Muestras y reactivos

Las muestras de jales mineros (15 cm de profundidad) se recolectaron en una mina de oro situada en el desierto de Sonora, México (110° 34' 32.84" O, 28° 48' 11.52" N) durante el verano (junio) del 2017. El clima es cálido y seco con temperaturas que a menudo alcanzan 50 °C durante el día, temperatura media anual de 24 °C y 450 mm de tasas de precipitación (^{Servicio Meteorológico Nacional [SMN], 2020}). Este sitio se ha identificado como suelo contaminado con metales tóxicos (^{Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales [SEMARNAT], 2017}). Las muestras (100 g) se colectaron de acuerdo con los métodos estándar para suelos contaminados (^{United States Environmental Protection Agency [USEPA], 1991}) en cinco puntos dentro de una superficie de 1 ha. Las muestras se depositaron en contenedores estériles y se trasladaron al laboratorio para su análisis. Se utilizaron sales metálicas (AgNO₃, CdCl₂, K₂Cr₂O₇, CuSO₄, HgCl₂, (CH₃COO)₂ Pb(3H₂O y ZnSO₄(7H₂O) como fuente de los metales tóxicos Ag⁺, Cd²⁺, Cr⁶⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺ y Zn²⁺. El agar papa dextrosa (PDA, Difco^TM) se utilizó como medio de cultivo.

Composición de los jales mineros

La composición de los metales (análisis elemental) en las muestras de jales mineros se determinó mediante espectroscopia de dispersión de energía (EDS) a través de microscopía electrónica de transmisión (MET). Las muestras se secaron durante la noche a 60 °C y se examinaron utilizando una gradilla de níquel (soporte de muestras). El análisis elemental se realizó con un microscopio electrónico de emisión de campo JEM-2010F.

Aislamiento de cepas fúngicas de suelos contaminados

Muestras de 1 g de suelo de la mina (jales) se vertieron en 100 mL de agua destilada esterilizada; la mezcla se agitó durante 20 min a 25 °C y se hicieron diluciones en serie (10^-1 a 10^-4). De cada dilución se tomaron alícuotas de 100 μL y se colocaron en placas de Petri con PDA e incubaron a 28 °C durante siete días. Las colonias desarrolladas se seleccionaron y se repitió el procedimiento de siembra en placas de Petri con PDA hasta lograr el aislamiento y la purificación de la cepa fúngica.

Preparación de la suspensión de esporas aisladas

Cada colonia aislada se inoculó por separado en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de PDA y se incubaron durante siete días a 28 °C. Posteriormente, se añadieron 100 mL de agua destilada a temperatura ambiente y las esporas se removieron cuidadosamente durante 5 minutos con un agitador magnético. El recuento de esporas se realizó con una cámara Neubauer. Se preparó una suspensión de aproximadamente 10⁸ conidios∙mL^-1 para hacer inóculos en medio de cultivo suplementado con los metales tóxicos a evaluar.

Inoculación de hongos

Las sales metálicas se prepararon por separado a una concentración de 1 mM. En el centro de las placas de Petri con PDA solidificado se depositó la suspensión de esporas (10⁸) en un orificio para obtener colonias de forma circular. Las placas de Petri se incubaron a 28 °C y a los siete días de la inoculación se midió el radio de las colonias; todas las pruebas se realizaron por triplicado.

Identificación de los hongos aislados

Las cepas de los hongos aislados se identificaron con base en las principales características morfológicas de las colonias, considerando características macroscópicas como el color, forma y tipo de colonia, así como las estructuras microscópicas más importantes como las esporas y el conidióforo. Además, la identificación de las cepas se complementó con la amplificación del gen 18S rRNA según el método descrito por White, Burns, Lee, y Taylor (1990). Se amplificó una secuencia parcial del gen 18S rRNA utilizando los iniciadores ITS1 e ITS4. El resultado de la secuencia del gen 18S rRNA se comparó con los disponibles en las bases de datos públicas del GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Índice de tolerancia

La tolerancia fúngica a los metales se evaluó comparando los radios del micelio en el medio de cultivo con y sin el metal respectivo (Valix, Tang, & Malik, 2001). El índice de tolerancia se define como el radio del micelio con metal (cm)/radio del micelio sin metal (cm).

Varias concentraciones de sales metálicas (1, 5, 10, 15 y 20 mM) se utilizaron de acuerdo con el diseño experimental factorial completo categórico de varios niveles. Inóculos de aproximadamente 10⁸ esporas∙mL^-1 se prepararon en medio de cultivo PDA. Las placas inoculadas se incubaron a 28 °C durante siete días. El índice de tolerancia se determinó en la fase exponencial de crecimiento.

Concentraciones mínimas inhibitorias y comportamiento dosis-respuesta

La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la concentración más baja a la que una sustancia inhibe el crecimiento de un microorganismo (^{Rose & Devi, 2018}). En este estudio, las concentraciones mínimas inhibitorias se obtuvieron a partir de los experimentos de índice de tolerancia. Las curvas de comportamiento dosis (concentración de metal)-respuesta (índice de tolerancia) se obtuvieron para cada metal (^{Ezzouhri et al., 2009}).

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante métodos paramétricos y no paramétricos del análisis univariado. La distribución normal de los datos y la homogeneidad de la varianza se comprobaron mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene, respectivamente. La influencia de los factores se evaluó mediante el análisis de la varianza de una vía con la prueba post hoc de Scheffé. La significancia se definió como P < 0.01. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (n = 3). Los resultados también se analizaron mediante el método ANOVA no paramétrico de Kruskal-Wallis. El software OriginLab 8.0 (^{OriginLab Corporation, 2008}) se utilizó para el análisis estadístico.

Composición elemental de los jales mineros

La composición elemental obtenida por MET-EDS indica la presencia de 13 elementos (O, Si, Al, Mg, S, Ca, Fe, K, Ni, Zn, Mn, Pb y As) en la muestra de jales mineros. La presencia de Pb, As y Mn destaca por su potencial toxicidad para una gran diversidad de organismos, desde microorganismos hasta el ser humano; según el análisis MET-EDS, se encuentran en una proporción de 0.14, 0.11 y 0.10 %, respectivamente (Cuadro 1).

Aislamiento fúngico e identificación de cepas tolerantes

Las cepas fúngicas tolerantes a los metales tóxicos (1 mM de Ag⁺, Cd²⁺, Cr⁶⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺ y Zn²⁺) se aislaron de las muestras de jales mineros. Las cepas se identificaron morfológicamente (Figuras 1 y 2) y genotípicamente.

Los hongos filamentosos se identificaron como Aspergillus flavus (núm. de registro MN031598.1) y Aspergillus nidulans (núm. de registro LM653124.1) con base en los datos moleculares, según la búsqueda en GenBank BLAST, con 96.74 % y 99.81 % de similitud, respectivamente (^{BLAST, 2020}). La longitud de la secuencia ITS4 del gen ARN 18S fue de 576 pb para A. flavus y 1 110 pb para A. nidulans.

Las principales características morfológicas macro y microscópicas de A. flavus se muestran en la Figura 1. Las colonias crecieron rápidamente a 28 °C; el micelio inicialmente blanco (primeros dos días) se volvió verde al quinto día (Figura 1a). Los conidióforos (Figura 1b) tuvieron una longitud de 250 μm; las vesículas esféricas fueron completamente cubiertas por conidios y la cabeza biseriada de los conidios. Además, se observó un micelio ramificado con hifas hialinas y septadas (Figura 1c) con un diámetro superior a 1 μm y conidios globosos abundantes con un tamaño de 2.5 a 3 μm (Figura 1d). Estas características morfológicas son consistentes con las reportadas anteriormente para A. flavus (Iheanacho et al., 2014).

Figura 1 Características morfológicas macro y microscópicas de Aspergillus flavus aislado de suelo minero. a) Micelio, b) conidióforo, c) hifa y d) conidios. 

Las características macroscópicas de las colonias de A. nidulans fueron ligeramente diferentes de las de A. flavus (Figura 2). Durante las primeras 48 h, a 28 °C, el micelio mostró un aspecto amarillento que se volvió verde oscuro después de cinco a siete días (Figura 2a). Los conidióforos midieron 150 μm y las vesículas esféricas fueron parcialmente cubiertas (tres cuartas partes de la superficie) por conidios (Figura 2b). Por otro lado, el micelio fue ramificado con hifas hialinas y septadas (Figura 2c). Los conidios globosos midieron entre 2.5 y 3 μm de diámetro. Además, A. nidulans presentó abundantes células Hülle, células relacionadas con la formación de cleistotecios (estructuras cerradas portadoras de esporas) producidas por ciertas especies de Aspergillus (Figura 2d). Las características morfológicas fueron consistentes con las reportadas previamente para A. nidulans (^{Chen et al., 2016}; ^{Larone, 2011}).

Figura 2 Características morfológicas macro y microscópicas de Aspergillus nidulans aislado de suelos mineros. a) Micelio, b) conidióforo, c) hifas y d) conidios y células Hülle. 

Concentración mínima inhibitoria de cepas tolerantes

La CMI se define como la menor concentración de alguna sustancia (metales en este caso) que inhibe el crecimiento de un microorganismo (Ezzouhri et al., 2009). Las CMI para A. flavus y A. nidulans se resumen en el Cuadro 2. Los metales más tóxicos para A. flavus fueron Ag⁺, Cd²⁺ and Hg²⁺; en estos casos, la CMI fue entre 5 y 10 mM. La CMI con Cu²⁺ se registró entre 15 y 20 mM. Curiosamente, el crecimiento de A. flavus no se inhibió con la concentración más alta (20 mM) de Pb²⁺, Zn²⁺ y Cr⁶⁺. Por otro lado, los metales que inhibieron más fácilmente a A. nidulans fueron Ag⁺, Cu²⁺ y Hg²⁺ (1 < CMI < 5), mientras que la CMI para Cd²⁺, Pb²⁺ y Zn²⁺ se situó entre 15 y 20 mM y con Cr⁶⁺ el crecimiento del hongo no se inhibió con la concentración más alta evaluada (20 mM).

Comportamiento dosis-respuesta

En estudios ecotoxicológicos, las relaciones dosis-respuesta son fundamentales para entender la capacidad de los organismos con tolerancia a exposiciones tóxicas frente a agentes químicos, biológicos y físicos (^{Agathokleous & Calabrese, 2019}). En este estudio se utilizó el índice de tolerancia (respuesta) para evaluar el comportamiento de los hongos estudiados ante varias dosis de metales tóxicos. Los resultados del análisis estadístico se pueden observar en los gráficos dosis-respuesta para cada metal en las Figuras 3 a 5.

De acuerdo con ^{Oladipo et al. (2018)}, el índice de tolerancia a los metales para los hongos se puede clasificar de la siguiente manera: ≥1 tolerancia muy alta, 0.8-0.99 tolerancia alta, 0.6-0.79 tolerancia moderada, 0.4-0.59 tolerancia baja y 0.0-0.39 tolerancia muy baja. Con base en esto, A. flavus mostró tolerancia muy alta a los metales Cr⁶⁺, Pb²⁺ y Zn²⁺ en las concentraciones evaluadas, ya que todos los valores del índice de tolerancia fueron superiores a 1 (Figura 3); además, se observaron diferencias significativas entre el control y las concentraciones de metales. A 1, 5, 10 y 15 mM de Cu²⁺, el índice de tolerancia de A. flavus fue muy alto (Figura 4). Los valores fueron estadísticamente iguales, aunque existen diferencias significativas con la muestra control. Solo la mayor concentración de cobre (20 mM) inhibió el crecimiento de A. flavus.

Figura 3 Comportamiento dosis-respuesta de Aspergillus flavus y A. nidulans. Índices de tolerancia con letras distintas denotan diferencias significativas (P < 0.01) entre concentraciones de metal (ANOVA de una vía con prueba post hoc de Scheffé y prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis). 

Figura 4 Comportamiento dosis-respuesta de Aspergillus flavus y A. nidulans. Índices de tolerancia con letras distintas denotan diferencias significativas (P < 0.01) entre concentraciones de metal (ANOVA de una vía con prueba post hoc de Scheffé y prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis). 

El índice de tolerancia al Ag⁺, Cd²⁺ y Hg²⁺ fue muy alto solo con 1 y 5 mM (Figura 5). Aspergillus flavus y A. nidulans dejaron de crecer con concentraciones más altas de estos metales. El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre el índice de tolerancia de A. flavus a 1 y 5 mM de Ag⁺ en comparación con el control (Figura 5a).

Figura 5 Comportamiento dosis-respuesta de Aspergillus flavus y A. nidulans. Índices de tolerancia con letras distintas denotan diferencias significativas (P < 0.01) entre concentraciones de metal (ANOVA de una vía con prueba post hoc de Scheffé y prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis). 

Por otro lado, A. nidulans mostró un comportamiento diferente con un índice de tolerancia muy alto a 1 mM de Cu²⁺, Ag⁺ y Hg²⁺ (Figura 5), el cual disminuyó bruscamente hasta la inhibición con el resto de las concentraciones. En presencia de Pb²⁺, Zn²⁺ y Cd²⁺, la tolerancia con 1 mM fue de muy alta a moderada, disminuyendo gradualmente hasta la inhibición completa del crecimiento a 20 mM (Figura 3).

Especies de hongos tolerantes

La investigación muestra que A. flavus y A. nidulans, aislados de la misma fuente contaminada, desarrollaron niveles diferentes de resistencia a los metales tóxicos. La tolerancia alta y moderada de las cepas a los metales es relevante, ya que el Pb²⁺, Hg²⁺, Cd²⁺, Cr⁶⁺ han sido clasificados como sustancias prioritarias por sus características tóxicas (^{ATSDR, 2019}).

El suelo contiene comunidades microbianas de gran diversidad, en especial hongos que se encuentran principalmente en los 10 cm superiores. De acuerdo con los reportes de hongos aislados del suelo, las especies predominantes son de los géneros Fusarium, Penicillium, Trichoderma, Aspergillus y Geotrichum. Estos tienen una distribución cosmopolita (^{Ezzouhri et al., 2009}; ^{Jiang, Wang, Xue, Cao, & Zhang, 2016}; ^{Mohammadian et al., 2017}; ^{Oladipo et al., 2018}); sin embargo, la diversidad micológica en ambientes con presencia de sustancias tóxicas suele ser pobre en comparación con ambientes sanos. En el presente trabajo solo se encontró el género Aspergillus.

La presencia y el éxito de un organismo en un ecosistema dependen tanto de sus necesidades nutricionales como de su tolerancia ambiental. Los límites de tolerancia a factores de estrés específicos son los que determinan, en gran medida, los habitantes en ambientes extremos incluidos los contaminados con sustancias tóxicas. Algunos microorganismos están especialmente adaptados a hábitats extremos, donde otros microorganismos no pueden sobrevivir (^{Dixit et al., 2015}).

Los estudios acerca de los hongos filamentosos en el suelo del desierto de Sonora son pocos, uno de esos estudios es el de ^{Ranzoni (1968)}, quien reportó varias especies de hongos anamórficos, entre ellos varios del género Penicillium y Aspergillus, incluyendo A. flavus y A. nidulans. Estos resultados son similares a los reportados para otras regiones de suelos semiáridos. Oliveira et al. (2013) encontraron que los géneros más abundantes en una región semiárida de Brasil son Aspergillus y Penicillium. ^{Abdullah y Al-Bader (1990}) informaron del predominio de especies de Aspergillus en hongos termófilos y termotolerantes en suelos de Irak. El estudio de ^{Mouchacca (2005)} muestra los hongos encontrados en las regiones áridas de Medio Oriente entre 1940 y 2000 y señala la prevalencia de hongos anamórficos (siete especies del género Aspergillus).

En otros países se ha confirmado la presencia de hongos filamentosos en minas contaminadas con metales: Nigeria (Oladipo et al., 2018), Irán (^{Mohammadian et al., 2017}), China (^{Jiang et al., 2016}) y Corea (^{Babu, Shim, Bang, Shea, & Oh, 2014}). Los hongos filamentosos autóctonos, aislados de lugares contaminados, tienen en común un índice de tolerancia alto a moderado frente a varios metales tóxicos. Esta característica extraordinaria puede explicarse por estrategias desarrolladas por los microorganismos para tolerar los metales tóxicos y evitar el daño celular (^{Gadd, 1993}). Entre estas se puede enumerar la quelación, la unión a la pared celular (secuestro extracelular) y el secuestro físico intracelular del metal mediante la unión a proteínas y otros ligandos.

Por otra parte, se ha informado que el estrés por metales tóxicos también puede reducirse mediante la síntesis de melanina. En sentido general, la melanina se refiere a los pigmentos oscuros sintetizados por organismos de todos los reinos biológicos, incluidos los hongos (^{Nosanchuk & Casadevall, 2003}). Al respecto, en el desierto de Sonora se han encontrado predominantemente hongos filamentosos con micelio de color oscuro (negro, marrón o verde intenso) (^{Ranzoni, 1968}). Se ha sugerido que las melaninas desempeñan muchas funciones en la biología de los hongos (^{Cordero & Casadevall, 2017}). Dadas sus numerosas propiedades singulares, parece probable que las melaninas ayuden a los hongos a sobrevivir a una serie de estreses bióticos y abióticos. Estos últimos incluyen la alta radiación UV, las especies reactivas de oxígeno y los metales tóxicos. Las melaninas se polimerizan a partir de compuestos fenólicos e indólicos. El resultado son pigmentos hidrofóbicos con carga negativa y alto peso molecular (^{White, 1958}). Las melaninas forman gránulos que pueden acumularse en la superficie celular o liberarse al espacio extracelular (^{Malofe, Solhaug, Minibayera, & Beckett, 2019}). Las melaninas presentan alta afinidad de unión a diferentes iones metálicos (^{Cordero & Casadevall, 2017}). Los grupos funcionales de carboxilo, amina e hidroxilo del pigmento pueden potencialmente unir metales. Por lo tanto, la importancia de las melaninas en la tolerancia a los metales es un tema de interés para investigaciones futuras.

Cada especie puede utilizar varias estrategias. Además, debido a su gran relación superficie/volumen y a su intensa actividad metabólica, los hongos filamentosos son vectores muy eficientes para acumular metales (^{Dixit et al., 2015}).

Comportamiento dosis-respuesta

Se ha reportado una notable tolerancia a los metales tóxicos por parte de las especies de Aspergillus (^{Thippeswamy, Shivakumar, & Krishnappa, 2014}). En esta investigación, Cu²⁺ fue muy tóxico para A. nidulans, ya que solo creció a una concentración de 1 mM; sin embargo, otros estudios han demostrado que algunas especies de hongos son resistentes a este metal (^{Oladipo et al., 2018}). Se ha demostrado que la tolerancia al Cu²⁺ se debe a un proceso activo que implica la síntesis de una metalotioneína (^{Kermasha, Pellerin, Rovel, Goetghebeur, & Metche, 1993}). Esta es una proteína de bajo peso molecular rica en cisteína que permite la unión del cobre, el cadmio y el zinc; una vez unidos, estos metales se vuelven inocuos.

Hg²⁺ es tóxico, pero A. nidulans y A. flavus siguen siendo capaces de crecer a 5 y 1 mM, respectivamente. Se ha reportado que otras especies de hongos son capaces de tolerar y acumular este metal (^{Dhawale, Lane, & Dhawale, 1996}; ^{Kurniati, Arfarita, & Imai, 2014}). Por otra parte, el Cd²⁺ fue uno de los metales más tóxicos para A. flavus. Este resultado coincide con otros experimentos que han reportado una fuerte inhibición de los hongos expuestos a concentraciones mínimas de sales de cadmio (^{Joo & Hussein, 2012}; ^{Oladipo et al., 2018}). Por el contrario, A. nidulans resistió concentraciones más altas de este metal, como se informó en otros trabajos; por ejemplo, ^{Massaccesi, Romero, Cazau, y Bucsinszky (2002)} demostraron que varias especies de hongos filamentosos, aislados de sedimentos contaminados por actividades industriales, eliminaron hasta 70 % del Cd²⁺ en 13 días. Estos resultados demuestran la adaptabilidad de los microorganismos fúngicos, así como su potencial de uso en la biorremediación.

Pb²⁺, Cr⁶⁺ y Zn²⁺ ejercieron efecto diferente sobre el crecimiento de A. flavus; la mayor concentración evaluada en este trabajo no fue suficiente para inhibir el crecimiento del microorganismo. El mismo comportamiento se ha observado en levaduras aisladas de minas de carbón (^{Castro-Silva et al., 2003}). A pesar de ello, también se ha observado que el Zn²⁺ puede tener efectos tóxicos en ciertas especies de hongos como Penicillium atramentosum 25SL, que disminuyó su crecimiento cuando fue expuesto a soluciones de 40 mM (^{Levinskaite, 2001}). Se ha sugerido que el mecanismo por el que algunas especies de hongos inmovilizan o capturan Zn²⁺ es el intercambio intracelular y extracelular en forma de precipitación de polifosfatos. Aunque el Zn²⁺ es esencial para todos los organismos, en concentraciones muy elevadas puede tener un efecto tóxico (^{Balsalobre et al., 2003}). Para ciertas especies de hongos, la exposición a sustancias tóxicas en su hábitat puede inducir cambios adaptativos que les permitan seguir siendo viables en esas condiciones de estrés (^{Valix et al., 2001}). Se sabe que la especie Aspergillus spp. ha desarrollado un mecanismo enzimático para desintoxicar el Cr⁶⁺; este mecanismo está mediado por un sistema enzimático antioxidante en el que participan peroxidasas, catalasas y peróxido de ascorbato (^{Chakraborty, Mukherjee, & Das, 2012}; ^{Srivastava & Thakur, 2006}).

La vida en la Tierra ha existido desde sus inicios en entornos extremos, en los que las células han estado expuestas a los radicales libres y a diversas sustancias tóxicas (^{Calabrese et al., 2007}). Resulta interesante observar que el comportamiento de tolerancia de A. flavus cuando se expone a metales tóxicos fue estimulado (valores por encima del control); particularmente, el hongo mostró estimulación con dosis bajas de Cu²⁺ y Ag⁺ (Figuras 4 y 5a). Según ^{Calabrese y Blain (2009)}, este comportamiento corresponde a la hormesis, un fenómeno característico que en toxicología describe procesos bifásicos de respuesta a la dosis en los que las células u organismos (animales, hongos o plantas) se benefician de la exposición a dosis bajas de factores ambientales tóxicos o nocivos. A este proceso le sigue la inhibición y los efectos tóxicos a dosis más altas, como se observa en las Figuras 4 y 5. El mecanismo que explica la hormesis (condicionamiento, respuesta adaptativa y autoprotección) establece que a niveles de estrés bajos se autorregulan vías metabólicas ya existentes a nivel molecular y celular. En el caso de los hongos, los mecanismos que les ayudan a resistir la presencia de metales tóxicos son rutas horméticas que involucran proteínas y péptidos de unión, como las fitoquelatinas y las metalotioneínas (Sácký et al., 2014), que les permiten incorporar metales tóxicos a sus células. Por otro lado, existen proteínas con funciones enzimáticas; por ejemplo, las de la superfamilia del citocromo P450 y la lacasa principalmente (^{Sharma, Dangi, & Shukla, 2018}), utilizadas por los hongos para biotransformar los metales a formas químicas menos tóxicas. Para A. nidulans no se observó hormesis con las concentraciones de los metales.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos del diseño experimental factorial completo se analizaron mediante varios métodos estadísticos, utilizados habitualmente en la investigación toxicológica. El análisis de dichos métodos nos ayuda a elegir la prueba estadística adecuada para evitar inflar el error tipo I cuando la hipótesis nula es verdadera y se rechaza (hipótesis nula: las medias son iguales) en nuestra interpretación de los resultados. El análisis multivariante de la varianza, el análisis de regresión lineal multivariante y el análisis de regresión logarítmica normal no fueron apropiados, debido a la cantidad elevada de ceros cuando las dosis del metal resultaron inhibidoras y por la variabilidad elevada cuando el crecimiento del hongo fue estimulado por encima del control. Por tanto, se realizó un análisis estadístico de un factor a la vez para determinar la significancia y el efecto de concentración para A. flavus y A. nidulans con un metal específico.

Posteriormente, se realizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov, la cual reveló que los datos se distribuían normalmente, excepto el índice de tolerancia cero; sin embargo, la prueba de Levene indicó que algunos datos fueron heteroscedásticos. Es interesante que, para el análisis de varianza de una vía, los supuestos de homocedasticidad o normalidad rara vez se ponen a prueba en estudios de toxicología (^{Na, Yang, Bae, & Lim, 2014}).

En este caso, el análisis de varianza de una vía se complementó con la prueba de Scheffé que es una prueba post hoc más conservadora se utilizó un nivel de significancia conservador (P < 0.01) la respuesta más adecuada a un análisis de varianza significativo (^{Oliveira et al., 2014}). El procedimiento Scheffé es el único de comparación múltiple totalmente coherente con los resultados del análisis de varianza. En otras palabras, con el procedimiento Scheffé se garantiza que si el análisis de varianza sugiere una diferencia entre grupos (grupos en este estudio: concentraciones de metales para cada hongo) entonces al menos una de las comparaciones Scheffé será significativa al mismo nivel (^{Ruxton & Beauchamp, 2008}).

Asimismo, se realizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para corroborar las diferencias significativas en cada concentración de metal; sin embargo, Kruskal-Wallis se basa en diferencias de medianas y rangos. Tanto la prueba paramétrica como la no paramétrica tuvieron los mismos resultados; el comportamiento de las dos especies de hongos es estadísticamente diferente y también depende del metal y la concentración