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Introducción
Los mecanismos inmunitarios de los bovinos se dividen en innatos y adquiridos. Entre los primeros se encuentran células imprescindibles como son los monocitos y los macrófagos (Adams 1979, Auffray et al. 2009). Los monocitos son células que unen las respuestas inmunitarias innata y adquirida y desempeñan un papel fundamental como células de la primera línea de defensa contra agentes patógenos (Hume et al. 2002). Los monocitos se originan en la médula ósea y son liberados en la circulación sanguínea, donde fluyen por varios días antes de entrar a los tejidos para reemplazar las poblaciones de macrófagos y células dendríticas (Auffray et al. 2009).
En estudios previos, se ha demostrado que Lactobacillus casei induce respuestas protectoras contra Babesia microti en ratones, cuando se inocula antes o el mismo día de la infección de confrontación (Bautista-Garfias et al. 2005) y contra B. bovis y B. bigemina en bovinos, cuando la bacteria ácido-láctica se administra junto con la vacuna mixta contra babesiosis bovina, desarrollada por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) del gobierno mexicano, bajo condiciones controladas (Bautista et al. 2008) y también bajo condiciones de campo (Bautista-Garfias et al. 2012). Los mecanismos responsables de la inducción de inmunidad innata, generada por el lactobacilo no se conocen, aunque se sugiere que la estimulación de células como los monocitos y macrófagos por L. casei podría ser uno de los mecanismos (Bautista-Garfias et al. 2005).
Por otro lado, el óxido nítrico (ON) es un radical libre sintetizado a partir de L-arginina por tres diferentes sintasas-ON (ONS) que exhibe múltiples y complejas funciones biológicas y muchos de sus efectos pueden ser atribuidos principalmente a su potente capacidad oxidativa (Pavenelli y Nogueira 2010). Se sabe que el ON puede modular directa e indirectamente la respuesta inmunitaria por medio de diversos mecanismos tales como el mediar efectos microbicidas de radicales libres derivados del ON, principalmente dentro de macrófagos y otros fagocitos (Pavenelli y Nogueira 2010). Se ha indicado que la producción de óxido nítrico por fagocitos, como los monocitos y macrófagos, es un factor importante en la protección del hospedero contra la infección de diferentes microorganismos patógenos (Fang 1997) entre los que se encuentran parásitos como Giardia (Pavanelli et al. 2010), Trypanosoma cruzi (Pavenelli y Nogueira Silva 2010) y Babesia spp. (Johnson et al. 1996, Bautista et al. 2005). En este sentido, también en investigaciones anteriores, se demostró que los monocitos de sangre periférica de bovino modifican su morfología al ser estimulados in vitro por el lactobacilo (Bautista et al. 2014); sin embargo, no se conoce si dicha bacteria activa monocitos para que produzcan ON. En este contexto, la presente investigación se llevó a cabo con el objeto de determinar la producción de ON a partir de monocitos de sangre periférica de bovino, expuestos in vitro a L. casei.
Materiales y métodos
Animales experimentales
Se utilizaron bovinos Holstein, de diferentes establos de Amecameca, Estado de México. Se colectó sangre periférica de los siguientes tres grupos: 1) 4-6 meses de edad (MDE) (n = 4), 2) 8 MDE (n = 3) y 3) 12 MDE (n = 8).
Lactobacilos
Se usó la cepa ATTCC7469 de Lactobacillus casei (Bautista-Garfias et al. 2001) que se cultivó en medio MRS (Man-Rogosa-Sharpe) a 37 °C durante 18 h. Las bacterias se cosecharon y centrifugaron a 5000 g por 10 min para luego lavar tres veces con solución salina amortiguadora de fosfatos (pH 7.2). Después del conteo viable, la cantidad de L. casei se ajustó a una concentración de 109 unidades formadoras de colonia (ufc)mL−1.
Aislamiento de monocitos de sangre periférica
De cada uno de los bovinos se tomó una muestra de 10 a 25 mL de sangre periférica por punción de la vena yugular en tubos Vacutainer con heparina como anticoagulante, previa asepsia con torundas de algodón y benzal al 70 %. Como un primer paso, los leucocitos se aislaron por medio de la centrifugación de la sangre en un gradiente de densidad (Ficoll-Paque). Después de cuatro lavados por centrifugación a 450 g durante 15 min se determinó la viabilidad celular por medio de tinción con azul de tripán y un conteo celular en la cámara de Neubauer. Para luego ajustar a 1x106 células con una viabilidad mayor al 95 % por cada caja de Petri de seis cm de diámetro. Los monocitos se aislaron con base en su propiedad de adherirse a superficies de plástico (Birmingham y Jeska 1980, Goddeeris et al. 1986, Adams y Czuprynski 1990). Las cajas se incubaron durante dos horas en estufa de CO2 a 37 °C y luego se lavaron con solución de Vega y Martínez (Vega et al. 1985) para descartar células no adherentes y posteriormente se adicionó el medio de cultivo MF12 conteniendo 30 mMol N-Tris (hydroxymethil)-methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) y 26 mM NaHCO3.
Cultivo in vitro
Los tratamientos consistieron en la exposición de los monocitos a L. casei (1x108 ufc caja−1), obtenido de acuerdo con Bautista et al. (2001) o a solución salina amortiguadora de fosfatos (pH 7.0) (testigo). Cada tratamiento se realizó por triplicado, manteniendo los cultivos in vitro dentro de una incubadora a 37 °C con una atmósfera CO2 por 96 h y realizando cambios de medio cada 24 h en cada una de las réplicas. Los sobrenadantes obtenidos se congelaron a -20 °C hasta su uso.
Determinación de óxido nítrico (ON)
El ON se determinó en los sobrenadantes de los cultivos obtenidos cada 24 h por medio de la adición del reactivo de Griess, utilizando un kit comercial (Quantichrom TM Nitric Oxide Assay Kit, BioAssay Systems, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante, para luego leer en un lector de ELISA a 595 nm. Los datos se registraron como NO2 (μg M), para luego realizar el análisis estadístico.
Análisis estadístico
Con los datos obtenidos, se llevó a cabo un análisis de varianza de bloques al azar con el paquete de diseños experimentales de la FAUNL, v.2.5 (Olivares, 1994). En cada uno de los grupos de diferentes edades, se comparó la producción de ON a las 24, 48, 72 y 96 h después del tratamiento, entre células tratadas y no tratadas con L. casei. Asimismo, se comparó el promedio total de la producción de ON entre los tres grupos de edad. Cuando se encontraron diferencias se usó la prueba de Tukey y éstas se considerando como significativas cuando los valores de p fueron < 0.01.
Resultados y discusión
Se observó una diferencia significativa (p < 0.01) en la producción de ON por los monocitos de becerros de 4-6 meses de edad que fue manifiesta desde las 24 h post-exposición a L. casei y que se mantuvo a niveles similares a las 48, 72 y 96 h. El promedio mínimo de ON (μg M) fue de 33.2 a las 48 h y el máximo de 37.7 a las 96 h post-exposición (Figura 1) en comparación con las células testigo no expuestas al lactobacilo. En el caso de los monocitos de animales de ocho meses de edad se apreció una diferencia significativa (p < 0.01) en la producción de ON a las 24, 48, 72 y 96 h post-exposición a L. casei. El promedio mínimo de ON (μg M) fue de 8.3 a las 96h y el máximo fue de 27.3 a las 72 h post-exposición, en comparación con las células testigo no expuestas al lactobacilo (Figura 2). Los monocitos de bovinos de 12 meses de edad también produjeron valores significativamente más altos de ON (μg M) en comparación con las células testigo no tratadas con L. casei en los cuatro días de estudio (Figura 3). La mínima cantidad de ON fue de 16.1 a 96 h, mientras que el valor máximo fue de 26.2 a 72 h post-exposición a L. casei (Figura 3).
Cuando se compararon los promedios de cuatro días de ON producido por los monocitos en los tres grupos de edad, se observó que hubo una diferencia significativa (p < 0.01) en los valores obtenidos por las células de los becerros de 4-6 meses de edad en comparación con los monocitos de bovinos de ocho y 12 meses de edad (Figura 4). Los resultados obtenidos en la presente investigación, en bovinos de tres edades, indican que L. casei (bacteria Gram positiva) indujo la producción significativa de ON en cultivos de monocitos expuestos a este lactobacilo en comparación con las células testigo no expuestas, lo que concuerda con Werling et al. (2004) quienes observaron que la producción de ON en cultivos de macrófagos expuestos a distintas bacterias Gram negativas, fue estadísticamente mayor que la producción de ON en células testigo no tratadas. Dichos resultados sugieren que los monocitos fueron activados por de receptores tipo Toll. Al respecto, se sabe que L. casei estimula la respuesta inmunitaria innata a través de la activación de TLRs y la producción de citocinas tipo Th1 (Maldonado Galdeano y Perdigón 2006, Vizoso et al. 2009). Es importante resaltar que los monocitos se diferencian en macrófagos y células dendríticas cuando pasan de la circulación a los tejidos y que el bazo es el órgano de almacenamiento de los monocitos (Swirski et al. 2009), por lo que estas células participan de forma activa en los mecanismos inmunitarios innatos. Los resultados de la presente investigación apoyan la idea de que la activación de la inmunidad innata por medio de agonistas de los receptores tipo Toll, como L. casei, también promueve una buena respuesta inmunitaria adaptativa (Bachmann y Jennings 2010) lo cual puede ser aprovechado en el mejoramiento de vacunas (Pashine et al. 2005). Los monocitos de becerros de 4 a 6 meses de edad produjeron una mayor cantidad de ON en comparación con los otros grupos de edad, lo que concuerda con la observación de que los becerros presentan mecanismos inmunitarios innatos superiores a los de los bovinos adultos (Goff et al. 2010).
L. casei indujo la producción de óxido nítrico in vitro en monocitos de bovino de tres grupos diferentes de edad. La mayor producción se observó en becerros de 4-6 meses de edad. Los resultados sugieren que L. casei se podría utilizar en bovinos para estimular la inmunidad innata contra diferentes patógenos, particularmente en animales jóvenes.
