campo. Los resultados de esta etapa obtenidos en esta investigación parecen indicar que las condiciones iniciales durante la aclimatación no fueron las más adecuadas para esta especie, y que en futuras pruebas se debe prestar atención a las condiciones dadas en el periodo inicial en invernadero.

Para ambos cultivares, sin importar el SIT utilizado, los porcentajes de sobrevivencia en invernadero fueron muy similares (Figura 7), aunque bajos por los problemas antes mencionados. Con base en los resultados obtenidos, se puede deducir que la calidad de las plantas obtenidas in vitro es buena y similar en ambos cultivares, y que el manejo de las plantas recién sembradas en el invernadero determinará el porcentaje de sobrevivencia.

Figura 7 Sobrevivencia de las plántulas de Stevia rebaudiana provenientes de los sistemas de inmersión temporal BIT^® y SETIS^® después de su aclimatación en invernadero. Primera columna corresponde a ‘Morita II’ y la segunda a ‘Silvestre’. 

Cultivo en campo

Una vez que las plantas alcanzaron una longitud de 10 a 15 cm en invernadero se llevaron a campo. Durante el cultivo en campo se presentaron algunos problemas con plagas, como la hormiga zompopa (Atta spp) y jobotos (Phyllophaga spp); sin embargo, se observó 95 % de sobrevivencia de las plantas después de 15 días de siembra. En esta etapa las plantas mostraron crecimiento vigoroso y coloración característica de la especie (Figura 8).

Figura 8 Plantas de Stevia rebaudiana, cultivares: ‘Silvestre’ y ‘Morita II’. 

La producción de follaje fue alto en ambos cultivares; aunque con diferencias estadísticas significativas (P ≤ 0.05) entre ambos, siendo ‘Morita II’ el que produjo el mayor peso fresco (260.7 g), comparado con ‘Silvestre’ (214.4 g). Por el contrario, en peso seco no se presentaron diferencias estadísticamente significativas (P ≤ 0.05), produciendo ambas alrededor de 80 g de materia seca por muestra (10 plantas de la misma edad y procedencia, por triplicado) (Figura 9).

Figura 9 Peso seco y fresco del follaje producido por dos cultivares de Stevia rebaudiana después de tres meses de siembra en campo. Medias con la misma letra entre barras del mismo color no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05).