Semillas

Las semillas de haba (F; Vicia faba) y lupino (L; Lupinus gredensis) se adquirieron en la Empacadora de Semillas Zaragoza, S.A. de C.V. (Ciudad de México, México). Las harinas se obtuvieron a partir de la molienda de las semillas en un molino de corte (modelo de plástico, Pulvex®, México), y se colectaron las fracciones retenidas en tamices de entre 0.14 y 1.19 mm. Las harinas se envasaron al vacío en bolsas de polietileno y se almacenaron en condiciones de oscuridad a 4 °C. Las harinas se analizaron para determinar proteína, humedad, ceniza, fibra cruda y grasa (^{Association of Official Analytical Chemists [AOAC], 2005}), y se consideró que el porcentaje restante correspondía con los carbohidratos.

Materiales

La cepa de Aspergillus niger GH1 fue proporcionada por el Departamento de Investigación de Alimentos de la Universidad de Coahuila (GenBank: HQ450381.1). Flavourzyme® 1000 L (EC 3.4.11.1, una mezcla de endoproteinasa y exopeptidasa de Aspergillus oryzae; 1 000 LAPU·g^-1) se adquirió de Novo Nordisk® (Dinamarca), mientras que el agar papa dextrosa (APD) de la marca DIFCO™ (EUA). Tween-80, ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS), L-leucina, ácido tánico, 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), hipuril-L-histidil-L-leucina (HHL), ácido hipúrico (HA), caseína de grado Hammarsten, pepsina (P7000), pancreatina (P1750), enzima convertidora de angiotensina (ACE-I, A6778) y papel filtro Núm. 41 (Whatman) se compraron a Sigma-Aldrich® (EUA). Los reactivos de electroforesis se obtuvieron de Bio-Rad® (EUA). El resto de productos químicos utilizados fueron de grado analítico, y el agua utilizada fue doblemente destilada y desionizada (ADD).

Hidrólisis enzimática (HE)

La extracción de proteínas de las harinas se llevó a cabo de acuerdo con lo reportado por ^{Alsohaimy, Sitohy, y El-Masry (2007)}, con ligeras modificaciones. Las muestras de harina (50 g) se suspendieron en 1 L de ADD. El pH se ajustó a 12 con NaOH 6 N y 0.1 N, y las suspensiones se mezclaron a 100 rpm en un agitador orbital (E-2500, Thermo Fisher®, EUA), durante 120 min a 25 °C. Posteriormente, se tomaron muestras de 1 mL y se centrifugaron (X-12R, Allegra®, EUA) a 6 000 g durante 30 min a 4 °C. La proteína soluble en los sobrenadantes se determinó por el método Lowry modificado (^{Peterson, 1977}).

Los sobrenadantes se depositaron en matraces Erlenmeyer, se ajustó el pH a 7 con HCl 6 N y 0.1 N, y se agregó Flavourzyme® 1000 L en una relación enzima-sustrato (E/S) de 125 LAPU·g_proteina ^-1. Los matraces Erlenmeyer se agitaron continuamente (150 rpm, 8 h, 50 °C). Cada 60 min se retiraron alícuotas de 250 µL, se adicionaron con 0.01 g·mL^-1 de dodecil sulfato de sodio y se calentaron a 85 °C durante 15 min para inactivar la mezcla enzimática. Los hidrolizados se centrifugaron (10 000 g, 30 min, 4 °C) y se filtraron para eliminar los residuos insolubles. Los filtrados se utilizaron para determinar el grado de hidrólisis (porcentaje de GH) y la distribución de peso molecular (PM). Finalmente, se liofilizaron (Lyph Lock 6, Labconco®, EUA) y se almacenaron a -20 °C hasta que se requirieron para el análisis antioxidante y actividad inhibitoria de ECA. Los hidrolizados enzimáticos F y L se codificaron como HE_F y HE_L, respectivamente.

Hidrólisis por fermentación en estado sólido (FS)

La cepa fúngica se cultivó durante 5 días a 30 °C en un matraz Erlenmeyer (250 mL) con 50 mL de APD. Las esporas se cosecharon utilizando 10 mL de Tween 80 (0.1 % v/v). La FS se llevó a cabo con 10 g de cada harina colocados en matraces Erlenmeyer de 250 mL. El contenido de humedad se ajustó al 50 % (p/p) con una solución de sales (pH 6) que contenía (% p/v): fosfato ácido de potasio (0.1), sulfato de magnesio (0.005) y cloruro de potasio (0.005). Los matraces se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 min, se enfriaron a 30 °C, se inocularon con 2 × 10⁷ esporas·g^-1 de harina seca y se incubaron a 30 °C. Las muestras (por duplicado) se retiraron a intervalos de 24 h durante 6 días, se les añadió ADD (1:3), se agitaron en vórtex durante 1 min y se calentaron a 85 °C durante 15 min para inactivar las proteasas. El material insoluble se removió por centrifugación a 10 000 g, durante 10 min a 4 °C, y se filtró. Los filtrados se utilizaron para determinar el porcentaje de GH y el análisis de distribución de PM; posteriormente, se liofilizaron y almacenaron a -20 °C, hasta que se requirieron para análisis. En el caso de la determinación de la actividad de la proteasa, las muestras se retiraron antes de calentarlas a 85 °C. Los hidrolizados F y L se codificaron como FS_F y FS_L, respectivamente.

Grado de hidrólisis

El porcentaje de GH se calculó determinando los grupos amino libres mediante la reacción con TNBS, para lo cual se utilizó un estándar de leucina (^{Addler-Nissen, 1979}). El número total de grupos amino se determinó en una muestra hidrolizada al 100 % tratada con HCl 6 N a 110 °C, durante 24 h en un horno al vacío (Memnert, EUA).

Actividad de proteasa fúngica

La actividad de la proteasa fúngica en hidrolizados de FS se determinó de acuerdo con el método reportado por ^{Hernández-Martínez et al. (2011)}, con ligeras modificaciones. De manera breve, la mezcla de reacción consistió en 570 µL de una solución que contenía caseína de grado Hammerstein (0.01 g·mL^-1) en amortiguador de fosfatos (50 mM, pH 7) preincubada a 50 °C durante 5 min, y 30 µL de hidrolizado de FS. La reacción enzimática se realizó durante 15 min y se detuvo añadiendo 0.9 mL de ácido tricloroacético (ATC; 0.050 g·mL^-1). La mezcla se centrifugó a 10 000 g durante 15 min a 4 °C y se filtró. Los péptidos solubles en el ATC se estimaron por el método de Lowry modificado. La unidad enzimática (U) se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir un incremento de 0.01 en la absorbancia a 750 nm bajo las condiciones de ensayo (^{Soares-de Castro & Sato, 2014}). La actividad enzimática se expresó en U por gramo de materia seca (U·g^-1) (^{Castañeda-Casasola et al., 2018}).

Electroforesis

La distribución de PM de las PN y sus hidrolizados se determinó por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés), como lo reporta ^{Laemmli (1970)}, empleando la unidad de electroforesis en gel Mini-Protean 2 (Bio-Rad®, EUA). Las muestras se disolvieron en una proporción 1:2 (v/v) en una solución amortiguadora: SDS (20 % p/v), glicerol (2.5 % v/v), β-mercaptoetanol (1.0 % v/v) y azul de bromofenol (0.02 % p/v). El gel de separación (pH 8.8) estuvo constituido por SDS (0.21 % p/v) y acrilamida (20 % p/v), mientras que el gel de concentración (pH 6.8) estuvo conformado por SDS (0.21 % p/v) y acrilamida (5 % p/v). El grosor total del gel fue de 0.75 mm, con 10 cm de gel de separación y 2 cm de gel de concentración. Las bandas de proteínas se revelaron por inmersión del gel en azul brillante Coomassie R-250 (Cat. 161-0400, Bio-Rad®), contenido en una solución de 400 mL de metanol, 70 mL de ácido acético y 530 mL de ADD (^{Hernández-Álvarez et al., 2013}). Se utilizaron estándares de PM de proteínas en un rango de 7.1 a 103 kDa (Cat. 161-0303, Bio-Rad®).

Actividades antioxidante e inhibitoria de ECA

Se determinaron las actividades antioxidante e inhibitoria de ECA de las proteínas y sus hidrolizados en diferentes momentos. La actividad de captación de radical libre DPPH se determinó de acuerdo con el método descrito por ^{Cheison, Wang, y Xu (2007)}, con ligeras modificaciones. Se disolvieron cinco diluciones en serie (0 a 6 mg·mL^-1 de proteína) en una solución amortiguadora de carbonato de sodio/bicarbonato 0.05 M (pH 9.6). Se mezclaron alícuotas de 500 µL con 1.5 mL de DPPH (0.08 mM) en metanol (80 % v/v), se dejaron reposar en oscuridad a temperatura ambiente durante 60 min y se midió la reducción del radical DPPH a 517 nm (UV-160, Shimadzu®, Japón). Como blanco se utilizó el amortiguador.

La actividad antioxidante se expresó como el porcentaje de inhibición del 50 % (CI₅₀) del radical libre DPPH, y se calculó mediante un análisis de regresión de inhibición de DPPH (%) frente a la concentración de proteína hidrolizada (mg·mL^-1).

El ensayo de la actividad inhibitoria de ECA se realizó con el método reportado por ^{Cushman y Cheung (1971)}, con ligeras modificaciones. La mezcla de reacción se constituyó por 5 mM de hipuril-L-histidil-L-leucina como sustrato, NaCl 0.3 M y 2 mU de enzima en amortiguador de borato sódico 50 mM (pH 8.3). Se añadió una muestra de 100 μL a la mezcla de reacción (200 μL) y se incubó a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo con la adición de 300 μL de HCl 1.0 N. Posteriormente, se añadió a la mezcla 1 mL de acetato de etilo, se agitó en un vórtex (30 s) y se centrifugó a 6 000 g por 10 min a 4 °C. La capa superior (750 µL) se transfirió a un tubo de vidrio y se evaporó al vacío a temperatura ambiente durante 2 h. El ácido hipúrico se redisolvió en 1.6 mL de ADD, y se midió la absorbancia a 228 nm. El valor CI₅₀ se determinó mediante un análisis de regresión de inhibición de ECA (%) contra la concentración de proteína hidrolizada (0 a 15 mg·mL^-1) de las diluciones en serie.

Digestión gastrointestinal in vitro

La digestión gastrointestinal simulada se llevó a cabo mediante la acción secuencial de pepsina y pancreatina sobre los hidrolizados de acuerdo con el método reportado por ^{Ketnawa, Martínez-Alvarez, Benjakul, y Rawdkuen (2016)}, con ligeras modificaciones. Los hidrolizados liofilizados se solubilizaron (3 % p/v) en ADD, se ajustó el pH de la solución a 2 con HCl 1 N y se agregó pepsina (4 % p/p de proteína). La mezcla se incubó a 37 °C durante 2 h; después, se ajustó el pH a 7.5 con NaOH 1 N y se añadió pancreatina (10 % p/p de proteína). La mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 2 h, y posteriormente se detuvo la digestión manteniendo los tubos en agua hirviendo durante 10 min. Las mezclas se enfriaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 10 000 g durante 15 min. Los sobrenadantes se liofilizaron, se mantuvieron en tubos de plástico y se almacenaron a -20 °C antes de determinar las actividades antioxidante e inhibitoria de ECA.

Análisis de datos

Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar. Los análisis se realizaron por triplicado a partir de tres experimentos independientes. Se realizaron análisis de varianza de una sola vía para evaluar la composición química de las harinas y las características de los hidrolizados, y pruebas de comparación de medias de Tukey (P ( 0.05). Para dichas pruebas se utilizó el programa estadístico SPSS (SPSS Inc., EUA).

Composición química proximal de las harinas de semillas

El contenido de humedad, proteína, carbohidratos y cenizas fue significativamente diferente para las harinas de semillas de L y F. La segunda tuvo mayor contenido de proteína que L (Cuadro 1). ^{Olukomaiya et al. (2020)} obtuvieron un mayor contenido de proteína (35.77 %) y grasa (6.05 %) en la harina de L. angustifolius L. Los contenidos relativamente altos de proteína en semillas maduras se deben a la acumulación de proteína a lo largo de su desarrollo, la cual varía ligeramente según la especie vegetal, variedad, madurez y condiciones de crecimiento.

Extracción de proteína

La extracción de proteínas se ve afectada por el pH, que influye en la relación entre cargas libres y neutralizadas (^{Alsohaimy et al., 2007}). Los valores de pH ( 8 promueven la disociación tanino-proteína, lo que dificulta la reacción enzimática (^{Guang & Phillips, 2009}). En este trabajo, se comprobó que el uso de soluciones alcalinas a pH 12 produjo rendimientos de proteínas solubilizadas de 87.7 ± 0.9 % para L y de 94.9 ± 2.8 % para F.

Grado de hidrólisis y actividad de la proteasa

La extensión de hidrólisis de proteínas de las semillas evaluadas se monitoreó utilizando el porcentaje de GH, que se define como el porcentaje del número total de enlaces peptídicos en una proteína que se han escindido durante la hidrólisis (^{Addler-Nissen, 1979}). Las curvas de la HE de las proteínas de F y L se caracterizaron por un incremento pronunciado inicial de los valores de GH (hasta aproximadamente 1 h) (Figura 1). Posteriormente, la tasa de hidrólisis disminuyó (alrededor de 2 a 6 h), y finalmente se aproximó a un estado cuasi-estacionario, donde se produjo una hidrólisis muy lenta, posiblemente debido al agotamiento del sustrato, la inhibición enzimática por productos o la autolisis (^{Kristinsson & Rasco, 2000}). Este perfil típico de la HE también se ha reportado para proteínas de frijol mungo y frijol negro var. Jamapa (^{Hernández-Álvarez et al., 2013}; ^{Hong, Wei, Liu, & Hui, 2005}).

Los valores de GH obtenidos después de 6 h de HE fueron de 15.3 ± 0.2 % para F y de 18.3 ± 1.0 % para L. El porcentaje de GH obtenido para la proteína de haba fue mayor que el reportado para la proteína de haba hidrolizada con Flavourzyme durante 1 h (^{Eckert et al., 2019}). Los valores diferentes de GH que muestran las semillas analizadas pueden deberse a las diferencias en su perfil proteínico de almacenamiento, y a las estructuras secundaria y terciaria de las proteínas, que influyeron en su susceptibilidad a la proteólisis (^{Hernández-Álvarez et al., 2013}).

Figura 1 Grado de hidrólisis de proteínas de lupino (L) y haba (F) mediante Flavourzyme^® 1000 L (125 LAPU·g_proteina ^-1, 50 °C, pH 7). 

La producción de proteasa por FS se evaluó con harinas de F y L como sustratos para A. niger. Los resultados mostraron un patrón inconsistente de producción de proteasa en el transcurso de la fermentación de ambas semillas. En la Figura 2 se muestran niveles crecientes de la actividad enzimática hasta 2 días, alcanzando valores de 37.03 ± 0.97 U·g^-1 para F y 128.90 ± 17.75 U·g^-1 para L. Posteriormente, la producción de proteasa disminuyó durante los siguientes 3 a 4 días, aunque en el caso de L se observó un nuevo aumento de la actividad enzimática a los 5 días. Los valores de GH obtenidos después de 6 días de fermentación fueron de 6.9 ± 0.1 % para F y 8.6 ± 0.2 % para L.

Figura 2 Influencia del período de incubación sobre la producción de proteasa por Aspergillus niger GH1 bajo fermentación en estado sólido de harinas de lupino y haba. 

^{Novelli, Barros, y Fleuri (2016)} sugieren que las diferencias en la producción de proteasa por FS podrían depender del tipo de sustrato o de la cepa fúngica. Asimismo, señalan que es posible que ocurra una producción de proteasa similar durante más de un tiempo de fermentación, y que las variaciones de la actividad proteolítica con el tiempo de fermentación podían reflejar adaptaciones subyacentes en la maquinaria molecular y fisiológica de una cepa particular para un sustrato determinado. En el caso particular de la FS por A. niger, dichos autores encontraron una actividad proteolítica máxima para salvado de trigo después de 4 días, y para salvado de soya después de 5 días. Además, conocer los mecanismos biológicos microbianos asociados con este proceso ayudó a lograr niveles óptimos de producción de enzimas por medio de la FS. ^{Belmessikh, Boukhalfa, Mechakra-Maza, Gheribi-Aoulmi, y Amrane (2013)} encontraron varios tiempos de fermentación para A. oryzae de acuerdo con la actividad proteolítica medida y el sustrato utilizado.

Por otro lado, ^{Sumantha, Sandhya, Szakacs, Soccol, y Pandey (2005)} indican que la disminución de la actividad enzimática al aumentar el tiempo de fermentación podría deberse al cese de producción o inactivación de proteasas por autolisis. Las proteasas participan en muchos procesos generales esenciales de las células, así como en su regulación. La función más simple y obvia de las proteasas microbianas es la nutrición, ya que las proteasas extracelulares degradan las proteínas insolubles y los grandes polipéptidos solubles en péptidos más pequeños y aminoácidos, que son accesibles a la célula (^{Ward, Rao, & Kulkarni, 2009}) y estimulan la producción de enzimas (^{Chutmanop, Chuichulcherm, Chisti, & Srinophakun, 2008}).

Distribución del peso molecular

La distribución del PM de las PN e hidrolizados se examinó por el método SDS-PAGE (Figura 3). Se analizaron muestras procesadas durante 120 h en el caso de FS y 6 h para HE, ya que los tiempos más largos no produjeron grandes diferencias en los perfiles de los polipéptidos.

Figura 3 SDS-PAGE de proteína nativa (PN), hidrolizados de proteínas fermentadas en sólido (FS) e hidrolizados enzimáticos de proteínas (HE) de: a) lupino (L) y b) haba (F). Línea St: Estándares de PM (kDa). 

Los SDS-PAGE de las PN de L (PN_L) y F (PN_F) (Figuras 3a y b) mostraron bandas correspondientes a las subunidades α’/α (~77 kDa) y β (~48 kDa) de 7S (β- conglicinina), convicilina (63 kDa), y subunidades ácidas y básicas de globulina 11S (~30-43 kDa y 20-25 kDa, respectivamente). Se ha reportado que las bandas entre 34-37 kDa y 18-25 kDa de proteínas de haba corresponden a las subunidades ácidas y básicas de la fracción 11S, respectivamente (^{Eckert et al., 2019}). En la misma figura se observan bandas de bajo PM (< 20.7 kDa) que podrían deberse a una mezcla de polipéptidos de albúmina, γ-vicilina o polipéptidos de la ruptura post-translacional de proteínas de almacenamiento (^{Barbana & Boye, 2010}).

FS_L mostró la desaparición de las bandas correspondientes a β-conglicinina, convicilina y subunidades ácidas de globulina 11S por la acción proteolítica de proteasas producidas por A. niger, así como de péptidos liberados con PM inferiores a 20.7 kDa (Figura 3a). Por su parte, la HE_L presentó la desaparición de las bandas correspondientes a las subunidades α'/α de 7S (β-conglicinina) y convicilina, y la producción de péptidos con PM predominantes ≤ 7.1 kDa. FS_F (Figura 3b) tuvo disminuciones en la intensidad de bandas de las principales proteínas, y la aparición de bandas correspondientes a péptidos con PM alrededor de 40, 28.8, 20.7, y menores a 7.1 kDa. Las subunidades básicas de globulina 11S fueron resistentes a la hidrólisis de proteasas por A. niger. Por otro lado, HE_F (Figura 3b) mostró principalmente péptidos de PM < 7.1 kDa, por lo que se puede inferir que HE fue más eficiente que FS.

Actividades antioxidante e inhibitoria de ECA

DPPH es un radical libre estable que muestra su máxima absorbancia a 517 nm en metanol. Cuando DPPH se encuentra con una sustancia donadora de protones, como un antioxidante, el radical es eliminado y la absorbancia se reduce. Por lo tanto, DPPH se utiliza ampliamente para evaluar la actividad de eliminación de radicales libres de antioxidantes naturales (^{Wang, Le, Shi, & Zeng, 2014}).

PN_L y PN_F no mostraron capacidad de eliminación o captación de radicales libres, mientras que todos los hidrolizados mostraron actividad antioxidante (Cuadro 2). HE_L mostró actividad antioxidante significativamente más alta que el resto de los hidrolizados, los cuales no fueron significativamente diferente entre sí (Cuadro 2). Estos resultados indican que la actividad antioxidante no estuvo directamente relacionada con el valor de GH o con el PM de los hidrolizados. ^{Jakubczyk et al. (2019)} mencionan que no sólo los péptidos cortos que contienen menos de 20 aminoácidos presentan actividad biológica. ^{Chen, Muramoto, Yamauchi, Fujimoto, y Nokihara (1998)} concluyeron que las propiedades antioxidantes de los péptidos están más relacionadas con su composición, estructura e hidrofobicidad.

Las propiedades antioxidantes de los péptidos se han atribuido a la presencia de ciertos aminoácidos (His, Tyr, Trp, Met, Lys, Cys), y a su correcto posicionamiento en la secuencia peptídica (^{Sarmadi & Ismail, 2010}). La hidrólisis puede aumentar o disminuir la hidrofobicidad de péptidos en función de la naturaleza de la proteína precursora y el PM de los péptidos generados (^{Calderón-de la Barca, Ruiz-Salazar, & Jara-Marini, 2000}). ^{Erdmann, Cheung, y Schröder (2008)} atribuyen la actividad antioxidante de los péptidos a las altas concentraciones de histidina y aminoácidos hidrofóbicos, con secuencias de Pro-His-His. Los valores de DPPH CI₅₀ de los hidrolizados de este estudio fueron significativamente menores que los péptidos de semillas de algodón reportados por ^{Sun et al. (2014)}, y los péptidos del germen de trigo obtenidos por ^{Niu, Jiang, y Pan (2013)}.

Únicamente los hidrolizados HE_L (2.39 mg·mL^-1) y FS_L (14.08 mg·mL^-1) sin digerir presentaron actividad inhibitoria de ECA (Cuadro 2). HE_F y FS_F presentaron valores menores del GH que HE_L y FS_L. Se ha informado que existe una correlación positiva entre la capacidad inhibitoria de ECA y el GH (^{Fajardo-Espinoza, Romero-Rojas, & Hernández-Sánchez, 2020}). Los valores CI₅₀ de HE_L y FS_L fueron superiores a los de los hidrolizados de L. albus y L. angustifolius (0.226-0.268 mg·mL^-1) obtenidos por ^{Boschin, Scigliuolo, Resta, y Arnoldi (2014)} con pepsina, probablemente debido a que en este último caso los péptidos inhibidores de ECA se separaron por filtración de membrana.

^{Liu, Chen, y Lin (2005)} mencionan que los tripéptidos compuestos de aminoácidos con una fuerte hidrofobicidad en su C y N terminales tuvieron una potente actividad inhibitoria de ECA. ^{Arnoldi, Boschin, Zanoni, y Lammi (2015)} observaron valores de CI₅₀ de hidrolizados proteínicos de L. albus, L. angostifolius y L. luteus, obtenidos con diferentes enzimas, entre 0.136 y 1.053 mg·mL^-1. La comparación de los valores de ECA CI₅₀ obtenidos por diferentes autores es una tarea compleja, ya que las diferencias observadas en la actividad inhibitoria de ECA pueden estar relacionadas con diversos factores, como el método de extracción de la proteína, composición de la mezcla de péptidos, parámetros de la hidrólisis, agente de hidrólisis, método analítico para determinar la actividad inhibitoria de ECA, entre otros (^{Chin et al., 2019}).

Digestión gastrointestinal in vitro

La resistencia de péptidos bioactivos contra proteasas gastrointestinales es un requisito previo para su acción in vivo y su posible uso como ingredientes funcionales. Los péptidos resistentes a la digestión gastrointestinal pueden ser absorbidos en su forma intacta a través del intestino para llegar a sus sitios de destino (^{Hannelore, 2004}); de ahí la importancia de evaluar la resistencia de los hidrolizados obtenidos contra enzimas digestivas.

Después de la digestión, todos los hidrolizados mostraron incremento en el GH de la siguiente manera: 12.7 ± 1.3 % para HE_L, 3.2 ± 0.4 % para FS_L, 5.6 ± 1.4 % para HE_F y 7.5 ± 1.9 % para FS_F. Estos resultados sugieren diferencias en la susceptibilidad de los hidrolizados a las enzimas digestivas, y provocaron modificaciones en sus actividades antioxidante e inhibitoria de la ECA (Cuadro 2). Se observaron reducciones significativas de la actividad antioxidante en hidrolizados digeridos, ya que mostraron valores más altos de DPPH de CI₅₀. ^{Girgih et al. (2015)} indican que los hidrolizados no fraccionados muestran una mayor actividad antioxidante debido a un efecto sinérgico entre los péptidos de diferentes PM.

La actividad inhibitoria de ECA por HE_L digerido fue significativamente menor que antes de la digestión, mientras que la de FS_L permaneció sin cambios significativos.