Preparación del sustrato e inoculación

El sustrato consistió en una mezcla de arena, corteza y suelo forestal en una proporción 2:2:1, el cual se esterilizó en tres ocasiones con vapor de agua a una presión de 1.3 kg · cm^-2 a 125 °C durante 5 h. Las semillas se sembraron en tubetes de plástico negro de 125 cm³ que contenían el sustrato descrito. Cada planta se inoculó con una concentración de 10⁷ a 10⁸ esporas de H. mesophaeum, determinada con un hematocitómetro. Se hicieron dos inoculaciones esporales del hongo: la primera simultáneamente con la siembra y la segunda 90 días después.

Cultivo de cepas bacterianas

La cepa bacteriana Cohnella sp., aislada de la raíz de P. montezumae, fue proporcionada por el Laboratorio de Microbiología del Colegio de Postgraduados, y Azospirillum brasilense Terrand Krieg et Dobereiner fue proporcionada por el Laboratorio de Microbiología de Suelos del Centro de Investigación en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Ambas especies fueron identificadas con técnicas moleculares de manera previa en dichos laboratorios. Las cepas se cultivaron en caldo nutritivo Merck® y se mantuvieron en movimiento constante a 28 °C hasta alcanzar una concentración de 10⁸ ufc·mL^-1. El cultivo bacteriano se centrifugó a 7 000 rpm y se eliminó el sobrenadante; el concentrado se lavó con agua destilada estéril, para eliminar los restos del medio de cultivo, y se resuspendió en agua destilada estéril para dejarlo a la misma concentración de 10⁸ ufc·mL^-1. Posteriormente, a los 10 días después de la segunda inoculación con el hongo ectomicorrízico, se efectuó una sola aplicación de 3 mL de la suspensión bacteriana a cada planta en las primeras horas del día. El experimento se mantuvo durante 420 días en un invernadero cerrado sin filtración de aire, control de temperatura ni fertilización adicional. Las condiciones ambientales durante el transcurso del experimento fueron: temperatura media anual 20 °C (9 y 31 °C, mínima y máxima, respectivamente), humedad media anual 47 % (23 y 81 % mínima y máxima, respectivamente) y fotoperiodo promedio anual de 11.9 h (10.9 y 13.1 h, mínimo y máximo, respectivamente).

Variables evaluadas

Diseño experimental y análisis estadístico

El experimento se diseñó en bloques al azar con seis tratamientos: 1) Plantas sin inocular; y plantas inoculadas con: 2) H. mesophaeum (Hm), 3) Cohnella sp. (C), 4) A. brasilense (Ab), 5) Hm + C, y 6) Hm + Ab. Cada tratamiento tuvo 21 réplicas, por lo que en total se tuvieron 126 unidades experimentales, cada una constituida por una planta. Los datos de las variables evaluadas se sometieron a un análisis de varianza y prueba de comparación de medias de Tukey (P = 0.05) con el paquete estadístico (^{Statistical Analysis System [SAS Institute Inc.], 2009}). Los valores de colonización micorrízica, expresados como porcentajes, se transformaron y se utilizó el logaritmo natural en los análisis de varianza.

Peso seco y diámetro del tallo de P. montezumae

El Cuadro 1 contiene la información del peso seco de las plantas de P. montezumae bajo los distintos tratamientos de inoculación. El peso seco de la raíz, parte aérea y total fue mayor en las plantas inoculadas con el hongo ectomicorrízico, solo o coinoculado con cualquiera de las dos bacterias, en comparación con el de las plantas sin inocular. Cuando se inoculó exclusivamente con cualquiera de las dos bacterias se tuvieron pesos secos estadísticamente similares (P = 0.05) a los pesos de las plantas no inoculadas. En el caso del peso seco de la raíz existió un efecto sinérgico cuando se inoculó Hm + Ab; en este tratamiento, el peso fue hasta 6.4 veces mayor en comparación con las plantas sin inocular.

Con respecto al diámetro del tallo, en la Figura 1 se observa que dicha variable incrementó en mayor medida en las plantas inoculadas tanto con Hm como en las plantas con Hm + C y Hm + Ab a los 30, 120 y 420 ddib. La inoculación con cualquiera de las dos bacterias no originó diferencias del diámetro del tallo en comparación con las plantas sin inocular.

Figura 1 Diámetro del tallo de plantas de Pinus montezumae bajo distintos tratamientos de inoculación con un hongo ectomicorrízico comestible y dos bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Psi = plantas sin inocular; Hm = Hebeloma mesophaeum, C = Cohnella sp., Ab = Azospirillum brasilense. Sobre las barras se representa el error estándar de la media (n = 7). Valores con la misma letra para cada fecha son iguales según la prueba de Tukey (P = 0.05). 

El estímulo en el crecimiento, atribuible a la inoculación con hongos ectomicorrízicos, ha sido ampliamente reportado para el género Pinus. ^{Gómez-Romero, Lindig-Cisneros, y Del Val (2015)} demostraron que Pinus pseudostrobus Lindl. incrementó la biomasa aérea y radical cuando se inoculó con Pisolithus tinctorius Pers. ^{Perea-Estrada et al. (2009)} registraron aumento en la altura, peso seco de raíz y diámetro de plantas de Pinus patula Schl. et Cham. y Pinus hartwegii Lindl. inoculadas con Hebeloma spp., Laccaria spp. y Clavulina aff. cinerea. De igual forma, ^{Sebastiana, Tolentino, Alcantara, Salomé, y Bernardes (2013)} registraron que el peso seco de plantas de Quercus suber L., inoculadas con P. tinctorius, incrementó 40 % en comparación con las plantas sin inocular. La presente investigación es la primera que evalúa el efecto de la coinoculación de hongos ectomicorrízicos y bacterias sobre el crecimiento y fisiología en P. montezumae. El sinergismo registrado debido a la coinoculación de hongos ectomicorrízicos y bacterias también se ha reportado previamente. Por ejemplo, ^{Kataoka y Futai (2009)} reportaron el incremento de biomasa en la raíz de Pinus thumbergii Parl. coinoculado con Suillus granulatus L. y Burkholderia sp. Por otra parte, ^{Zhao, Xiao-Qin, Jian-Ren, Hao, y Gui-E (2014)} demostraron que la coinoculación con la bacteria Bacillus sp. y los hongos P. tinctorius y Lactarius insulsus (Fr.) Fr. (cuyo nombre válido actualmente es L. zonarius [Bull.] Fr.) incrementó el crecimiento y la colonización ectomicorrízica de árboles de Populus deltoides Marsh.

Tasa fotosintética de P. montezumae

De acuerdo con el Cuadro 2, las diferencias en la tasa fotosintética de las plantas inoculadas y no inoculadas se observaron a partir de los 300 ddib; los valores más altos se registraron en las plantas inoculadas con Hm, Hm + C y Hm + Ab. La tasa fotosintética a los 360 ddib fue 3.7 y 4.0 veces mayor en las plantas inoculadas con Hm + C y Hm + Ab, respectivamente, en comparación con las plantas sin inocular. Conforme el tiempo transcurrió, la tasa fotosintética incrementó en todos los tratamientos, particularmente en Hm + Ab; en este caso, la tasa fotosintética a los 360 ddib fue 2.6 veces mayor que a los 240 días. A los 300 y 360 ddib, no se observaron diferencias entre las plantas inoculadas únicamente con bacterias y las no inoculadas. Esta es la primera ocasión que se evalúa la tasa fotosintética en plantas de P. montezumae coinoculadas con hongos ectomicorrízicos y bacterias.

El incremento en la tasa fotosintética debido a la inoculación exclusivamente con hongos micorrízicos ya ha sido reportado; sin embargo, a la fecha, no se había investigado el efecto de la coinoculación con bacterias. ^{Canton et al. (2016)} indicaron que la inoculación de P. tinctorius en E. grandis originó mayores tasas fotosintéticas que en las plantas no inoculadas. ^{Xu et al. (2015)} mencionaron que el hongo ectomicorrízico Laccaria bicolor Maire inoculado en Picea glauca (Moench) Voss no solo incrementa la tasa fotosintética, sino que también origina una mayor transpiración.

Contenido de clorofilas y carotenos de P. montezumae

El contenido de clorofilas a y b, clorofilas totales y carotenos fue mayor (P = 0.05) en las plantas inoculadas, independientemente del tratamiento. Las plantas inoculadas con Hm tuvieron mayor contenido de clorofila a en comparación con las plantas sin inocular, lo cual no ocurrió en el caso de los contenidos de clorofila b, clorofilas totales y carotenos (Cuadro 3). ^{Yin, Deng, Chet, y Song (2014)} indicaron que los contenidos de clorofila a y b, y carotenos incrementaron en plantas de Pinus sylvestris L. inoculadas con S. luteus (L. ex Fr.) Gray.

En el presente trabajo, la concentración de carotenos fue mayor cuando las bacterias se inocularon solas o en combinación con el hongo Hm. Este incremento coincide con lo reportado por ^{Mrnka, Tokárová, Vosátka, y Matejka (2009)}, quienes inocularon Hebeloma bryogenes Vesterh. y Cadophora finlandica C. J. K. Wang et H. E. Wilcox. en Picea abies L.

Micorrización de P. montezumae

La Figura 2 muestra las estructuras diagnósticas de la ectomicorriza. Los tratamientos Hm, Hm + Ab y Hm + C produjeron los porcentajes más altos de raíces vivas micorrizadas; 76.1, 76.4 y 68.7 %, respectivamente (Cuadro 4).

Figura 2 Características generales de las ectomicorrizas de Hebeloma mesophaeum (Hm). a) Vista general de morfotipos de Hm mostrando micelio externo abundante de color blanquecino a crema; b) Morfotipo de Hm con Azopirillum brasilense mostrando el micelio externo que cubre la totalidad de la ectomicorriza; c) Morfotipo de Hm + Ab, de la cual se le ha retirado el micelio externo; d) Corte transversal: red de Hartig (rh), manto (m) y micelio externo (me). 

Los valores de micorrización en este trabajo son similares a los reportados por ^{Méndez-Neri, Pérez-Moreno, Quintero, Hernández, y Lara (2011)}, quienes determinaron 77 % de colonización en Pinus greggii Engelm. inoculado con H. mesophaeum, Laccaria laccata Scop. y Suillus aff. pseudobrevipes A. H. Sm. Dichos autores utilizaron las mismas concentraciones de esporas y método de inoculación que los empleados en la presente investigación. Por otra parte, ^{Sanchez-Zabala et al. (2013)} registraron menos de 30 % de colonización en plantas de Pinus pinaster Aiton inoculadas con Lactarius deliciosus L., Lactarius quieticolor Romagn., Pisolithus arhizus Scop. y S. luteus.

Contenido de N, P y K en P. montezumae

El Cuadro 5 muestra el contenido de nutrientes en las plantas de P. montezumae con los distintos tratamientos de inoculación. Cuando se inoculó Hm solo o coinoculado con cualquiera de las dos bacterias existió mayor cantidad de N en la parte aérea, raíz y total, en comparación con las plantas no inoculadas. Cuando se inoculó exclusivamente con cualquiera de las dos bacterias, no existieron diferencias en la cantidad de N, P y K en comparación con las plantas no inoculadas, independientemente de la parte de la planta. El mejor tratamiento en el caso del N se registró en las plantas inoculadas con Hm + Ab, mientras que en el caso de P y K estuvo constituido por el hongo ectomicorrízico solo o coinoculado con cualquiera de las dos bacterias. Se observó un efecto sinérgico del tratamiento Hm + Ab sobre la cantidad de N en la parte aérea y total.

La importancia de la adquisición de N, P y K en plantas micorrizadas ha sido demostrada y estudiada (^{Smith & Read, 2008}). Por ejemplo, recientemente: i) ^{Kayama, Qu, y Koike (2015)} indicaron que la presencia de hongos ectomicorrízicos estimuló el incremento de N de plantas Larix kaempferi Lamb.; ii) ^{Zong et al. (2015)} registraron un incremento de P significativamente mayor en Pinus densiflora Siebold y Zucc. y Quercus variabilis Blume. inoculados con Pisolithus sp., Cenococcum geophilum Fr. y L. laccata que en las plantas no inoculadas; y iii) ^{Martínez-Reyes et al. (2012)} reportaron el efecto positivo en la translocación de K en plantas de P. greggii inoculadas con H. mesophaeum.

En el presente trabajo, el hongo Hm y la bacteria Ab mostraron un efecto de sinergismo reflejado en el contenido de N aéreo y total. ^{Xiao-Qin et al. (2012)} también reportaron que la colonización ectomicorrízica, el crecimiento y la movilización de N, P y K incrementaron en las plantas de P. thunbergii Parl. inoculadas con el hongo ectomicorrízico Boletus edulis Rostk. y la bacteria Bacillus cereus Franklan, en comparación con las plantas no inoculadas.