Introducción

La diarrea, continua siendo un importante problema de salud en el mundo (^{Thakur et al., 2018}), particularmente en los países en vías de desarrollo y en niños menores de 5 años y adultos mayores. Su etiología puede ser viral, bacteriana o parasitaria. Los virus representan del 70 al 90 % de los casos de diarrea en niños; y de 10 a 20 % las bacterias como Salmonella, Shigella, Campylobacter, Escherichia coli enteroxigénica y menos frecuente Escherichia coli enteroinvasiva. Respecto a los parásitos Giardia lamblia, Entamoeba histolytica y Cryptosporidium spp respresentan menos del 5 % de los casos (^{Flores, 2020}). Entre las bacterias asociadas con la diarrea están los diferentes patotipos de Escherichia coli (E. coli), las cuales colonizan el intestino del ser humano, pueden transmitirse directamente de persona a persona, de animal a persona o indirectamente a través del agua o los alimentos contaminados (^{Sperandio & Nguyen, 2012}). Según su patogénesis y sus características epidemiológicas, este grupo de bacterias se clasifica en seis patotipos: E. coli enteropatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC), enteroagregativa (EAEC), difusamente adherente (DAEC) y la enterohemorrágica (EHEC), tanto la productora de toxina Shiga (STEC), como la productora de toxina Vero (VTEC) (^{Kaper et al., 2004}). El Centro de Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC, siglas en inglés) en su reporte semanal de morbilidad y mortalidad publicó que ETEC se ha relacionado con diversos brotes asociados a los alimentos y agua en países desarrollados y subdesarrollados (^{CDC, 1994}; ^{FDA, 2011}). Debido a que E. coli O157:H7 se encuentra frecuentemente en materia fecal de ganado bovino, ésta es una de las principales fuentes de contaminación hacia la carne de res o sus derivados; por deficiencias sanitarias durante el faenado, matanza y eviscerado para la obtención de la canal (^{Stanley et al., 2017}). El consumo de carne molida de bovino mal cocida y contaminada con EHEC ha sido causa de diarrea sanguinolenta que puede evolucionar hasta síndrome urémico hemolítico (HUS) (^{Surendran-Nair, 2017}). La canal de res y sus cortes derivados se han reportado como la fuente de infección en muchos brotes causados por EHEC (^{Barham et al, 2002}). El primer brote documentado en Estados Unidos de América (USA) fue en 1982, el cual, estuvo asociado a carne molida de res, que hasta la actualidad permanece como el vehículo más común entre los brotes de enfermedad provocados por patotipos de E. coli (^{Rangel et al., 2005}). El serotipo O157:H7 es el principal causante de brotes asociados a E. coli en USA (^{Karmali et al., 2010}).

La carne de bovino se ha visto implicada en brotes por EHEC alrededor del mundo, y en México es uno de los alimentos contemplados en la canasta básica (^{Kiranmayi et al., 2010}; ^{INEGI, 2018}), razón por la cual es importante evidenciar la presencia potencial de los diferentes patotipos de E. coli en el alimento. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue aislar e identificar patotipos de E. coli en carne molida de bovino, que se expenden en carnicerías en Guadalajara, Jalisco.

Material y Métodos

Determinación de patotipos por PCR

Las cepas recuperadas por ambas rutas de aislamiento y una cepa control de cada patotipo se sometieron a la extracción de DNA, empleando el protocolo propuesto por ^{Feng y Monday (2000)}. Se evaluó la calidad del DNA por observación en un gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio y se obtuvo la concentración por espectrofotometría. Así mismo, se determinó la relación DNA/proteínas, para evaluar su calidad. Se realizaron curvas de calibración de cloruro de magnesio para cada una de las tres reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) que se utilizaron en este estudio, empleando DNA de las cepas control (Figura 1). En la Tabla 3, se muestran las condiciones y componentes óptimos para cada una de ellas.

Curva de concentración de MgCl₂ para la optimizaciòn de la PCR.

Figura 1 Amplificados de PCR multiplex de la cepas de referencia. 

Tabla 3 Condiciones y componentes estandarizados para las reacciones de PCR. 

Protocol stage and conditions	McDaniels et al. (1996)	Toma et al. (2003)	Fratamico et al. (2000)
Preheating	94 °C 1 min	94 °C 2 min	94 °C 1 min
Desnaturalización	94 °C 20 s	94 °C 20 s	58 °C 1 s
Alignment	55 °C 1 min	58 °C 1 min	55 °C 1 min
Extension	72 °C 1 min	72 °C 1 min	72 °C 1 min
Final extension	72 °C 10 min	72 °C 10 min	72 °C 7 min
Components of the reaction mixture	Polymerase buffer 1.25X MgCl2 2.5 mM dNTPs mix 0.2 mM Of each primer Forward and Reverse gadA/B 0.5 mM Taq Polymerase 2.5 U	Polymerase buffer 1 X MgCl2 1.5 mM dNTPs mix 0.2 mM Of each primer Forward and Reverse 0.5 mM AL 65 0.25 mM SK1 0.25 mM ipaIII 0.25 mM LTL 0.25 mM est 0.25 mM ipaH 0.25 mM aggR Taq Polymerase 2.5 U	Polymerase buffer 1X MgCl2 3.0 mM dNTPs mix 0.4 mM Of each primer Forward and Reverse 0.5 mM de stx1, stx2 y hly933 except 0.25 mM by eaeA Taq Polymerase 2.5 U
50 ng of DNA contained in:	5 µL	5 µL	5 µL
Reaction volume:	50 µL	50 µL	50 µL

* Reactions were carried out in a Thermal Cycler (Techne®, Bibby Scientific Ltd, U.K.).

Las cepas sospechosas para E. coli obtenidas por ambas rutas del protocolo propuesto por la ^{FDA (2011)}, se sometieron a la PCR propuesta por ^{McDaniels et al. (1996)}, para la detección del gen gadA/B, que codifica para glutamato descarboxilasa, la cual se utiliza en la confirmación de E. coli (Figura 2). Las cepas gadA/B positivas se identificaron por el protocolo propuesto por ^{Toma et al. (2003)}, para identificar determinantes genéticos propios de EIEC, EPEC, ETEC, EHEC y EAEC. El procedimiento consiste en la detección de productos de PCR específicos para cada patotipo, mediante una reacción de PCR multiplex. De igual forma, las cepas que fueron confirmadas por el protocolo de ^{McDaniels et al. (1996)}, se sometieron a PCR multiplex para EHEC propuesta por ^{Fratamico et al. (2000)}; la cual permite amplificar cuatro factores de virulencia para este patotipo (Figura 3). Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla 4.

Figura 2 Gel representativo que muestra la amplificación el gen gadA/B en Escherichia coli enteroxigénica (Control Positivo, CP) y algunas cepas (línea 1 a 8). 

Figura 3 Gel que muestra los aplificados de PCR para Escherichia coli enterohemorragica ATCC 46597, Escherichia coli enterohemorragica ATCC 43895 y Escherichia coli enterohemorragica ATCC 25922. 

Tabla 4 Oligonucleótidos utilizados en los protocolos para las PCR. 

Oligonu-cleotides	Sequence ( 5’ to 3’)	Target gene	Product Size (bp)	Encoding protein	Genus and species or patotype that it detects	Source
gadAB F	ACCTGCGTTGCGTAAATA	gadA/B	670	Glutamate decarboxylase	E. coli	McDaniels et al. (1996)
gadAB R	GGGCGGGAGAAGTTGATG
AL65	TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG	est	147	Thermostable enterotoxin	ETEC	Hornes et al. (1991)
AL125	CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
LTL	TCTCTATGTGCATACGGAGC	elt	322	Thermostable enterotoxin	ETEC	Tamanai - Shacoori et al. (1994)
LTR	CCATACTGATTGCCGCAAT
ipaIII	GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC	ipaH	619	H antigen invasion plasmid	EIEC	Sethabutr et al. (1993)
ipaIV	GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
aggRksl	GTATACACAAAAGAAGGAAGC	AggR	254	Transcriptional activator for AAT / I expression	EAEC	Ratchtrachenchai et al. (1997)
aggRkas2	ACAGAATCGTCAGCATCAGC
SLTI-F	TGTAACTTGAAAGGTGGAGTATACA	stxl	210	Shiga toxin Type 1	EHEC	Meng et al. (1997)
SLTI-R	GCTATTCTGAGTCAACGAAAAATAAC
SLTII-F	GTTTTTCTTCGGTATCCTATTCC	stx2	484	Shiga toxin Type 2	EHEC	Meng et al. (1997)
SLTII-R	GATGCATCTCTGGTCATTGTATTAC
AE22	ATTACCATCCACACAGACGGT	eaeA	397	Intimate	E P E C , EHEC	Fratamico et al. (1995)
AE20-2	ACAGCGTGGTTGGATCAACCT
MFSI-F	ACGATGTGGTTTATTCTGGA	hly933	166	Hemolysin (hlyA)	E P E C, EHEC	Fratamico & Strobaugh (1998)
MFSI-R	CTTCACGTCACCATACATAT

Los cinco patotipos se analizaron comparando los tamaños de los productos de PCR de las muestras con los de las cepas control.

Resultados y Discusión

Los 76 aislamientos se obtuvieron de 15 de las 100 muestras analizadas, de las cuales 25 fueron aisladas por el método para EHEC propuesto por la ^{FDA (2011)} y 51 cepas por el método para los otros patotipos.

Un total de 55 cepas (72.36 %) de las 76 aisladas, amplificaron para el gen gadA/B, las cuales fueron sometidas a PCR-multiplex para la detección de los factores de virulencia para EHEC y del resto de los patotipos de E. coli. Se encontró que el 7.27 % (4/55) de las cepas amplificaron para el gen aggR de 254 pb, que codifica para el activador transcripcional para la expresión de AAT/I de EAEC, y que el 41.81 % (23/55) amplificó el gen elt de 322 pb que codifica para enterotoxina termolábil de ETEC. No se identificaron productos de PCR para EPEC y EIEC. Por otro lado, de las 55 cepas de E. coli confirmadas y que fueron probadas por la PCR-multiplex para EHEC ninguna mostró productos de PCR que codificaran para los factores de virulencia de este patotipo.

En relación con la amplificación de los factores de virulencia para EHEC, la cepa control utilizada amplificó para la toxina Shiga tipo 1 y toxina Shiga tipo 2 (stx2) , cabe resaltar que este protocolo ya había sido probado por ^{Varela-Hernández et al. (2007)}, encontrando que la concentración óptima para la amplificación de estos factores de virulencia es de 3.0 mM de MgCl₂.

Una vez realizado un análisis de la PCR por los diferentes protocolos de PCR para E. coli patógena, se revisó de que muestras provenían las cepas positivas.

En la Tabla 5 se muestran los resultados de frecuencia y los factores de virulencia amplificados por patotipo.

La asociación de los resultados de la identificación de patotipos con respecto a los meses de recolección y análisis de las muestras, se muestran en la Tabla 1. Cabe mencionar que a nivel nacional existen pocos estudios de este tipo. El 15 % (15/100) de las muestras fueron positivas para algún patotipo de E. coli, todas ellas fueron detectadas en los meses cálidos en la ciudad de Guadalajara, Jalisco, coincidentemente con ^{Varela-Hernández et al. (2007)} y ^{Cagney et al. (2004)}, que reportaron un comportamiento estacional, en investigaciones de prevalencia en carne fresca mínimamente procesada de bovino, donde encontraron que la probabilidad de aislar EHEC era mayor en las estaciones primavera-verano que en otoño-invierno.

^{Villaseca et al. (2005)} describieron algunos brotes asociados con E. coli patogénica registrados en hospitales de países de Centroamérica, sin embargo, no se hizo referencia al vehículo de la infección de los pacientes, se declaró una mayor frecuencia de pacientes infectados por el patógeno, que ingresan a los hospitales durante los meses cálidos (abril a junio). Dato que coincide con la frecuencia de patotipos de E. coli, según mes de muestreo, encontrado en el presente estudio.

Particularmente en esta zona del occidente de México, coincidió que en el mes de mayo, se observó la mayor temperatura promedio anual que fue de 33 ± 2.1°C, con la mayor frecuencia de aislamiento de patotipos de E. coli (^{CLIMATE-DATA, 2019}). Esté dato es importante considerarlo debido a que en las carnicerías del país se expone la carne al púbico a temperatura ambiente.

^{Barlow et al. (2006)} recolectaron 285 muestras de carne molida de bovino en 10 ocasiones de 31 carnicerías durante un año en Australia; de las cuales el 16 % (46/285) fueron presuntivas para EHEC mediante la utilización del método ^{FDA (2011)}, frecuencia similar a la encontrada en el presente estudio (15 %); aunque en este estudio se colectó una sola muestra por expendio. ^{Barlow et al. (2006)} aislaron 63 cepas STEC de las cuales el 5 % (3/63) codificaron para stx1, 55 % (35/63) para stx2 y el 65 % (41/63) para intimina, en contraste con el presente estudio en el que de un total de 25 cepas presuntivas de EHEC, ninguna amplificó para algún factor de virulencia en específico de los probados.

Por otro lado, ^{Etcheverría et al. (2010)} detectaron positividad de STEC, de entre el 12.34 % y 18.64 % en muestras aisladas de canales en cabinas de control sanitario de rastros de Argentina y 24.5 % en carne proveniente de carnicerías; lo que contrasta con el 15 % de los dos patotipos encontrados en el presente estudio. Asi mismo, ^{Cagney et al. (2004)}, en la República de Irlanda, en un estudio con similares características al nuestro encontraron que en 140 muestras de carne molida obtenida de expendios, no detectaron EHEC, lo que coincide con nuestros resultados. En este contexto, es necesario implementar medidas de higiene y programas de sanidad que garanticen la inocuidad de la carne desde su obtención, su transporte y almacenamiento en el expendio, que eviten o minimicen la contaminación cruzada y el crecimiento de estos microorganismos, no eximiendo la eliminación térmica del patógeno durante la cocción del alimento.

Conclusión

Existe evidencia que el 15 % de la carne molida de bovino que se expende en carnicerias de Guadalajara, Jalisco se encuentra contaminada por Escherichia coli patógena, lo que implica un riesgo potencial para los consumidores.