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ANTECEDENTES
El cáncer de próstata es el tumor maligno más frecuente en hombres mayores de 50 años de edad. Esta neoplasia representa la primera causa de muerte en varones de México.
A partir del decenio de 1980, con la introducción del antígeno prostático específico, se ha logrado establecer el diagnóstico en etapas más tempranas y con ello implementar un tratamiento potencialmente curativo.1
El porcentaje de hombres adultos, de 60 años de edad o mayores, a quienes se realizó la prueba de detección de cáncer de próstata por medio del antígeno prostático se mantuvo constante entre 2006 y 2012 (10.4 vs 9.5%, respectivamente). Incluso se estimó que 2.5% de los hombres iguales o mayores de 20 años de edad acudieron en los 12 meses previos a la encuesta ENSANUT 2012 a realizarse la prueba de tacto rectal.2
Un reto importante en la práctica clínica es la incapacidad de las pruebas de diagnóstico actuales, incluido el antígeno prostático específico y la clasificación histopatológica, para distinguir entre tumores agresivos e indolentes.3 El antígeno prostático específico puede detectarse en las secreciones prostáticas normales y sus concentraciones suelen elevarse en pacientes con cáncer de próstata.4,5 Durante más de 20 años las concentraciones séricas de antígeno prostático se han utilizado como un biomarcador del cáncer de próstata, lo que ha revolucionado el tratamiento clínico de la enfermedad.6 Sin embargo, tiene limitaciones inherentes, como la falta de especificidad, que resulta en sobrediagnóstico y sobretratamiento del cáncer de próstata.7
El National Cancer Institute (NCI) define “biomarcador” a una molécula biológica detectada en la sangre, fluidos corporales o tejidos, que puede determinarse y evaluarse objetivamente como resultado de un proceso biológico normal-anormal o alguna condición patógena-enfermedad.
Un biomarcador puede utilizarse para fines de selección, diagnóstico, pronóstico y evaluación de la enfermedad, además de la predicciónseguimiento de la respuesta al tratamiento para diversas intervenciones terapéuticas.7-10
Entre los biomarcadores de cáncer de próstata alternativos están los microARN (miARNs): ácidos ribonucleicos de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud, no codificantes, importantes reguladores de la expresión génica en células eucariotas.11 (Figura 1).
Cada microARN tiene la capacidad de interactuar por diferentes rutas celulares; en consecuencia, los cambios en la expresión de un pequeño número de miARNs pueden reflejar la irregularidad de diversos procesos celulares, según la complejidad de la neoplasia. Además, los miARNs son relativamente resistentes a la degradación por la RNasa, debido a su longitud de secuencia corta, que aumenta su tiempo de vida en muestras de suero y tejidos.12,13
Las evidencias más recientes sugieren que los miARNs se encuentran en pacientes con cáncer de próstata resistentes al tratamiento farmacológico, mediante la regulación de la vía de señalización de andrógenos, apoptosis,trasportadores de fármacos, transición epiteliomesenquimal (EMT) y células madre de la neoplasia (CSC).14 El receptor de andrógenos es importante en la evolución a cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC).15,16
Los primeros estudios relacionados con la alteración de miARNs en pacientes con cáncer de próstata se reportaron entre 2007 y 2008, con el propósito de identificar los perfiles de expresión de genes para establecer el diagnóstico, pronóstico y factores predictivos.17,18
En pacientes con tumores de próstata primarios se ha informado la desregulación generalizada de miARNs comparados con tejidos sanos. La alteración de los perfiles de expresión de miARN se ha relacionado con la evolución del cáncer de próstata, agresividad, metástasis y recurrencia.19-21
Los miARNs pueden ser biomarcadores importantes en la detección del cáncer de próstata en etapas tempranas.22
El objetivo de este estudio es determinar, mediante técnicas de biología molecular, el perfil de expresión de miARNs en muestras de suero de pacientes con cáncer de próstata.
MATERIALES Y MÉTODOS
Estudio observacional, retrospectivo, transversal y comparativo, de casos y controles, en el que se evaluaron muestras sanguíneas de pacientes con diagnóstico de cáncer de próstata (grupo de casos) versus pacientes sanos (grupo control). Criterios de inclusión: sujetos con diagnóstico de cáncer de próstata primario, con indicación para prostatectomía radical, mayores de 40 años de edad, mexicanos. Criterios de exclusión: pacientes con diagnóstico diferente de cáncer de próstata. El estudio se llevó a cabo en el Hospital Central Militar, entre octubre de 2014 y mayo de 2016, con la aprobación del Comité de Investigación de la institución y el consentimiento informado de cada paciente.
Procesamiento de las muestras
De cada paciente se obtuvieron 4 mL de sangre. Cada muestra se centrifugó y del suero se aislaron los componentes sanguíneos, para finalmente obtener 1 mL de éste. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su utilización. Se colectaron 200 µL de suero para obtener el ARN total mediante el método tradicional con Trizol® (Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, el ARN extraído de cada muestra se cuantificó por espectrofotometría (Thermo scientific nanodrop 1000).
Para la síntesis de ADN complementario (cADN) se utilizó el dispositivo miScript II RT kit ® (Qiagen, Hilden, Germany), con el termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems). Una vez obtenido el cADN se realizaron diluciones para igualar las concentraciones en cada muestra biológica, formar grupos de cADN de cada cinco muestras y obtener como resultado final cuatro grupos de muestras de los casos (pacientes con cáncer de próstata) y tres grupos de muestras de los controles (pacientes sanos). Se realizó la amplificación (replicación) del material genético, en este caso de los 62 miARNs que actualmente están reportados en la bibliografía internacional relacionados con el cáncer de próstata primario, resistencia farmacológica y biomarcadores de interés (Cuadro 1), de cada grupo de muestras, mediante qRT-PCR en el termociclador Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany), con la finalidad de evaluar su nivel o grado de expresión.
Cuadro 1 Expresión de miARNs reportados en la bibliografía
| Relación | Nivel de expresión | miRNA | ||
|---|---|---|---|---|
| miR-135b-5p | miR-361-5p | miR-32-5p | ||
| miR-15a-5p | miR-455-5p | miR-148a-3p | ||
| Sobreexpresados | miR-184 | miR-616-3p | miR-148a-5p | |
| miR-21-5p | miR-222-3p | miR-378b | ||
| miR-221-3p | miR-222-5p | miR-378c | ||
| miR-30c-5p | miR-32-3p | miR-378a-3p | ||
| Cáncer de próstata resistente a la castración | miR-378a-5p | |||
| miR-100-5p | miR-27b-3p | miR-34a-3p | ||
| miR-125b-5p | miR-29b-3p | miR-34c-3p | ||
| miR-128-3p | miR-331-3p | miR-34c-5p | ||
| Subexpresados | miR-146a-5p | miR-365a-3p | miR-31-3p | |
| miR-146b-5p | miR-99a-5p | miR-31-5p | ||
| miR-19b-3p | -let-7c-5p | miR-185-3p | ||
| miR-203a | miR-124-5p | miR-185-5p | ||
| miR-23b-3p | miR-124-3p | miR-205-5p | ||
| miR-34a-5p | miR-205-3p | |||
| Sobreexpresados | miR-9-3p | |||
| Cáncer de próstata agresivo vs no agresivo | Subexpresados | miR-145-5p | miR-330-3p | |
| Expresados | miR-16-5p | |||
| miR-141-3p | miR-19a-3p | |||
| Marcadores séricos en sangre y plasma | Sobreexpresados | miR-200b-3p | miR-19a-5p | |
| miR-375 | ||||
| miR-143-5p | miR-34b-5p | miR-200 | ||
| Transición epitelio-mesenquimal | Expresión alterada | miR-143-3p | miR-200c-5p | miR-203a |
| miR-34b-3p | miR-200c-3p | |||
La cuantificación de la expresión de los miARNs identificados se determinó con la fórmula aritmética 2-ΔΔCT, mediante la plataforma en línea: http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/mirna (Qiagen), con valor estadísticamente significativo de p>0.05 e IC95%.
RESULTADOS
Durante el periodo de estudio se registraron 34 pacientes: 20 asignados al grupo de casos (diagnóstico de cáncer de próstata) y 14 al grupo control (sanos).
El análisis de la expresión de los 62 miARNs, por medio de la plataforma http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/mirna, reportó 9 muestras con expresión alterada, de las que cinco están reportadas como marcadores de cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC): miR-32-5p, miR455-4p, miR-184, miR-31-5p y miR-200b-3p, 3 relacionados con apoptosis: miR-19b-3p, miR34a-5p, miR-32-5p y 3 relacionados con EMT: miR-143-5p, miR-200b-3p y miR-375 (Cuadro 2).
Cuadro 2 Expresión de miARNs en muestras de suero de pacientes con cáncer de próstata
| Muestra | Resultado | miARNs | Fold Change | Relacionado con | Regulación reportada | Muestra reportada | Blancos reportados | Referencia |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Suero | Sobreexpresado | miR-32-5p | 1009.9 | CPRC y apoptosis | Sobreexpresado | Tejido | BTG2 | 31 30 |
| Suero | Sobreexpresado | miR-19b-3p | 6.5 | Apoptosis | Sobreexpresado | PTEN, PI3K/AKT, Ciclina D1 | 32 | |
| Suero | Sobreexpresado | miR-455-5p | 2.5 | CPRC | Sobreexpresado | |||
| Suero | Sobreexpresado | miR-184 | 3.61 | CPRC | Sobreexpresado | 33 | ||
| Suero | Sobreexpresado | miR-31-5p | 10.7 | CPRC, receptor de andrógenos. | Subexpresado | Tejido | AR, E2F1, E2F2, EXO1, FOXM1, MCM2 | 30,34 |
| Suero | Sobreexpresado | miR-143-5p | 159.79 | EMT, migración e invasión. | Subexpresado | Tejido | E-Cadherina | 30,35 |
| Suero | Sobreexpresado | miR-200b-3p | 72.5 | CPRC , proliferación y EMT | Subregulado | Líneas celulares y suero | 30,33,36 | |
| Suero | Subexpresado | miR-375 | 0.22 | EMT y proliferacion | Sobreexpresado | Suero | 25,30,33 | |
| Suero | Subexpresado | miR-34a-5p | 0.12 | Apoptosis | Subexpresado | Líneas celulares | BLC2, SIRT1 | 37 |
CPRC: cáncer de próstata resistente a la castración; EMT: transición epitelio-mesenquimal.
DISCUSIÓN
En este estudio se logró aislar, detectar y determinar la expresión diferencial de miARNs en muestras sanguíneas de pacientes con cáncer de próstata versus sujetos sanos.
Los miARNs identificados extracelularmente en diversos fluidos corporales, incluida la sangre (suero), se asocian con proteínas y lipoproteínas, empaquetados dentro de las estructuras celulares (exosomas, microvesiculas o cuerpos apoptósicos).23
Algunos estudios reportan distintos perfiles de expresión de miARNs alterados en el tejido tumoral prostático versus tejido sano.22,24
Brase y su grupo, en su estudio con muestras de suero de pacientes con cáncer de próstata metastásico vs localizado (n=14), encontraron 5 miARNs sobrexpresados (miR-375, miR-9, miR-200b, miR-141 y miR-516a-3p), que posteriormente se validaron, además de identificar miR-375 y miR-141 como marcadores de alto riesgo de cáncer de próstata.25
En el estudio aquí comunicado se identificaron 9 miARNs de los que siete se encontraron sobrexpresados (miR-32-5p, miR-19b-3p, miR-455-5p, miR-184, miR-31-5p, miR-143-5p, miR-200b3p) y 2 subexpresados (miR-375, miR-34a), teniendo en común con otros estudios el gen miR-375.
Un ensayo efectuado por microarreglos y reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa, cuyos perfiles de miARNs se analizaron en el suero de un modelo de ratón de cáncer de próstata, identificaron como biomarcadores de la enfermedad: miR-141, miR-298, miR-346 y miR-375.26 En el estudio de Lodes y sus colaboradores, también confirmaron la expresión de miR-141 y miR-375 en el suero y plasma de pacientes con cáncer de próstata, respectivamente.27
De acuerdo con otros estudios, el análisis de expresión alterada de miARNs en pacientes con cáncer de próstata reveló que los genes miR-141, miR-200b y miR-375 participan en el control de la expresión del receptor de andrógenos, la plasticidad de la membrana celular28 y la reparación del ADN, respectivamente.29 Estos datos coinciden con los genes miR-200b y miR-375 detectados en nuestro estudio.
Una revisión demostró que los genes: miR-375 y miR-200b se relacionan con la proliferación celular, miR-375 se asocia con la transición epitelio-mesenquimal, miR-143 con la migración e invasión, miR-31 con el receptor de andrógenos y miR-32 con la apoptosis.30
Es importante continuar con la investigación e identificación de miARNs como biomarcadores, con la finalidad de incrementar la sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas actuales para poder disponer de una técnica complementaria para diagnosticar pacientes con cáncer de próstata.
