Aislamiento e identificación del hongo

Se analizaron muestras de suelo de una mina activa ubicada en el estado de Sonora, México, las cuales fueron recolectadas en recipientes esterilizados. Las muestras (1 g) se depositaron en 100 mL de agua destilada esterilizada; la mezcla se agitó durante 20 min a temperatura ambiente y se hicieron diluciones seriadas (10^-1 a 10^-4). Después se tomaron alícuotas de 100 µL de cada dilución, se colocaron en placas Petri con medio de cultivo PDA (papa dextrosa agar) y se incubaron a 28 °C por cinco días. Las colonias desarrolladas se seleccionaron y se repitió el procedimiento de siembra en placas Petri con PDA, hasta lograr el aislamiento y purificación de la cepa fúngica. Esta se identificó con base en los principales rasgos morfológicos de las colonias, considerando características macroscópicas tales como color, forma y tipo de colonia, además de las estructuras microscópicas más importantes como esporas, cabeza conidial y conidióforo.

Preparación de la suspensión de esporas

El hongo aislado se inoculó en matraces Erlenmeyer de 250 mL, que contenían 50 mL de PDA, y se incubaron durante siete días a 28 °C. Posteriormente se agregaron 100 mL de agua destilada a temperatura ambiente y se agitaron cuidadosamente durante 5 min con un agitador magnético. El conteo de esporas se realizó con una cámara Neubauer. La suspensión de esporas se utilizó en la inoculación del medio de cultivo suplementado con las sales de los metales tóxicos a evaluar.

Índice de tolerancia

Las sales AgNO₃, CdCl₂, K₂Cr₂O₇, CuSO₄, HgCl₂, (CH₃COO)₂Pbx3H₂O y ZnSO₄x7H₂O se utilizaron como fuente de los metales Ag, Cd, Cr, Cu, Hg, Pb y Zn, respectivamente. El efecto de los metales sobre el crecimiento del hongo, también conocido como índice de tolerancia o resistencia, se determinó siguiendo la metodología descrita por ^{Ezzouhri et al. (2009}). Dicho método considera que el índice de tolerancia es igual a la relación entre el radio de las colonias del hongo tratadas con el metal y el radio de las colonias del hongo sin metal (control), es decir:

Índice de tolerancia =Radiocmdel micelio tratado con metalRadiocmdel miceliosin⁡metal

El hongo aislado se sembró en PDA suplementado con las sales metálicas, de manera individual, a una concentración de 1 mM. Previamente, se hizo un orificio en el centro del PDA solidificado en las placas Petri con el fin de obtener colonias de forma circular y, de este modo, hacer las mediciones del radio. En dicho orificio se depositó una suspensión de 10⁸ esporas·mL^-1; las cajas se incubaron a 28 °C. El crecimiento del hongo se determinó a los siete días después de la inoculación midiendo el radio de las colonias; todos los ensayos se realizaron por triplicado. Las esporas utilizadas se colectaron de un cultivo del hongo con siete días de crecimiento previo en PDA.

Concentración mínima inhibitoria

La concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como aquella concentración más baja de metal que inhibe el crecimiento de un microorganismo (^{Ezzouhri et al., 2009}). En este estudio, para determinar la CMI, el hongo se inoculó en el medio de cultivo PDA que contenía, individualmente, las sales metálicas AgNO₃ (nitrato de plata), CdCl₂ (cloruro de cadmio), K₂Cr₂O₇ (dicromato de potasio), CuSO₄ (sulfato de cobre), HgCl₂ (cloruro de mercurio), (CH₃COO)₂Pbx3H₂O (acetato de plomo trihidratado), y ZnSO₄x7H₂O (sulfato de zinc heptahidratado) como fuente de los metales Ag, Cd, Cr, Cu, Hg, Pb y Zn, respectivamente, en concentraciones de 5, 10, 15 y 20 mM. Se utilizaron inóculos de 10⁸ esporas·mL^-1 con siete días de crecimiento. Las placas inoculadas se incubaron a 28 °C por siete días. El crecimiento del radio de extensión (cm) de las colonias se midió cada 24 h, para determinar el índice de tolerancia a cada concentración. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Identificación del hongo aislado

De acuerdo con las características macroscópicas, las colonias del hongo en PDA, después de siete días de crecimiento, fueron blancas a amarillentas (entre las primeras 24 a 48 h de cultivo), volviéndose negras y granulosas, con reverso amarillo a verde (Figura 1). Entre las características microscópicas destacan cabezas conidiales globosas de tono negro a café; conidióforos lisos de color café claro y conidios o esporas globosas. Las características mencionadas coinciden para el hongo Aspergillus niger Tiegh. 1867 (^{Abarca, 2000}; ^{Sáez, Flórez, & Cadavid, 2002}).

Figura 1. A) Aspergillus niger en medio PDA después de siete días de crecimiento a 28 °C. B) Esporas de A. niger observadas en un microscopio óptico invertido 60x, después de siete días de cultivo en PDA. 

Índice de tolerancia del hongo

La exposición prolongada de los hongos del suelo a metales puede generar una adaptación fisiológica con modificaciones importantes reduciendo el número de poblaciones. Los cambios pueden estar asociados al incremento en la capacidad de biosorción, bioacumulación y transformación de metales (^{Ashraf & Ali, 2007}). ^{Iram, Zaman, Iqbal, y Shabbir (2013)} encontraron que algunos hongos del género Aspergillus suelen predominar en suelo contaminado con metales.

En este estudio, el índice de tolerancia de A. niger, expuesto a una concentración 1 mM de cada sal metálica fue mayor de 0.80, después de siete días de crecimiento. El Cuadro 1 muestra el índice de tolerancia del hongo a cada una de las sales evaluadas. Un hongo filamentoso puede considerarse altamente tolerante cuando se expone a una concentración de al menos 1 mM de metal y el índice de tolerancia es igual o mayor que 0.80 (^{Ezzouhri et al., 2009}). Con base en lo anterior, el hongo filamentoso aislado fue altamente tolerante a todos los metales evaluados.

Cuando A. niger se expuso a una concentración 1 mM de cloruro de cadmio se obtuvo un índice de tolerancia de 0.89 ± 0.12. Este resultado es ligeramente superior al descrito por ^{Ezzouhri et al. (2009)} para Penicillium sp. (S4S) y Penicillium sp. (S5S) con índices de 0.55 y 0.62, respectivamente, usando sulfato de cadmio como fuente de dicho elemento. Estos autores también determinaron que el índice de Alternaria alternata (Fr) Keissl. 1992 es solo de 0.13 y que varias especies de Fusarium sp. no crecieron en presencia de 1 mM de cadmio. ^{Roane y Pepper (2000)} mencionan que los niveles de tolerancia entre especies de hongos pueden ser diferentes, debido a la variación de los mecanismos de resistencia.

En el caso del mercurio (1 mM de cloruro de mercurio), A. niger tuvo un índice de tolerancia de 1.03 ± 0.14 por lo que resultó altamente tolerante al metal. ^{Kurniati, Arfarita, e Imai (2014)} reportaron que Aspergillus flavus Link 1809 tuvo un índice de tolerancia de 0.80 con 25 ppm de cloruro de mercurio.

El plomo es el metal que se encuentra mayormente como contaminante en suelo, agua y aire y es también altamente tóxico para las plantas, humanos, animales y microorganismos (^{Low, Lee, & Liew, 2000}). De ahí la importancia de la búsqueda de alternativas para tratar sitios contaminados con este metal. En este sentido, se encontró que A. niger es altamente tolerante a 1 mM de acetato de plomo, ya que su índice fue 1.05 ± 0.18.

En este trabajo se observó que A. niger fue altamente tolerante a la plata, ya que el índice fue 0.94 ± 0.11 (usando nitrato de plata como fuente del elemento). En la actualidad no existen muchos estudios que demuestren la tolerancia o resistencia de los hongos filamentosos a dicho metal; sin embargo, ^{Singh (2006)} encontró que Fusarium oxysporum Link 1809 reduce iones de plata en solución, dando lugar a una suspensión estable.

Con respecto al cobre (1 mM de sulfato de cobre), A. niger mostró índices de tolerancia de 0.88 ± 0.04; es decir, el hongo es altamente tolerante. ^{Ezzouhri et al. (2009)} indicaron valores similares de tolerancia a 1 mM de cobre: 0.79, 0.98, 0.91 y 1.0 para los hongos Penicillium sp. (S2W), Penicillium sp. (S2S), Fusarium sp. (S1S) y Aspergillus niger (S5W), respectivamente.

El índice de tolerancia de A. niger a 1 mM de sulfato de zinc fue 0.81 ± 0.07, por lo tanto, el hongo fue altamente tolerante. ^{Sintuprapa, Thiravetyan, y Tanticharoen (2000)} sugirieron que ciertas especies de hongos filamentosos toleran al zinc gracias al mecanismo de captación a través del intercambio intra y extracelular en forma de precipitación de polifosfatos.

Finalmente, en el caso del cromo (1 mM de dicromato de potasio), A. niger tuvo un índice alto de tolerancia de 1.27 ( 0.06. ^{Ezzouhri et al. (2009)} reportaron índices similares en otros hongos; estos autores encontraron que A. alternata y Penicillium sp. fueron altamente tolerantes al cromo (dicromato de potasio como fuente) con índices de 1.02 y 1.23, respectivamente. También indicaron que Geotrichum candidum Link 1809 es poco tolerante al metal, ya que determinaron un índice de 0.19.

Concentración mínima inhibitoria

El Cuadro 2 indica la concentración mínima de los metales (en forma de sal metálica) que inhibieron el crecimiento de A. niger. El mercurio, el cobre y la plata fueron los más tóxicos para A. niger, ya que la CMI se encontró entre 5 y 10 mM de cada sal metálica, mientras que, para cloruro de cadmio, la CMI fue entre 15 y 20 mM. En presencia de las sales de plomo, zinc y cromo, el hongo creció incluso con la concentración más elevada de dichos metales; por lo tanto, la CMI fue mayor de 20 mM. En este sentido, otros estudios con concentraciones más altas de plomo, zinc y cromo son necesarios para encontrar aquellas que inhiban el crecimiento de A. niger.

En las concentraciones más bajas de las sales metálicas (1 y 5 mM), el hongo fue muy tolerante y mostró un fuerte crecimiento, excediendo el control (sin metal) en el caso del plomo, zinc y cromo. El patrón de crecimiento sugiere el desarrollo de tolerancia o la adaptación de los hongos a la presencia de metales.

La Figura 2 muestra los índices de tolerancia de A. niger expuesto a 5 mM de cada sal metálica. A partir de dicha concentración, la fase de latencia se prolongó en comparación con el control, especialmente con Cd, Hg, Cu y Ag; el crecimiento del hongo se pudo observar y medir hasta los tres días después de la inoculación.

Figura 2 Índice de tolerancia de Aspergillus niger en presencia de 5 mM de AgNO₃, CdCl₂, CuSO₄, HgCl₂, (CH₃COO)₂Pbx3H₂O, ZnSO₄x7H₂O y K₂Cr₂O₇, como fuente de los metales Ag, Cd, Cu, Hg, Pb, Zn y Cr, respectivamente. Sobre las barras se representa la desviación estándar de la media. 

Se observó que A. niger fue tolerante hasta 5 mM de nitrato de plata, ya que el hongo no tuvo capacidad de crecimiento a 10 mM. La plata es un metal usado ampliamente en las industrias fotográfica, eléctrica, electrónica y química; la forma soluble, al igual que en otros metales pesados, resulta muy peligrosa porque es transportada fácilmente quedando disponible para plantas y animales. Para los humanos, el envenenamiento con este tipo de metales puede provocar disfunción severa de los riñones, sistema reproductivo, hígado, cerebro y sistema nervioso central (^{Dixit et al., 2015}). De ahí, la importancia de la búsqueda de posibles estrategias para tratar sitios contaminados con el metal.

En presencia de cobre (sulfato de cobre), la CMI de A. niger fue entre 5 y 10 mM. El hongo tuvo capacidad de crecimiento hasta 5 mM con un índice de tolerancia de 1.18 ± 0.38, después de siete días de incubación (Figura 2). ^{Ezzouhri et al. (2009)} encontraron valores similares de CMI para Penicillium sp. (S4W), Penicillium sp. (S5S), siendo 7.5 mM < CMI < 10 mM para ambos hongos, usando también sulfato de cobre como fuente del metal. Según ^{Kermasha, Pellerin, Rovel, Goetghebeur, y Metche (1993)}, la tolerancia o resistencia de hongos al cobre, como A. niger, se debe a un proceso activo que involucra la síntesis de una metalotioneína (proteína dependiente del cobre).

El mercurio parece ser tóxico para Aspergillus; a pesar de ello, ciertas especies todavía son capaces de crecer a ciertas concentraciones del metal. En este trabajo, A. niger resultó altamente tolerante al mercurio (índice de tolerancia de 1.03 ± 0.14 a 1 mM de cloruro de mercurio). Al aumentar la concentración de la sal mercurial a 5 mM, el índice de tolerancia disminuyó a 0.82 ± 0.03. El hongo mostró capacidad de crecimiento significativo en presencia de hasta 5 mM de cloruro de mercurio, pero la inhibición fue completa a 10 mM. En otro estudio se encontró que A. flavus tolera hasta 100 ppm de mercurio (^{Kurniati et al., 2014}). También se ha indicado que Phanerochaete chrysosporium Burds 1974 es tolerante y tiene la capacidad de acumular dicho metal (^{Dhawale, Lane, & Dhawale, 1996}).

La Figura 3 muestra el índice de tolerancia de A. niger a 10 mM de sales de cadmio, plomo, zinc y cromo. Dicha concentración redujo el crecimiento y aumentó la fase de latencia en comparación con el control (sin metal). No obstante, en algunos casos, el hongo creció relativamente rápido, incluso después de una larga fase de latencia; por ejemplo, con sales de plomo y cromo a 15 y 20 mM. La reducción de la tasa de crecimiento es una respuesta típica de los hongos en presencia de tóxicos (^{Gadd, 1993}), mientras que el alargamiento de la fase de latencia no siempre está presente (^{Ezzouhri et al., 2009}).

Figura 3 Índice de tolerancia de Aspergillus niger en presencia de 10 mM de CdCl₂, (CH₃COO)₂Pbx3H₂O y ZnSO₄x7H₂O, K₂Cr₂O₇ como fuente de los metales Cd, Pb, Zn y Cr, respectivamente. Sobre las barras se representa la desviación estándar de la media. 

La Figura 4 muestra que A. niger tuvo capacidad de crecimiento hasta 15 mM de cloruro de cadmio con un índice de tolerancia de 0.61 ± 0.09, después de siete días de incubación a 28 °C; sin embargo, a 20 mM ya no hubo crecimiento. Esto pudo deberse a un efecto de inhibición producto de la intoxicación del hongo, ya que el cadmio es considerado uno los metales más peligrosos por su alta estabilidad y toxicidad. ^{Joo y Hussein (2012)} observaron una fuerte inhibición del crecimiento de A. niger expuesto a 1 mM de cadmio. ^{Jabbari, Faezi, Khosravan, Farahmad, y Shakibaie (2010)} observaron que el cadmio ejerce efectos severos de inhibición en los procesos fisiológicos de los organismos, en algunos casos, incluso a concentraciones menores de 2 ppm. En contraste, ^{Massaccesi, Romero, Cazau, y Bucsinszky (2002}) indicaron que varias especies de hongos filamentosos, aislados de sedimentos industriales contaminados, pudieron remover de 63 a 70 % del cadmio durante 13 días de crecimiento. Además, ^{Mohammadian et al. (2015}) indicaron que Aspergillus versicolor Vuillemin 1903 y Aspergillus fumigatus Fresenius 1863 presentan CMI de 2 000 mg·L^-1 y 1 000 mg·L^-1, respectivamente. Lo anterior demuestra la capacidad de adaptación de los microorganismos, así como su potencial de uso en biorremediación.

Figura 4 Índice de tolerancia de Aspergillus niger en presencia de 15 mM de CdCl₂, (CH₃COO)₂Pbx3H₂O, ZnSO₄x7H₂O y K₂Cr₂O₇ como fuente de los metales Cd, Pb, Zn y Cr, respectivamente. Sobre las barras se representa la desviación estándar de la media. 

La Figura 5 muestra que A. niger presentó mayor resistencia al plomo, zinc y cromo, ya que toleró una concentración de 20 mM de las sales utilizadas como fuente de estos metales. En el caso del plomo, el hongo tuvo un índice de tolerancia de 0.71 ± 0.12 después de siete días. Se observó un incremento en el crecimiento del hongo en todas las concentraciones evaluadas; ^{Ezzouhri et al. (2009)} observaron un comportamiento similar en A. alternata al incrementar 4 % su crecimiento en presencia de 1 mM de carbonato de plomo. Dichos autores también encontraron que la CMI (mM) de plomo para Penicillium sp. (S3S) Penicillium sp. (S4W), Penicillium sp. (S5S), Fusarium sp. (S5S), A. niger (S5W) y A. niger (S5S) fue de 12.5 < CMI < 15, 20 < CMI < 25, 7.5 < CMI < 10, 12.5 < CMI < 15, 20 < CMI < 25 y 25 < CMI < 30, respectivamente; todas las cepas fueron aisladas de suelo con actividad minera. Por otra parte, ^{Sanyal, Rautaray, Bansal, Ahmad, y Sastry (2005)} reportaron que el plomo no es tóxico para el hongo F. oxysporum, el cual crece fácilmente después de la exposición a este metal.

Figura 5 Índice de tolerancia de Aspergillus niger en presencia de 20 mM de (CH₃COO)₂Pbx3H₂O, ZnSO₄x7H₂O y K₂Cr₂O₇ como fuente de Pb, Zn y Cr, respectivamente. Sobre las barras se representa la desviación estándar de la media. 

El hongo A. niger resultó moderadamente tolerante al zinc, ya que se obtuvieron índices de 0.87 ± 0.07, 0.55 ± 0.01, 0.88 ± 0.10, 0.66 ± 0.02 y 0.55 ± 0.01 a 1, 5, 10, 15 y 20 mM de sulfato de zinc, respectivamente, después de siete días de crecimiento. Dado que aún a 20 mM se observó crecimiento importante del micelio del hongo, la CMI es mayor que dicha concentración. ^{Vadkertiova y Slavikova (2006)} encontraron que Pichia anomala Hansen 1904, Candida krusei Berkhot 1923 y Cryptococcus laurentii (Kuff.) C. E. Skinner 1950 toleran el zinc a concentraciones superiores de 20 mM, resultado similar al de este trabajo con A. niger. ^{Castro-Silva et al. (2003}) también observaron tal similitud en cepas de levaduras aisladas de minas de carbón. Por otro lado, ^{Levinskaite (2002)} demostró que el índice de crecimiento de Penicillium atramentosum Pitt 1980 25SL disminuyó lentamente a partir de 40 mM de zinc, usando sulfato de zinc como fuente del metal. Por su parte, ^{Sintuprapa et al. (2000)} sugirieron que el mecanismo de captación de zinc, de ciertas especies de hongos filamentosos, es el intercambio intra y extracelular en forma de precipitación de polifosfatos. El zinc es esencial para todos los organismos, aunque a altas concentraciones puede volverse tóxico (^{Balsalobre et al., 2003}).

La fuente de cromo promovió el crecimiento del hongo en todas las concentraciones evaluadas. Se encontraron índices de tolerancia de 1.27 ± 0.06, 1.49 ± 0.06, 1.90 ± 0.03, 1.35 ± 0.01 y 1.30 ± 0.05 para 1, 5, 10, 15 y 20 mM de dicromato de potasio, respectivamente; es decir, A. niger es altamente resistente y la CMI es mayor de 20 mM. En este sentido se requieren más estudios para encontrar la concentración de cromo que inhibe el crecimiento de A. niger. Al respecto, ^{Ezzouhri et al. (2009)} utilizaron dicromato de potasio, como fuente de cromo, y observaron valores similares de CMI (20 mM < CMI < 25 mM) para especies de hongos como Penicillium sp. (S3S) y Fusarium sp. (S5S); mientras que para Penicillium sp. (S4W), Penicillium sp. (S5S), A. niger (S5W) y A. niger (S5S), los CMI fueron menores: 12.5 < CMI < 15, 15 < CMI < 20, 12.5 < CMI < 15 y 10 < CMI < 12.5, respectivamente. La detoxificación del cromo por A. niger puede ser mediada por un sistema enzimático antioxidante como peroxidasa, catalasa y peróxido ascorbato (^{Srivastava & Thakur, 2006}).

En general, el patrón de crecimiento del hongo sugiere el desarrollo de tolerancia y adaptación a la presencia de los metales evaluados. Con 1 mM de cada sal metálica, el crecimiento del hongo inició a las 24 h posteriores a la incubación, mientras que, a partir de 5 mM, el crecimiento del hongo inició a las 72 h, lo que implica un alargamiento de la fase de latencia. La Figura 6 ilustra los índices de tolerancia de A. niger a las distintas concentraciones evaluadas para cada metal, durante siete días de cultivo. Los metales más tóxicos para el hongo fueron plata, mercurio y cobre, ya que a partir de 10 mM de las sales metálicas no hubo crecimiento, seguidos por el Cd (15 mM). A 20 mM, el crecimiento del hongo solo se observó con las sales de plomo, zinc y cromo.

Figura 6 Índice de tolerancia de Aspergillus niger a 1, 5, 10, 15 y 20 mM de AgNO₃, CdCl₂, CuSO₄, HgCl₂, (CH₃COO)₂Pbx3H₂O, ZnSO₄x7H₂O y K₂Cr₂O₇, como fuente de los metales Ag, Cd, Cu, Hg, Pb, Zn y Cr, respectivamente, después de siete días de cultivo a 28 °C. Sobre las barras se representa la desviación estándar de la media. 

En este y otros estudios se ha observado que los hongos filamentosos toleran la presencia de metales tóxicos. Por ello, estos microorganismos se consideran excelentes candidatos para acumular metales en sus micelios y esporas e incluso reducir la toxicidad (^{Bennet, Wunch, & Faison, 2002}). La biosorción, captación intracelular y transferencia química son algunos de los mecanismos que los hongos utilizan para tolerar, acumular y transformar los metales tóxicos, aunque pueden variar según la especie (^{Chatterjee, Mukherjee, Sarkar, & Roy, 2012}; ^{Dixit et al., 2015}). La biosorción se basa en las interacciones entre los metales y las células (biomasa) vivas o no vivas de los microorganismos (^{Izkandar, Zainudin, & Tan, 2011}) e incluye intercambio iónico, quelación, adsorción, cristalización y precipitación, seguido por la difusión a través de la pared celular (^{Danesh et al., 2013}). En los hongos filamentosos, la pared está formada por quitina, quitosano, glucanos, proteínas, lípidos y otros polisacáridos. Esta composición le confiere a la pared celular un gran número y variedad de grupos funcionales o sitios, como una resina de intercambio iónico. Por otro lado, los mecanismos de transferencia o transformación química son reducción, metilación y dealquilación (^{Danesh et al., 2013}; ^{Gadd, 1993}). Con este último tipo de mecanismos, es importante considerar la posibilidad de que el producto resultante de la transformación, por acción de los microorganismos, resulte más tóxico que la forma inicial del metal; esto puede ocurrir con el plomo o el mercurio. En esta investigación no se revisó la producción de compuestos metilados de plomo y mercurio, pero se ha considerado hacerlo en estudios posteriores.